LAPORAN BIOKIMIA 1

Penentuan Kadar Asam Amino Dalam Sampel

I. JUDUL PERCOBAAN

: Penentuan Kadar Asam Amino Dalam Sampel

II. HARI, TANGGAL PERCOBAAN :

Mulai
Selesai

: Senin, 26 September 2016, pukul 07.00

: Senin, 26 September 2016, pukul 09.40

III.TUJUAN PERCOBAAN

Menentukan asam amino yang terdapat dalam sampel dengan kromatografi kertas
IV. DASAR TEORI

Asam Amino
Asam amino adalah sembarang senyawa organik yang memiliki gugus
fungsional karboksil (-COOH) dan amina (biasanya -NH2). Dalam biokimia
seringkali pengertiannya dipersempit: keduanya terikat pada satu atom karbon (C)
yang sama (disebut atom C "alfa" atau ). Gugus karboksil memberikan sifat
asam dan gugus amina memberikan sifat basa. Dalam bentuk larutan, asam amino
bersifat amfoterik: cenderung menjadi asam pada larutan basa dan menjadi basa
pada larutan asam. Perilaku ini terjadi karena asam amino mampu menjadi
zwitter-ion. Asam amino termasuk golongan senyawa yang paling banyak
dipelajari karena salah satu fungsinya sangat penting dalam organisme, yaitu
sebagai penyusun protein.
Struktur asam amino

Struktur asam -amino, dengan gugus amina di sebelah kiri dan gugus
karboksil di sebelah kanan. Struktur asam amino secara umum adalah satu atom C
yang mengikat empat gugus: gugus amina (NH2), gugus karboksil (COOH), atom
hidrogen (H), dan satu gugus sisa (R, dari residue) atau disebut juga gugus atau
rantai samping yang membedakan satu asam amino dengan asam amino lainnya.
Atom C pusat tersebut dinamai atom C ("C-alfa") sesuai dengan penamaan
senyawa bergugus karboksil, yaitu atom C yang berikatan langsung dengan gugus

LAPORAN BIOKIMIA 1
Penentuan Kadar Asam Amino Dalam Sampel

karboksil. Oleh karena gugus amina juga terikat pada atom C ini, senyawa
tersebut merupakan asam -amino.
Asam amino biasanya diklasifikasikan berdasarkan sifat kimia rantai
samping tersebut menjadi empat kelompok. Rantai samping dapat membuat asam
amino bersifat asam lemah, basa lemah, hidrofilik jika polar, dan hidrofobik jika
nonpolar.
Pada umumnya asam amino larut dalam air dan tidak larut dalam pelarut
organik non polar seperti eter, aseton, dan kloroform. Kelarutan asam amino ini
berbeda dengan asam karboksilat dan amina. Asam amino mempunyai titik
lebur yang tinggi bila dibandingkan dengan asam karboksilat dan amina. Hal ini
menunjukkan

bahwa

asam

amino

cenderung

mempunyai struktur yang

bermuatan dan mempunyai polaritas tinggi dan bukan sekedar senyawa yang
mempunyai

gugus COOH dan gugus NH2. Hal ini tampak pula pada sifat

asam amino sebagai elektrolit

Asam amino dasar (standar)
Protein tersusun dari berbagai asam amino yang masing-masing
dihubungkan

dengan

ikatan

peptida.

Meskipun

demikian,

pada

awal

pembentukannya protein hanya tersusun dari 20 asam amino yang dikenal sebagai
asam amino dasar atau asam amino baku atau asam amino penyusun protein
(proteinogenik). Asam-asam amino inilah yang disandi oleh DNA/RNA sebagai
kode genetik.
Berikut adalah ke-20 asam amino penyusun protein (singkatan dalam
kurung menunjukkan singkatan tiga huruf dan satu huruf yang sering digunakan
dalam kajian protein), dikelompokkan menurut sifat atau struktur kimiawinya:
Asam amino alifatik sederhana

Glisina (Gly, G)

Alanina (Ala, A)

Valina (Val, V)

LAPORAN BIOKIMIA 1
Penentuan Kadar Asam Amino Dalam Sampel

Leusina (Leu, L)

Isoleusina (Ile, I)
Asam amino hidroksi-alifatik

Serina (Ser, S)

Treonina (Thr, T)
Asam amino dikarboksilat (asam)

