BAB III TINJAUAN PUSTAKA

3.1

Bakteri

3.1.1 Pengertian
Bakteri adalah salah satu jenis makhluk renik yang tidak memiliki membran
inti sel serta tidak dapat dilihat dengan kasat mata karena ukurannya yang sangat
kecil.

Beberapa

kelompok

bakteri

dikenal

sebagai

agen

penyebab infeksi dan penyakit, sedangkan kelompok lainnya dapat memberikan

manfaat dibidang pangan, pengobatan, dan industri. Struktur sel bakteri relatif
sederhana:

tanpa nukleus/inti

sel, kerangka

sel,

dan organel-organel

lain

seperti mitokondria dan kloroplas. Hal inilah yang menjadi dasar perbedaan
antara sel prokariot dengan

sel eukariot yang

lebih

kompleks

(sumber:

MicrobeWiki, 2014).
Kelompok bakteri yang paling banyak ditemukan di udara yang
kehadirannya tidak diharapkan disebut bakteri kontaminan, antara lain adalah
kelompok Bacillus, Staphylococcus, Streptococcus, Pseudomonas, Sarcina, dan
sebagainya.
Bagi

pekerja

di laboratorium

ataupun

tempat

lain

yang

sangat

memperhatikan masalah kebersihan, maka faktor kebersihan udara sangat

menentukan di dalam keberhasilan pekerjaan. Adapun cara-cara pencegahan
kehadirannya baik secara fisik maupun kimia adalah sebagai berikut:
1. Secara fisik dengan penggunaan sinar-sinar bergelombang pendek
(umumnya sinar UV) sebelum dan sesudah tempat pekerjaan dipergunakan.
2. Secara kimia dengan menggunakan senyawa-senyawa yang bersifat
membunuh bakteri, baik larutan alkohol (55 - 75%) serta larutan AMC
(HgCl2 yang diasamkan).
3.1.2 Pengaruh Lingkungan Terhadap Pertumbuhan Bakteri
Aktivitas bakteri sangat dipengaruhi oleh lingkungan, perubahan yang
terjadi pada lingkungan akan mempengaruhi pula morfologi dan fisiologi bakteri.
Ada

LAPORAN KERJA PRAKTIK DI LABORATORIUM PMM PT. BIO FARMA

(PERSERO)

III-1

mikroba yang bisa dengan cepat menyesuaikan diri dengan perubahan lingkungan
tersebut, namun adapula yang sangat peka terhadap perubahan lingkungan yang
terjadi.
Faktor-faktor lingkungan yang sangat penting dalam pertumbuhan mikroba
adalah sebagai berikut:
1. Suhu
Suhu sangat berperan penting dalam mengatur jalannya

reaksi

metabolisme bagi seluruh makhluk hidup. Begitu pula bakteri, suhu

lingkungan akan berpengaruh terhadap keberlangsungan pertumbuhannya,
sehingga bakteri ini dapat digolongkan berdasarkan kisaran suhu aktivitasnya,
yakni:
a. Bakteri psikrofil, yaitu bakteri yang hidup pada daerah suhu antara
0- 30 C, dengan suhu optimum 15 C.
b. Bakteri mesofil, yaitu bakteri yang hidup di daerah suhu antara
15 55 C, dengan suhu optimum 25 40 C.
c. Bakteri termofil, yaitu bakteri yang dapat hidup di daerah suhu tinggi
antara 40 75 C, dengan suhu optimum 50 - 65 C.
d. Bakteri hipertermofil, yaitu bakteri yang hidup pada kisaran suhu
65 - 114 C, dengan suhu optimum 88 C.
Karena di dalam proses metabolism terdapat serangkaian reaksi kimia,
maka kenaikan suhu sampai pada batas tertentu akan mempercepat reaksi
kimia. Namun, suhu tinggi melebihi suhu maksimum akan menyebabkan
denaturasi protein dan enzim, dan ini akan menyebabkan terhentinya proses
metabolisme.
2. Kelembaban
Pada umumnya bakteri memerlukan kelembaban relatif (relative humidity,
RH) yang cukup tinggi, kira-kira 85%. Kelembaban relatif dapat didefinisikan
sebagai kandungan air yang terdapat di udara. Pengurangan kadar air
dari protoplasma menyebabkan kegiatan metabolisme terhenti, misalnya pada
proses pembekuan dan pengeringan. Sebagai contoh, Escherichia coli akan
mengalami penurunan daya tahan dan elastisitas dinding selnya saat RH

lingkungan kurang dari 84%. Bakteri Gram positif cenderung hidup pada
kelembaban udara yang lebih tinggi dibandingkan dengan bakteri gram negatif
terkait

dengan

perubahan

struktur

membran

selnya

yang

mengandung lipid bilayer (MicrobeWiki, 2014).

