Nitrogen dalam tubuh terdapat dalam bentuk :

1. Senyawa protein
2. Senyawa non-protein :
 Asam urat
 Urea
 Kreatinin
Senyawa nitrogen non-protein ini
merupakan hasil akhir metabolisme protein
yang secara normal diekskresi melalui ginjal
Metode analisis asam urat terdiri dari :
1. Metode kolorimetri
2. Metode enzimatik
3. Metode kromatografi
 Lebih dikenal dengan nama metode asam
fosfotungstat. Asam fosfotungstat adalah
oksidator yang digunakan untuk mengoksidasi
asam urat (pertama digunakan pd tahun 1912).
 Prinsip reaksi :
Oksidasi asam urat menjadi allantoin dan CO2
dengan reduksi asam fosfotungstat menjadi
tungsten blue (max = 700nm) dalam suasana
basa (Na2CO3)
as.urat + as.fosfotungstat  allantoin + CO2 + tungsten blue
 Tahap awal dilakukan deproteinisasi dan isolasi
asam urat dari filtrat sebagai garam perak
 Metode digunakan scr luas tapi non-spesifik
karena hasil pengukuran dapat terganggu oleh
komponen lain dalam darah spt : derivat xantin
(teofilin, kafein), senyawa pereduksi (vit C, asam
salisilat, sistein, aspirin), bilirubin, atau hemolisis.
 Untuk meningkatkan spesifisitas dapat dilakukan
adsorpsi asam urat pada kolom penukar ion,
penambahan N-etilmaleimid untuk
menginaktivasi pengganggu seperti kromogen yg
mengandung gugus sulfhidril
 Asam urat yg diisolasi dari filtrat dapat berbentuk garam
magnesium, amonium, kuprous (cuprous), atau kuprat
(cupric).
 Untuk meningkatkan sensitivitas digunakan : sianida
(mencegah penguraian warna biru) dan melarutkan
garam perak nitrat; urea-sianida sebagai pembasa.
 Deproteinisasi/penghilangan protein menggunakan :
asam trikloroasetat, asam tungstat, asam fosfotungstat,
koagulasi dgn panas, atau filtrasi membran.
 Oksidator yg digunakan : asam arsenotungstat, asam
arsenofosfotungstat, asam arsenomolibdat, K-
ferisianida, ion cuprat atau uranil asetat
 Metode enzimatik ini menggunakan enzim
urikase (urat oksidase) sebagai enzim pada
reaksi utama yang mengoksidasi asam urat
menjadi allantoin dan H2O2.
 Metode ini lebih tinggi spesifisitasnya
dibanding metode fosfotungstat
 Prinsip reaksi :
urikase
Asam urat + H2O + O2 allantoin + CO2 + H2O2
 Untuk menentukan kadar asam urat dalam
sampel yang teroksidasi oleh enzim urikase,
dapat dilakukan berbagai reaksi indikasi,
yaitu :
 Absorpsi diferensial
 Kolorimetri
 Polarografi
 Coulometri
 Pada absorpsi diferensial dilakukan
pengukuran spektrum UV asam urat pada =
290-293 nm, dimana allantoin tidak mmlk
puncak absorpsi. Pengukuran absorban pd 
ini sebelum dan sesudah inkubasi asam urat
dgn urikase dpt menentukan jumlah asam
urat sampel.
 Mengukur absorban dari senyawa kromogen
yg terbentuk dari reaksi H2O2 dgn senyawa
spt o-dianisidin, 3-metil-2-benzotiazolinon,
atau N,N-dimetilanilin dgn katalis
peroksidase membentuk biru indamin yg
mmlk  max = 600 nm
- H2O2 juga bereaksi dengan 4-aminofenazon dan
asam 3,5-dikloro-2-hidroksibenzen-sulfonat
membentuk quinonimin yang berwarna dan diukur pd
 = 520 nm.
- 2,4,6-tribromofenol juga telah digunakan dalam
reaksi antara H2O2 dengan 4-aminofenazon dgn  =
492 nm.