Asam aspartat (Asp, D)

Asam glutamat (Glu, E)

Amida

Asparagina (Asn, N)

Glutamina (Gln, Q)
Asam amino basa

Lisina (Lys, K)

Arginina (Arg, R)

Histidina (His, H) (memiliki gugus siklik)

Asam amino dengan sulfur

Sisteina (Cys, C)

Metionina (Met, M)
Prolin

Prolina (Pro, P) (memiliki gugus siklik)

Asam amino alifatik sederhana

Glisina (Gly, G)

Alanina (Ala, A)

Valina (Val, V)

Leusina (Leu, L)

Isoleusina (Ile, I)
Asam amino hidroksi-alifatik

Serina (Ser, S)

Treonina (Thr, T)

LAPORAN BIOKIMIA 1
Penentuan Kadar Asam Amino Dalam Sampel

Asam amino dikarboksilat (asam)

Asam aspartat (Asp, D)

Asam glutamat (Glu, E)

Amida

Asparagina (Asn, N)

Glutamina (Gln, Q)
Asam amino basa

Lisina (Lys, K)

Arginina (Arg, R)

Histidina (His, H) (memiliki gugus siklik)

Asam amino dengan sulfur

Sisteina (Cys, C)

Metionina (Met, M)
Prolin

Prolina (Pro, P) (memiliki gugus siklik)

Asam amino aromatik

Fenilalanina (Phe, F)

Tirosina (Tyr, Y)

Triptofan (Trp, W)
Kromatografi Kertas
Kromatografi digunakan untuk memisahkan campuran dari substansinya
menjadi

komponen-komponennya.

Seluruh

bentuk

kromatografi

bekerja

berdasarkan prinsip yang sama. Seluruh bentuk kromatografi memiliki fase diam
(berupa padatan atau cairan yang didukung pada padatan) dan fase gerak (cairan
atau gas). Fase gerak mengalir melalui fase diam dan membawa komponenkomponen dari campuran bersama-sama. Komponen-komponen yang berbeda
akan bergerak pada laju yang berbeda pula. Dalam kromatografi kertas, fase diam
adalah kertas serap yang sangat seragam. Fase gerak adalah pelarut atau campuran
pelarut yang sesuai.

LAPORAN BIOKIMIA 1
Penentuan Kadar Asam Amino Dalam Sampel

Untuk mengetahui jenis-jenis dari asam amino yang terkandung dari suatu
bahan/sampel, biasanya digunakan metode kromatografi kertas.Kromatogrfi
kertas diterapkan untuk analisis campuran asam amino karena asam amino
memiliki sifat yang larut dalam air dan tidak mudah menguap sehingga dapat
dipisahkan

melaui

perpindahan

fasa

gerak

(eluen)

pada

fasa

diam

(adsorben).Asam amino akan terbawa oleh fasa gerak dan akan mengendap atau
menempel pada fasa diam (adsorben) setelah menempuh jarak tertentu.
Adsorben dalam kromatografi kertas adalah kertas saring, yakni selulosa.
Sampel yang akan dianalisis ditotolkan ke ujung kertas yang kemudian digantung
dalam wadah. Kemudian dasar kertas saring dicelupkan ke dalam pelarut yang
mengisi dasar wadah.Setiap asam amino bergerak dari titik awal sepanjang jarak
tertentu.Setiap jenis asam amino akan selalu menempuh jarak yang khas dari
masing-masing asam amino asalkan jenis kertas, eluen, dan pelarutnya sama
Beberapa senyawa dalam campuran bergerak sejauh dengan jarak yang
ditempuh pelarut; beberapa lainnya tetap lebih dekat pada garis dasar. Jarak
tempuh relative pada pelarut adalah konstan untuk senyawa tertentu sepanjang
anda menjaga segala sesuatunya tetap sama, misalnya jenis kertas dan komposisi
pelarut yang tepat.
Jarak relative pada pelarut disebut sebagai nilai Rf. Untuk setiap senyawa berlaku
rumus sebagai berikut:

Rf

jarak yang ditempuh oleh senyawa

jarak yang ditempuh oleh pelarut

Posisi pelarut depan ditandai dengan pensil dan kromatogram lalu dikeringkan
dan disemprotkan dengan larutan ninhidrin. Ninhidrin bereaksi dengan asam
amino menghasilkan senyawa berwarna, utamanya coklat atau ungu.

