PEMBAHASAN

Pada praktikum kali ini dilakukan uji penentuan kadar glukosa darah. Penentuan
kadar glukosa darah dapat dilakukan dengan berbagai metode. metode yang digunakan untuk
penentuan kadar glukosa darah adalah metode Folin-Wu. Prinsip penentuan kadar glukosa
darah dengan metode Folin-Wu adalah reaksi reduksi ion kupri di dalam larutan kupritartrat
oleh gula pereduksi menjadi ion kupro. Senyawa Cu2O yang terbentuk selanjutnya bereaksi
dengan asam fosfomolibdat membentuk senyawa fosfomolibdenum oksida yang berwarna
biru tua. Intensitas warna biru yang terbentuk sebanding dengan kadar glukosa didalam darah
sampel sehingga dapat diukur serapannya secara spektrofotometri. Kelebihan dari metode
Follin Wu metode ini sangat sederhana dan pengerjaannya mudah. Kelemahan metode Folin
wu ialah hasil positif yang didapat besar karena beraksi juga dengan jenis gula lain, keratin
asam askorbat, dan bahan lain, namun metode ini memiliki beberapa keuntungan yaitu hanya
dibutuhkan dua pelarut, filtrat yang terbentuk lebih netral, dan proses filtrasi lebih cepat
(Haden 1923)

Aplikasi hukum Lambert Beer dapat menentukan kadar gula dalam sampel secara
metode kuantitatif. Analisis spektrofotometri digunakan suatu sumber radiasi yang menjorok
ke sebuah daerah ultraviolet spektrum tersebut. Hukum Lambert Beer menyatakan bahwa bila
cahaya monokromatik melewati medium tembus cahaya, laju akan berkurang intensitasnya
oleh pertambahan ketebalan, berbanding lurus dengan intensitas cahaya (Swinehart, 1962)

Darah yang digunakan dalam percobaan ini adalah darah ayam. Percobaan penentuan
kadar glukosa darah ini didasarkan pada hasil reduksi ion Cu2+ oleh glukosa dalam suasana
basa dengan reagen arsenomolibdat yang memberikan warna biru. Reaksi ini dilakukan
dalam suasana basa karena reaksi reduksi dapat berjalan dengan baik dalam suasana basa.
Proses yang terjadi pada metode ini yaitu oksidasi glukosa menjadi asam glukonat dan
reduksi ion Cu2+ menjadi ion Cu+. Selanjutnya diukur absorbansinya pada panjang gelombang
540 nm dengan menggunakan spektrofotometer. Pada penentuan kadar glukosa darah ini
diawali dengan membuat filtrat darah bebas protein kemudian penentuan kadar glukosa
darah.

Pada penentuan filtrat darah bebas protein, mula-mula dimasukkan 0,5 ml darah yang
telah ditambahkan natrium oksalat kedalam tabung sentrifugal yang telah diisi dengan 1,5 ml
H2O. Penambahan natrium oksalat berfungsi agar darah tidak terjadi pembekuan. Darah
mengandung ion Ca2+ yang dapat membentuk benang-benang fibrin yang menyebabkan darah
membeku jika tidak ditambahkan dengan natrium oksalat. Penambahan H2O berfungsi untuk
melarutkan albumin darah dan untuk mengencerkan darah. Kemudian ditambahkan larutan
Ba(OH)2 0,3 N, warna larutan darah yang semula bewarna merah menjadi bewarna merah
kecoklatan. Ba(OH)2 berfungsi memberi suasana basa dan untuk mengendapkan kelebihan
oksalat, setelah itu ditambahkan dengan ZnSO4 yang berfungsi untuk mendenaturasi protein.
Hasil pengamatan menunjukkan warna larutanmenjadi coklat muda. Sesuai dengan
persamaan reaksi berikut :

Ba(OH)2(aq) + ZnSO4(aq) → Zn(OH)2(s) + BaSO4(s)

Larutan Zn(OH)2 berfungsi bersifat seperti koloid yang menyebabkan protein dapat
terkoagulasi. Kemudian dibiarkan 3 menit agar endapan yang terbentuk sempurna, kemudian
dilanjutkan dengan sentrifugasi larutan selama 20 menit. Sentrifugasi larutan ini bertujuan
untuk memisahkan protein dengan glukosa. Protein akan terletak pada lapisan bawah karena
memilik massa jenis yang lebih besar daripada glukosa yang ditunjukkan dengan
terbentuknya endapan coklat dan sentrat menjadi tidak bewarna. Sentrat yang diperoleh
dianalisis lebih lanjut dengan standar glukosa dan larutan blanko.