- Juga reaksi antara H2O2 dgn metanol membentuk
formaldehid, yg kemudian direaksikan dengan
asetilaseton dan amonia membentuk senyawa
berwarna kuning pd  410 nm
 Mengukur laju konsumsi oksigen dengan alat
polarografi dengan sensor oksigen, yg
ekuivalen dengan laju oksidasi asam urat oleh
urikase
 Metode coulometri dengan mengukur total
senyawa pereduksi yang dihasilkan oleh
titrasi coulometri dengan iodine sebelum dan
sesudah reaksi asam urat dengan urikase.
Perbedaan keduanya menunjukkan kadar
asam urat dalam sampel
 Beberapa prosedur HPLC untuk menentukan
kadar asam urat dalam sampel serum dan
urin
 Metode ini menggunakan reversed-phase
chromatography dgn detektor
spektrofotometer pd  280 atau 235 nm
atau pemisahan dengan penukar ion diikuti
dgn deteksi amperometri menggunakan
thin-layer flowtrough electrochemical cell.
 Glukosa dalam tubuh terdapat dalam dua
bentuk yaitu glukosa bebas dan glukosa
terikat protein
 Glukosa terikat protein terdiri dari
glikohaemoglobin dan fruktosamin.
Glikohaemoglobin (HbA1a, HbA1b, HbA1c)
adalah suatu ketosamin yang terbentuk secara
fisiologis dalam tubuh dari glukosa dan
haemoglobin (Hb) dimana fraksi terbesar ada
dlm bentuk HbA1c. Sementara fruktosamin
(glukoalbumin) terbentuk secara fisiologis dari
glukosa dan albumin
 Glikoprotein dapat diukur kadarnya dengan HPLC,
elektroforesis, maupun kromatografi afinitas.
 Glukosa bebas ditentukan kadarnya dengan metode kimia
dan enzimatik
 Untuk penentuan kadar glukosa bebas, metode enzimatik
adalah metode yang paling banyak digunakan saat ini
karena spesifisitasnya dan sensitivitasnya.
 Spesimen darah, urin, CSF, dan lainnya harus diperiksa
secepatnya atau dicampur dgn inhibitor glikolisis. Metabolisme
in vitro glukosa oleh komponen seluler darah akan
mengakibatkan false negatif karena sebagian glukosa telah
terurai. Dapat juga digunakan tabung yg mengandung fluorida
atau iodoasetat (keduanya adalah inhibitor glikolisis) dgn
antikoagulan.
1. Metode kimia :
- Reduktometri
- Furfural
2. Metode enzimatik
- GOD (glukosa oksidase)
- GDH (glukosa dehidrogenase)
- Heksokinase
 Metode kimia ini terdiri dari dua metode
yaitu reduktometri dan furfural
 Reaksi ini dapat dilanjutkan dengan reaksi
indikasi untuk pengukuran secara
kuantitatif dengan spektrofotometri UV-
vis, kolorimetri, atau titrasi biasa
 Reaksi ini didasarkan atas sifat gula yang
dapat mereduksi bbrp oksidator kimia
 Secara struktural glukosa terdapat dlm
kesetimbangan antara bentuk keto dan
enol. Reaksi harus diarahkan spy glukosa
ada dlm bentuk enol karena akan lebih
mudah dioksidasi. Hal ini dilakukan dgn
memperbanyak gugus –OH (pembasaan)
 Metode ini tidak spesifik karena banyak
diganggu oleh pereduksi lain yg ada dlm
spesimen spt asam askorbat, asam urat,
glutation, kreatin, kreatinin, dan bbrp
amina
 Untuk menghilangkan senyawa
pengganggu dilakukan pemisahan
dengan deproteinisasi dan kopresipitasi.
Nelson-Somogyi menggunakan ZnSO4 dan
Ba(OH)2 untuk mengkopresipitasi dan
deproteinisasi shg spesifisitas reaksi
meningkat.
 Reaksi indikasi dapat menggunakan
ferrisianat (ferri), iodomerkurat (merkuri),
atau Cu(II)
 Reaksi menggunakan ferrisianat
menghasilkan senyawa ferri ferrosianat yg
berwarna “biru prusia” yg diukur intensitas
warnanya dengan spktrofotometri Vis.
 Reaksi menggunakan garam Cu2+ yg
larut dalam basa, kemudian dioksidasi
oleh asam fosfomolibdat membentuk
senyawa berwarna biru yaitu molibden
yg dapat diukur intensitas warnanya
dengan fotometri.