LAPORAN BIOKIMIA 1
Penentuan Kadar Asam Amino Dalam Sampel

Tabel nilai Rf 20 asam amino

No

Asam Amino

Nilai Rf

Histidin

0.11

Glutamin

0.13

Lisin

0.14

Arginin

0.20

Asam aspartat

0.24

Glisin

0.26

Serin

0.27

Asam glutamat

0.30

Treonin

0.35

10

Alanin

0.38

11

Sistein

0.40

12

Prolin

0.43

LAPORAN BIOKIMIA 1
Penentuan Kadar Asam Amino Dalam Sampel

13

Tirosin

0.45

14

Asparagin

0.50

15

Metionin

0.55

16

Valin

0.61

17

Triptofan

0.66

18

Fenilalanin

0.68

19

Isoleusin

0.72

20

Leusin

0.73

Kromatografi Kertas pada Asam Amino

Asam-asam amino yang bereaksi dengan ninhidrin membentuk suatu produk yang
disebut ungu Ruhmann. Reaksi ini biasanya digunakan sebagai uji bercak untuk
mendeteksi adanya asam amino pada kertas kromatografi.
Adapun reaksi umum secara keseluruhannya, adalah sebagai berikut :

ninhidrin
Alanin

anion ungu
+ RCHO + CO2 + 3H2O + H+

Semua asam amino, kecuali glisin dapat dianggap sebagai derivat alanin. Alanin
diperoleh untuk pertama kalinya oleh Weyl dari hasil hidrolisis fibroin, yaitu
protein yang terdapat pada sutera. Struktur alanin :

LAPORAN BIOKIMIA 1
Penentuan Kadar Asam Amino Dalam Sampel

Treonin
Treonin adalah homolog yang lebih besar dari erin dan termasuk dalam golongan
asam amino esensial. Mula-mula treonin diisolasi dari hasil hidrolisis fibrin darah.
Berikut struktur treonin :

Glisin
Glisin adalah asam amino yang paling sederhana dan terdapat pada skleroprotein.
Pada tahun 1820 Braconnot menemukan glisin dari hasil hidrolisis gelatin.
Adapun struktur glisin adalah :

V. ALAT DAN BAHAN

a. Alat
1. Labu pemisah

1 buah

2. Kaca kapiler

4 buah

3. Bejana/gelas kimia besar

1 buah

4. Botol semprot

1 buah

5. Oven

1 buah

b. Bahan
1. Kertas kromatografi
2. Asam asetat glasial

LAPORAN BIOKIMIA 1
Penentuan Kadar Asam Amino Dalam Sampel

3. n-butanol
4. Aquades
5. Larutan asam amino standar
6. HCl pekat
7. Larutan sampel
VI.

ALUR KERJA:
Pembuatan larutan pengemulsi (fasa gerak)
25 ml n-butanol + 6 ml asam asetat glasial + 25 ml aquades
Dimasukkan dalam lemari kromatografi (chamber)
Dikocok dan dicampur
Dijenuhkan dengan uapnya
Larutan pengemulsi
Kertas Kromatografi 4 x 10 cm

Diukur
Ditetesi 4 macam larutan A, B, C, S berdampingan dengan jarak 1 cm (larutan ujung ada pada 0,5
Dikeringkan dulu tiap tetesan sebelum tetesan berikutnya diletakkan diatasnya (besar noda tidak
Digantung diatas lemari kromatografi beberapa jam
Setelah penjenuhan tercapai, dimulai dengan elusi
Setelah larutan elusi berjalan cukup jauh, kertas kromatografi diangkat
Batas larutan ditandai dengan pensil dan dikeringkan pada 105-110C
Dihitung harga Rf dan dicatat warnanya

Hasil pengamatan

LAPORAN BIOKIMIA 1
Penentuan Kadar Asam Amino Dalam Sampel

10

LAPORAN BIOKIMIA 1
Penentuan Kadar Asam Amino Dalam Sampel

VII.

HASIL PENGAMATAN:

No.

Prosedur Percobaan

Perc
1.