Sentrat darah bebas protein yang diperoleh dimasukkan dalam tabung reaksi sebanyak
1 ml. Kemudian ditambahkan pereaksi Nelson. Pereaksi Nelson merupakan campuran 25
bagian Nelson A dengan 1 bagian Nelson B yang diaduk hingga homogen. Pereaksi Nelson
ini berfungsisebagai oksidator pada reaksi reduksi ion kupri oleh gula pereduksi menjadi
kuprooksida yang dapat membentuk endapan merah bata.

Setelah itu diinkubasi dalam air mendidih selama 20 menit. Hal ini bertujuan untuk
mempercepat laju reaksi reduksi Cu2+ menjadi Cu+ . Hasil pengamatan menunjukkan larutan
menjadi bewarna hijau. Setelah itu ditambahkan pereaksi bewarna arsenoolibdat yang
berfungsi untuk melarutkan kuprooksida, dan untuk mengoksidasi Mo, sehingga dihasilkan
warna biru. Penambahan reaksi warna ini pada prinsipnya agar dapat dibaca adsorbansinya
dalam spektofotometer, karena spektofotometer ini menggunakan cahaya tampak. Dari hasil
pembacaan pada spektofotometer, diperoleh adsorbansi sentrat bebas protein sebesar xxxx.

Untuk menentukan kadar glukosa dalam darah diperlukan adsorbansi kelima standar
glukosa dengan konsentrasi 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 dan 1 dan larutan blanko. Penentuan adsorbansi
standar glukosa dan larutan blanko seperti pada penentuan adsorbansi sentrat darah bebas
protein. Langkah-langkah dalam Penentuan adsorbansi kelima standar glukosa, larutan
blanko dan sentrat darah bebas protein ini dilakukan dalam waktu yang bersamaan. Hasil
pengamatan diperoleh adsorbansi standar glukosa sebesar 0,416; 0,339; 0,552; 0,533; 0,491.
Kemudian dibuat kurva dengan konsentrasi diperoleh:

HASIL BACA GRAFIK

Metode-metode penetapan glukosa dalam darah yang sering digunakan selain Folin-
Wu ialah Nelson Somogi dan Nelson Somogi Termodifikasi. Sebenarnya metode-metode
tersebut berdasarkan pada spektofotometri karena secara umum kadar glukosa diukur secara
kuantitatif. Perbedaan antara metode penetapan glukosa adalah pemakaian pereaksi. Metode
Nelson Somogi merupakan metode penetapan kadar gula pereduksi, dimana prinsipnya, gula
pereduksi akan mereduksi ion Cu2+ menjadi ion Cu+ , kemudian ion Cu+ ini akan mereduksi
senyawa reagen Nelson (arsenomolibdat) membentuk kompleks berwarna biru kehijauan dan
diukur pada panjang gelombang 520 nm. Sedangkan metode Nelson Somogi Termodifikasi
adalah dengan mengganti reagen Nelson (arsenomolibdat) menjadi reagen Folin-Ciocalteau
(fosfomolibdat). Ion Cu+ ini akan mereduksi senyawa fosfomolibdat membentuk kompleks
bewarna biru dan diukur pada panjang gelombang 600 nm. Keuntungan menggunakan
metode Nelson Somogi adalah memiliki nilai Recovery, LOD LOQ dan nilai RSD lebih baik
dari Nelson Somogi termodifikasi. Sementara kekurangan dari metode Nelson Somogi ini
adalah reagen Nelson bersifat aresnik sehingga sangat toxic dan berbahaya bagi tubuh maka
dilakukannya modifikasi pada Metode Nelson Somogi Termodifikasi. Keuntung metode
Nelson Somogi Termodifikasi adalah reagen FolinCiocalteau tidak bersifat arsenik sehingga
aman bagi tubuh. Sementara kekurangan metode Nelson Somogi Termodifikasi adalah
memiliki nilai Recovery, LOD LOQ dan nilai RSD lebih rendah dari Nelson Somogi
(Hatanaka & Kobara, 1980).

Haden RL. 1923. A Modification of The Folin-Wu Method for Making Protein-
FreeBloodFiltrates. The Journal of Biological Chemistry. 937- 943.
Hatanaka, C., & Kobara, Y. (1980). Determination of glucose by a modification of Somogyi-
Nelson method. Agricultural and Biological Chemistry, 44(12), 2943-2949.
Swinehart, D. F. (1962). The beer-lambert law. Journal of chemical education, 39(7), 333.