 Selain dengan asam fosomolibdat, dapat
digunakan pula arsenomolibdat atau
neocuprine (2,9-dimetil-1,10-fenantrolin)
membentuk senyawa berwarna kuning
jingga
 Gula jika berada dalam larutan asam kuat akan
mengalami dehidratasi membentuk turunan furfural
H+
 Glukosa hidroksimetilfurfural
 Furfural dapat bereaksi dengan fenol atau amina
aromatik membentuk senyawa berwarna yang
dapat diukur secara kolorimetri. Fenol atau amin
aromatik yg biasa digunakan : antron, anilin, atau o-toluidin
 Uap asam pekat sebagai pereaksi dapat
mengganggu dan membahayakan analis, selain
merusak alat. Pada reaksi dengan antron digunakan
H2SO4, sedangkan dgn o-toluidin atau anilin
digunakan CH3COOH
 Contoh : untuk reaksi glukosa dengan o-toluidin.
Sampel dilarutkan dalam asam asetat pekat
membentuk aldoheksosa, lalu direaksikan lagi
dengan o-toluidin membentuk senyawa
berwarna hijau. Hanya aldoheksosa yg bereaksi
dengan o-toluidin. Yang memiliki struktur
aldoheksosa adalah glukosa dan galaktosa, shg
galaktosa bisa menjadi pengganggu.
Tetapi krn jumlah galaktosa sangat sedikit
dibanding kadar glukosa maka pengaruh
galaktosa bisa diabaikan.
Metode ini cukup spesifik, kelemahan hanya
pada penggunaan yg merusak alat dan
berbahaya selain o-toluidin sendiri bersiat
karsinogenik
 Ada tiga macam enzim yang dapat
digunakan untuk penentuan kadar glukosa
ini, yaitu enzim GOD, GDH, dan
heksokinase.

 Enzim diperoleh melalui teknik DNA

rekombinan, dengan mencangkokkan gen
penghasil enzim ke dalam bakteri.
 Dipakai dua tahap reaksi yang spesifik untuk
D-glukosa
 Selain enzim GOD, digunakan pula enzim
peroksidase (POD) untuk reaksi indikasi
 Pereaksi warna pada reaksi indikasi dapat
menggunakan guayakol, o-anisidin, o-toluidin,
o-dianisidin, tetrametilbenzidin (TMB), atau 4-
aminofenazon
GOD
D-glukosa + H2O + O2  asam glukonat + H2O2

POD
H2O2 + DH2 (pereaksi warna)  2H2O + D (seny.berwarna)
 Reaksi Trinder dikenal untuk penggunaan 4-
aminofenazon (antipirin) dan fenol sebagai
pereaksi indikasi yang akan menghasilkan
senyawa quinonimin yang berwarna merah
muda, dimana intensitas warna sebanding
dengan jumlah peroksida juga sebanding
dengsn kadar glukosa dalam sampel.
 Reaksi penentuan kadar glukosa
menggunakan enzim GDH ini spesifik untuk
D-glukosa, tidak terganggu oleh senyawa
pereduksi lain.
 Reaksi berjalan dengan adanya koenzim
NAD+

GDH
D-glukosa + NAD+  D-glukonolakton + NADH + H+
 Reaksi enzimatik menggunakan heksokinase
adalah metode yang paling baru dan modern.
 Terdiri dari dua reaksi dimana reaksi 1 tidak
spesifik tetapi reaksi 2 sangat spesifik hanya
untuk glukosa-6-fosfat. Dalam kondisi pereaksi
dijamin murni, dapat dikatakan hasil benar-
benar glukosa yang terukur
 Jika sampel darah mengalami hemolisis, eritrosit
yg pecah akan mengeluarkan glukosa-6-
fosfatdehidrogenase yg akan mengganggu
aktivitas G-6-PDH pada reaksi 2
 Heksokinase
Glukosa + ATP  glukosa-6-fosfat + ADP ……
(1)

G-6-PDH
Glukosa-6-P + NADP+  Glukosa-6-glukonat + NADP + H + ..(2)
 Lipid adalah segolongan besar senyawa tak
larut air yg tdp di alam, cenderung larut dlm
pelarut organik spt eter dan kloroform.
 Lipid yg terdapat dlm plasma tdd
trigliserida, fosfolipid, asam lemak, dan
kolesterol.