Hasil Pengamatan
Sebelum

Pembuatan larutan pengemulsi (fasa gerak)

diletakkan

tetesan

butanol

n-

HO-CH2-CH2-CH2-CH3 (aq)

+ CH3COOH (aq)

larutan asam

CH3COOC4H9 (aq) + H2O (aq)

asetat glasial

CH3COOC4H9 (aq) + H2O (l)

CH3COOC4H9 (aq)

aquades:

larutan

tidak

Sampel mengandung
asam amino standar
glisin

berwarna

berikutnya

diatasnya

(besar

noda tidak lebih dari 0,4 cm)

Digantung
diatas
lemari
Kertas kromatografi 4 x 10 cm
kromatografi beberapa jam
Setelah penjenuhan tercapai,

Kesimpulan

Sesudah

Larutan n-butanol: Larutan

larutan
tidak
25 ml n-butanol + 6 ml asam asetat glasial + 25 ml aquades
berwarna
Larutan
asam

Diukur
Dimasukkan dalam lemari kromatografi (chamber)
asetat
glasial:
Ditetesi
4 macam larutan A, B,
Dikocok dan
dicampur
larutan
tidak
Dijenuhkan C,
dengan
uapnya
S berdampingan
dengan
berwarna
jarak 1 cm (larutan ujung ada
Aquades:
tidak
pada 0,5 cm dari pinggir kertas
berwarna
Larutan
pengemulsi
Dikeringkan
dulu tiap tetesan
sebelum

Dugaan / Reaksi

dimulai dengan elusi

Pelat
Setelah
elusi+berjalan
25 ml larutan
n-butanol
6 ml asam asetat glasial + 25 ml aquades
kromatografi
cukup
jauh,
kertas
Dimasukkan dalam lemari kromatografi (chamber)
kromatografi
diangkatdan dicampur
Dikocok
Dijenuhkan dengan uapnya
Larutan pengemulsi

Terbentuk titik-titik noda

kromatografi
Rf alanin = 0,38
Rf glisin = 0,26
Rf sistein = 0,4
Reaksi alanin dengan
11

LAPORAN BIOKIMIA 1
Penentuan Kadar Asam Amino Dalam Sampel

dioven

ninhidrin

berwarna putih
Larutan Alanin:
larutan

tidak

berwarna
Larutan glisin:
larutan

tidak

berwarna
Larutan sistein:
larutan
Batas

larutan

dengan
diekringkan

ditandai

pensil
pada

110C selama 5 menit

Dihitung harga Rf
dicatat warnanya
Hasil Pengamatan

dan

tidak

berwarna
Sampel: larutan

105-

tidak berwarna
Eluen: larutan

dan

tidak berwarna
Larutan
larutan
berwarna

tidak
berwarna
Pelat + eluen
+

disemprot

ninhidrin: ada
noda

tidak

berwarna
merah muda
Rf
alanin:
2,2
=0,27
8,2
Rf

ninhidrin:

Pelat + eluen:

glisin:

CH3OH + CO2 + 3H2O +

H+

1,7
=0,21
8,2
Rf

sampel:

Reaksi glisin dengan

ninhidrin

12

LAPORAN BIOKIMIA 1
Penentuan Kadar Asam Amino Dalam Sampel

1,4
=0,17
8,2

+ HCHO + CO2 + 3H2O

+ H+
Reaksi sistein dengan
ninhidrin

13

LAPORAN BIOKIMIA 1
Penentuan Kadar Asam Amino Dalam Sampel

+
+ CO2 + H2O

14

LAPORAN BIOKIMIA 1
Penentuan Kadar Asam Amino Dalam Sampel

VIII. ANALISIS DAN PEMBAHASAN

Pada percobaan yang dilakukan ini digunakan metode pemisahan asam
amino dengan cara kromatografi kertas. Kromatografi kertas merupakan
pemisahan bedasarkan sistem partisi, dimana fase diamnya berupa kertas saring
dan fase geraknya berupa cairan pelarut (eluen). Pelarut (eluen) yang digunakan
merupakan campuran dari beberapa larutan.
Dalam percobaan ini, eluen yang digunakan terdiri dari n-butanol, asam
asetat glasial dan aquades. Ketiga larutan tersebut dicampurkan dan dimasukkan
dalam lemari kromatografi (chamber). Kemudian dikocok dan dicampurkan. Lalu
dijenuhkan dengan uapnya. Proses penjenuhan dengan uap pelarutnya yaitu untuk
mempercepat pemisahan. Penjenuhan udara dalam chamber dengan uap
menghentikan penguapan pelarut sama halnya dengan pergerakan pelarut pada
kertas. Pada saat melakukan percobaan ini, eluen telah disiapkan oleh koas.
Botol reagent atau chamber harus ditutup agar meyakinkan bahwa kondisi
dalam chamber terjenuhkan oleh uap dari pelarut. Untuk mendapatkan kondisi ini,
dalam chamber biasanya ditempatkan kertas saring yang mengelilingi sisi
chamber yang terbasahi oleh pelarut. Kondisi jenuh dalam chamber dengan uap
mencegah penguapan pelarut. Karena pelarut bergerak lambat pada kertas,
komponen-komponen yang berbeda dari campuran pewarna akan bergerak pada
kecepatan yang berbeda dan akan tampak sebagai noda-noda asam amino yang
berwarna.
Setelah membuat larutan pengemulsi atau eluen, plat KLT disiapkan. Kertas
kromatografi yang digunakan berukuran 4 x 10 cm, diberi garis batas bawah 1 cm
dan garis batas atas 0,5 cm. Masing-masing sampel larutan asam amino ditotolkan
pada kertas kromatografi dengan menggunakan pipa kapiler, penggunaan pipa
kapiler pada saat penotolan adalah agar tetesan asam amino yang diteteskan
tidaklah terlalu banyak sehingga dalam satu kertas saring mampu menampung tiga
jenis sampel asam amino. Pada percobaan ini besar noda tidak lebih dari 0,4 cm.
Kemudian dimasukkan dalam dalam chamber atau botol reagent yang telah
dijenuhi oleh uap eluen. Kemudia chamber ditutup rapat agar terjadi pemisahan
yang sempurna. Pemisahan asam amino dengan cara kromatografi kertas
disebabkan adanya perbedaan koefisien partisi antara air dan pelarut organik.

15

LAPORAN BIOKIMIA 1
Penentuan Kadar Asam Amino Dalam Sampel

Perbedaan koefisien partisi menunjukkan perbedaan laju perambatan pada

permukaan kertas dari air dan pelarut organik yang merambat secara perlahan.
Fase air akan tertahan dengan kuat di pori-pori kertas karena adanya interaksi
yang kuat antara air dengan gugus hidroksil dari selulosa kertas saring.

Ketika kertas kromatografi yang telah ditotolkan sampel asam amino, maka
akan terjadi pemisahan, dimana pelarut organik merambat ke atas melalui kapiler
kertas mengangkut campuran asam amino yang ada ditotolkan pada kertas
kromatografi. Asam amino yang paling larut di dalam pelarut organic, akan
diangkut paling cepat dan asam amino yang paling kurang larut akan tertinggal
paling bawah. Pelarut yang digunakan adalah n-butanol : asam asetat glasial : air.
Prinsip kerjanya memisahkan sampel berdasarkan perbedaan kepolaran antara
sampel dengan pelarut yang digunakan. Teknik ini biasanya menggunakan fase
diam dari bentuk plat silica dan fase geraknya disesuaikan dengan jenis sampel
yang ingin dipisahkan. Larutan atau campuran larutan yang digunakan dinamakan
eluen. Semakin dekat kepolaran antara sampel dengan eluen maka sampel akan
semakin terbawa oleh fase gerak tersebut.
Pada proses penotolan larutan asam amino yang digunakan yaitu alanin
(sampel A), glisin (sampel B), sistein (sampel C), dan sampel 1 yang belum
diketahui asam amino apa yang digunakan. Semua sampel ditotolkan tidak lebih
dari 0,4 cm. Setelah ditotolkan dengan keempat sampel tersebut, kertas
kromatografi dimasukkan dalam chamber. Jalan eluen sangat lambat, sehungga
dibutuhkan waktu yang lama agar eluen mencapai batas atas. Ketika eluen telah
mencapai batas atas, kertas kromatografi diangkat dari dalam chamber dan dioven
pada suhu 105o-110oC. Saat diangkat dari chamber dan dioven noda pada
kromatografi belum terlihat.
Berdasarkan literatur, dalam beberapa kasus, dimungkinkan untuk membuat
bercak-bercak menjadi tampak dengan jalan mereaksikannya dengan zat kimia
sehingga menghasilkan produk yang berwarna. Sebuah contoh yang baik adalah
kromatogram yang dihasilkan dari campuran asam amino. Kromatogram dapat