 Trigliserida (TG) adalah triester asam lemak
berantai panjang (C12-C24) dan gliserol,
termasuk lipid sederhana dan bentuk
cadangan lemak dlm tubuh manusia
 Kolesterol adalah senyawa yg memiliki inti
steroid yg tak larut air tapi larut pelarut
organik, mrpk komponen membran sel
manusia, dan prazat pembentukan hormon
adrenal dan garam empedu.
 Lipoprotein adalah suatu komplek molekul dari
lemak dan protein yg beredar dalam darah.
Makromolekul ini berbentuk bola dan bagian
dalamnya tdd lemak netral spt TG dan kolesterol
ester, dikelilingi oleh bag permukaan yg lebih
bersifat polar tdd apoprotein, fosfolipid dan
kolesterol bebas. Komponen polar ini yg
menyebabkan lipoprotein dapat larut dlm air
 Untuk mendeteksi adanya gangguan
metabolisme lemak, parameter utama yg
ditentukan adalah TG dan kolesterol, shg berikut
ini dibahas metode analisis untuk keduanya
 Sterol adalah sekelompok lipid yang
dijumpai pada hewan maupun tumbuhan
yang mengandung gugus hidroksil
 Kolesterol adalah sterol yg terdapat pd sel
hewan, termasuk manusia, tidak pada
tumbuhan
 Kolesterol dalam sistem fisiologi manusia
terdiri atas 5-kolesterol yg mrpk fraksi
terbanyak, 5--kolesterol, (1-3%), 7-
kolesterol (1%) dan 7-dehidrokolesterol (2-
10% dari kolesterol serum)
 Metode analisis kolesterol : metode
kolorimetri dan metode enzimatik
a. Reaksi Liebermann-Burchard
Pembentukan warna hijau dengan anhidrida
asam asetat pada suasana H2SO4 pekat dgn
syarat bebas air. Adanya air akan menurunkan
intensitas warna hijau yg terbentuk. Intensitas
warna diukur pada = 620 nm. Reaksi ini kurang
disukai karena dapat merusak alat
b. Reaksi Zak
Pembentukan warna merah dengan asam
asetat, FeCl3 dan H2SO4.
Kedua reaksi ini dipengaruhi oleh cahaya, air,
dan suhu. Keduanya jarang dipakai karena
penggunaan asam yang korosif.
1. Reaksi utama adalah reaksi hidrolisis ester kolesterol
menjadi kolesterol kemudian oksidasi kolesterol bebas
total menjadi kolestenon dan H2O2.
K.ester hidrolase
Ester kolesterol  kolesterol + asam lemak
k.oksidase
Kolesterol + O2  kolestenon + H2O2
2. Reaksi indikasi dilakukan untuk penentuan kadar H2O2
yang akan sebanding dengan kadar kolesterol dalam
sampel. menggunakan reaksi Trinder atau metode
Hantzsch
a. Reaksi Trinder dikenal untuk penggunaan 4-aminofenazon
(antipirin) dan fenol sebagai pereaksi indikasi yang akan
menghasilkan senyawa quinonimin yang berwarna merah
muda, dimana intensitas warna yg diukur intensitasnya
dengan fotometri sebanding dengan jumlah peroksida
juga sebanding dengan kadar kolesterol dalam sampel.
b. Metode Hantzsch menggunakan metanol membentuk
lutidin yg dapat ditentukan kadarnya dengan cara
fluorometri oleh ruchart (1973) atau secara kolorimetri
oleh Roesch Lau (1974)
H2O2 + metanol  formaldehid + asetilaseton + NH4+ 
lutidin
• Metode ini jarang dipakai di lab. Klinik
• Merupakan metode rujukan untuk metode-metode yg
baru
• Yang digunakan adalah kromatografi gas
menggunakan sistem ekstraksi etanol aseton pada 60°C,
lalu pelarut diuapkan, steroidnya dihidrolisis
menghasilkan residu. Residu dilarutkan dalam pelarut
terpilih, ditambahkan standar internal (kolestan) lalu
disuntikkan ke kolom silikon SE-30 pada 200-250°C
sampai semua zat berubah menjadi gas, dilewatkan
melalui kolom dan puncak-puncajk molekul direkam
dalam kromatogram, lalu dilakukan penghitungan kadar
(secara manual atau otomatis)