16

LAPORAN BIOKIMIA 1
Penentuan Kadar Asam Amino Dalam Sampel

dikeringkan dan ditambahkan dengan larutan ninhidrin. Ninhidrin bereaksi dengan

asam amino menghasilkan senyawa-senyawa berwarna khas ungu-biru sampai
kecoklatan atau kuning.
Asam amino merupakan jenis zat tidak berwarna, sehingga untuk
mengetahui letak noda diperlukan pereaksi lokasi, maka pada kertas kromatografi
disemprotkan larutan ninhidrin. Dalam percobaan ini digunakan larutan ninhidrin
yang disemprotkan pada kertas kromatografi setelah dikeringkan, sehingga nodanoda pada kertas kromatografi dapat terlihat yakni noda yang berwarna merah
muda. Terbentuknya noda berwarna merah muda ini disebabkan karena terjadinya
reaksi antara hidrat dari triketon siklik (ninhidrin) dengan asam amino.
Noda-noda ini kemudian diukur dengan membandingkan jarak komponen
yang dipisahkan (analit) dengan jarak pergerakan pelarut, disimbolkan dengan Rf.

Rumusnya :

jarak yang ditempuh oleh senyawa

jaraknoda Rf
Rf =
jarak yang ditempuh oleh pelarut
jarakeluen

Sering kali pengukuran diperoleh dari kertas untuk memudahkan

identifikasi senyawa-senyawa yang muncul. Pengukuran ini berdasarkan pada
jarak yang ditempuh oleh pelarut dan jarak yang tempuh oleh bercak warna
masing-masing.
Berdasarkan perhitungan diperoleh bahwa masing-masing asam amino
memiliki harga Rf yang berbeda. Setelah dilakukan perhitungan diperoleh data
asam amino sebagai beriku:
Strandar A

: 0,27

Strandar B

: 0,21

Sampel S1

: 0,17

Pada sampel C tidak terdapat noda yang terlihat. Sehingga tidak bisa
dihitung jarak yang ditempuh. Berdasarkan standar asam amino diketahui bahwa
sampel mendekati standar B. Berdasarkan teori standar B mempunyai Rf yang
mendekati Glisin, sehinngga standar B dan sampel S 1 merupkan asam amino
Glisin. Jika dibandingkan dengan harga Rf asam-asam amino standar secara teori
yakni Glisin (Rf=0,26), berbeda dengan harga Rf hasil percobaan. Hal ini karena
harga Rf dipengaruhi oleh eluen, sedangkan pada harga Rf standar tidak diketahui
17

LAPORAN BIOKIMIA 1
Penentuan Kadar Asam Amino Dalam Sampel

eluen yang digunakan, bisa saja eluen yang digunakan berbeda sehingga hasil
daripada harga Rf juga berbeda.
Glisin

ninhidrin

Anion merah muda

+ HCHO + CO2 + 3H2O +
H+

Reaksi glisin dengan ninhidrin secara terperinci ialah :

IX.

DISKUSI

18

LAPORAN BIOKIMIA 1
Penentuan Kadar Asam Amino Dalam Sampel

Noda pada sampel C tidak dapat terlihat setelah direaksikan dengan ninhidrin.
Hal ini dapat disebabkan karena beberapa hal. Hal pertama yang dapat
menyebabkan sampel tidak terlihat yaitu proses penotolan yang kurang sesuai
sehingga sampel tidak dapat berjalan. Hal kedua yang dapat terjadi yaitu pada saat
proses penyemprotan ninhidrin kurang merata pada kertas kromatografi sehingga
noda tidak dapat terlihat.
X. KESIMPULAN
1. Kromatografi kertas dapat digunakan untuk mengidentifikasi/memisahkan asam
amino dalam suatu campuran.
2. Asam-asam amino yang terkandung dalam sampel (sampel 1)
adalah Glisin, hal ini dikarenakan pada sampel memiliki nilai R f
(Rf =0,17) yang hampir sama dengan larutan standar yang
mengandung Glisin ( Rf = 0,21 ). Penentuan asam amino ini
berdasarkan besarnya Rf yang mendekati dengan teori, Glisin
XI.

mempunyai Rf sebesar 0,26 secara teori.

DAFTAR PUSTAKA
Fessenden dan Fessenden. 1994. Kimia Organik Jilid 2 Edisi Ketiga. Jakarta:
Erlangga.
Harper, et al. 1980. Biokimia (Review of Physiological Chemistry). Edisi 17.
Jakarta: EGC
Lehninger. 1982. Dasar-dasar Biokima. Jakarta: Erlangga
Matsjeh, Sabirin, Hardjono Sastrihamidjojo dan Respati Sastrosajdono. 1996.
Kimia Organik II. Jakarta: Depdikbud
Poedjiadi, Anna dan F. M. Titin Supriyanti. 2006. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta:
UI-Press.
Tim Dosen Biokimia . 2016. Petunjuk Praktikum Biokimia. Surabaya: Unesa

JAWABAN PERTANYAAN
1. Apakah keuntungan dan kerugian dalam mitode pemisahan dengan kromatografi
kertas ?
Jawab :
Keuntungan dan kerugian dari metode pemisahan dengan Kromatografi Kertas :
Keuntungan :

19

LAPORAN BIOKIMIA 1
Penentuan Kadar Asam Amino Dalam Sampel

Pada kromatografi Kertas peralatan yang dipakai tidak perlu alat-alat

yang teliti. Hasil-hasil yang baik dapat diperoleh dengan peralatan dan

materi-materi yang sangat sederhana.

Senyawa-senyawa yang terpisahkan dapat dideteksi pada kertas dan

dapat segera diidentifikasikan

Harganya lebih murah jika dibandingkan dengan KLT
kromatografi kertas preparatif diperlukan kertas yang lebih besar dari
pada untuk analisis, Keuntungannya yaitu beban langan bilangan Rf
menjadi besar sehingga pengukuran Rf merupakan parameter yang
berharga dalam memaparkan senyawa baru.

Kerugian :

Tidak bisa melakukan analisis kuantitatif pada komponen-komponen

sampel, hanya terbatas pada analisis kualitatif saja.

Waktunya lebih lama dari pada adsorben lain, tapi lebih singkat dari pada

KLT
Tidak bisa menggunakan pereaksi H2SO4 karena selulosa akan

terdekomposisi
2. Apakah metode kromatografi kertas dapat digunakan untuk analisis kuantitatif ?
Jawab :
Metode kromatografi kertas dapat digunakan baik untuk melakukan analisis
yang bersifat kuantitatif maupun kualitatif.
Analisis Kuantitatif dilakukan berdasarkan perbandingan Rf dari zat sampel
dengan harga Rf zat standar. Agar analisis kuantitatif dapat berhasil baik perlu
diperhatikan hal hal berikut :
Kondisi percobaan harus sama, karena harga Rf tergantung pada kondisi
tersebut
Adanya noda pada kromatogram belum berarti adanya zat tunggal dalam
sampel
Harus dicoba dengan berbagai pelarut
Analisis Kualitatif dilakukan dengan mengidentifikasi komponen asam amino
dari sampel terhadap suatu larutan asam amino yang telah diketahui sebelumnya
berdasarkan nilai Rf, Pada percobaan ini ditandai dengan adanya warna ungu
serta dari harga Rf sampel yang diselidiki lalu dibandingkan dengan harga Rf
standarnya.
3. Faktor apa saja yang mempengaruhi nilai Rf ?
Jawab :
20

LAPORAN BIOKIMIA 1
Penentuan Kadar Asam Amino Dalam Sampel

Faktor-faktor yang menentukan harga Rf yaitu :

Pelarut disebabkan oleh pentingnya koefisien partisi, maka perubahanperubahan

yang

sangat

kecil

dalam

komposisi

pelarut

dapat

menyebabkan perubahan- perubahan harga Rf.

Kehadiran ion lain, misalnya adanya klorida dalam pemisahan yang

dilakukan dengan larutan-larutan nitrat

Kertas pengaruh utama kertas pada harga Rf timbul dari perubahan ion
dan serapan, yang berbeda untuk macam-macam kertas. Kertas
mempengaruhi kecepatan aliran dan mempengaruhi kesetimbangan

partisi.
Ukuran dari bejana volume dari bejana mempengaruhi homogenitas
dari atmosfer sehingga mempengaruhi kecepatan penguapan dari
komponen-komponen pelarut dari kertas. Jika bejana besar digunakan,
ada tendensi perambatan lebih lama, seperti perubahan komposisi pelarut
sepanjang kertas, maka koefisien partisi akan berubah juga. Dua faktor

yaitu penguapan dan kompisisi mempengaruhi harga Rf.

Kualitas adsorben
Ketebalan lapisan , semakin tebal lapisan Rf nya semakin kecil
Kejenuhan ruang kromatografi
Suhu, perubahan dalam suhu merubah koefisien partisi dan juga

kecepatan aliran.
Ukuran dari bejana, volume dari bejana mempengaruhi homogenitas dari
atmosfer jadi mempengaruhi kecepatan penguapan dari komponenkomponen pelarut dari kertas. Jika bejana besar digunakan, ada tendensi
perambatan lebih lama, seperti perubahan komposisi pelarut sepanjang
kertas, maka koefisien partisi akan berubah juga. Dua faktor yaitu

penguapan dan kompisisi mempengaruhi harga Rf.

Sifat dari campuran, berbagai senyawa mengalami partisi diantara
volume-volume yang sama dari fasa tetap dan bergerak. Mereka hampir
selalu mempengaruhi karakteristik dari kelarutan satu terhadap lainnya
hingga terhadap harga Rf mereka.

21

LAPORAN BIOKIMIA 1
Penentuan Kadar Asam Amino Dalam Sampel

LAMPIRAN
A. Perhitungan Harga Rf
Rf A
Menghitung nilai
Rf A =

Jarak yang ditempuh A

Jarak tempuh eluen

Rf A =

2,2 cm
8,2 cm

Rf A =0,27

Menghitung nilai

Rf B

Rf B=

Jarak yang ditempuh B

Jarak tempuh eluen

Rf B=

1,7 cm
8,2 cm

22

LAPORAN BIOKIMIA 1
Penentuan Kadar Asam Amino Dalam Sampel

Rf B=0,25 cm

Menghitung nilai

Rf S

Rf S=

Jarak yang ditempuh S

Jarak tempuh eluen

Rf S=

1,4 cm
8,2 cm

Rf S=0,17 cm

LAMPIRAN FOTO
a. Pembuatan larutan pengemulsi (fasa gerak)
No.
1.

Dokumentasi

Keterangan
Disiapkan alat-alat
akan digunakan.

yang

23

LAPORAN BIOKIMIA 1
Penentuan Kadar Asam Amino Dalam Sampel

2.

Disiapkan
bahan-bahan
yang akan digunakan.

3.

Campuran 25 mL n-butanol
+ 6 mL asam asetat glasial +
25 mL aquades yang telah
dijenuhkan dengan uapnya
dalam chamber.

b. Menentukan komponen asam amino

No.
1.

Dokumentasi

Keterangan
Kertas kromatografi 4 x 10
cm. Diberi garis batas
bawah 1 cm dan batas atas
0,5 cm.

24

LAPORAN BIOKIMIA 1
Penentuan Kadar Asam Amino Dalam Sampel

2.

Larutan asam amino standar

dan sampel yang akan
ditotolkan. (Alanin, glisin,
L-sistein, dan sampel 1).

3.

Penotolan larutan standar A

yaitu menggunakan alanin.

4.

Penotolan larutan standar B

yaitu menggunakan glisin.

5.

Penotolan larutan standar C

yaitu menggunakan Lsistein.

25

LAPORAN BIOKIMIA 1
Penentuan Kadar Asam Amino Dalam Sampel

6.

Penotolan larutan sampel

yang menggunakan sampel
1.

7.

Setelah proses penotolan

selesai, kertas kromatografi
digantungkan di dalam
chamber
sampai
eluen
mencapai batas atas.

8.

Setelah eluen mencapai

batas
atas,
kertas
kromatografi diangkat dari
chamber, kemudian di oven
pada
suhu
105o-110oC
selama 5 menit. Lalu di
semprotkan ninhidrin.

26

LAPORAN BIOKIMIA 1
Penentuan Kadar Asam Amino Dalam Sampel

9.

Kertas kromatografi
diberi sinar UV.

saat

10.

Ditandai dengan pensil

bagian yang berwarna dan
dihitung harga Rf.

27