3. Tekanan Osmosa
Larutan hipertonis dapat menyebabkan terhambatnya pertumbuhan
mikroorganisme karena sel akan mengalami plasmolisa. Beberapa mikroba
dapat menyesuaikan diri dengan kadar garam dan gula yang tinggi, bahkan
beberapa mikroba dapat tahan di dalam substrat dengan kadar garam sampai
30%. Bakteri memerlukan pH antara 6,5 7,5.

3.2

Pemantauan Lingkungan
Pemantauan Lingkungan adalah suatu pengawasan yang dilakukan terhadap

semua ruangan berkelas di area produksi maupun area pendukung, seperti area
persiapan produksi, pembuatan bulk, formulasi dan pengisian, pengujian serta area
pendukung lainnya dengan memperhatikan aspek mutu, lingkungan, dan K3.
Parameter yang dipantau adalah jumlah partikel, jumlah mikroba dan parameter
fisik seperti suhu, kelembaban ruang dan perbedaan tekanan antar ruangan.

3.3 Kriteria Penerimaan

Kriteria penerimaan dan action level untuk mikrobiologi ditetapkan sebesar
70% dari spesifikasi EuGMP 2008 Annex 1, dan dibulatkan ke bawah. Dapat
dilihat pada tabel-tabel berikut ini:
Tabel III.1 Spesifikasi Jumlah Mikrobiologi saat In Operation
Grade

A
B
C
D

Batasan Kontaminasi Mikrobiologi yang Diperbolehkan

AS (cfu/m3)
Contact Plates Glove Print 5
SP 9,0 mm
fingers
55 mm
(cfu/plate/4hrs)
(cfu/glove)
(cfu/plate)
<1
<1
<1
<1
10
5
5
5
100
50
25
200
100
50
-

CA

5
20
-

LAF/BSC/
CB

Sesuai persyaratan kelas minimum proses

(Sumber: EU GMP 2008, annex 1)

Tabel III.2 Action Limit Jumlah Mikrobiologi

Grade

Batasan Kontminasi Mikrobiologi yang Diperbolehkan

AS(cfu/m3)
Contact Plates
FD (cfu/glove)
SP 9,0 mm
(cfu/plate/4hrs)

A
B
C
D
LAF/BSC

7
70
140

55 mm

(cfu/plate)
3
3
30
17
70
30
Sesuai persyaratan kelas minimum proses

3
-

Catatan: Action limit ditetapkan 70% dari nilai spesifikasi

(Sumber: EU GMP 2008, annex 1)

3.4

Pemantauan Mikrobiologi
Pemantauan mikrobiologi dilakukan dalam kondisi in operation dan at rest,

terdiri atas settle plate, contact agar, air sampling, dan finger dab.
Tabel III.3 Jenis Pemantauan Lingkungan Mikrobilogi di Ruang Berkelas
Kelas Ruangan
A
B
C, D
LAF/C
LAF/D

Jenis Uji Mikrobiologi Batch

Related
FD, CA, SP, AS
FD, CA, SP, AS
FD, CA, SP, AS
FD, CA, SP, AS

Jenis Uji Mikrobiologi

Periodik Monthly
CA, SP, AS
(Sumber: WHO, 2012)

3.4.1 Settle Plate (SP)

Untuk pemantauan secara kontinu, dilakukan pemantauan mikrobiologi
menggunakan settle plate selama proses produksi berlangsung dimana plate ini
terpapar udara terbuka. Settle plate ini dilakukan secara periodik setiap 4 jam,
sampel settle plate ini kemudian diinkubasi dan jumlah koloni dihitung. Plate ini
ditempatkan sesuai dengan titik sampling yang telah ditetapkan melalui analisis
risiko.

3.4.2 Contact Agar (CA)

Selain menggunakan settle plate, pemantauan lingkungan ini juga
menggunakan contact agar untuk setiap titik sampling sesuai analisis risiko pada
akhir proses sebelum sanitasi. Contact agar juga dilakukan pada operator aseptik
(yang bekerja di area A dan B) secara periodik tiap bulan pada lengan baju siku
bagian dalam kanan dan kiri, masker atau permukaan lainnya yang harus di
sampling jika diperlukan. Selain pada operator, contact agar ini dilakukan pada
lantai atau mesin di area kritis sesuai dengan analisis resiko. Kontak berlangsung
selama 10 detik kemudian permukaan titik sampling bekas kontak dibersihkan
dengan desinfektan.
3.4.3 Finger Dab (FD)
Uji finger dab ini dilakukan pada operator aseptik (yang bekerja di area A
dan B) dan LAF/BSC. Finger dab ini dikerjakan oleh operator lain yang telah
terkualifikasi dan sedapat mungkin tidak terlibat langsung dalam proses produksi.
Finger dab ini dilaksanakan setelah proses produksi selesai dan sebelum proses
sanitasi. Proses pengerjaan finger dab ini dilakukan dengan menempelkan 4 jari
tangan kanan dan kiri operator (telunjuk, jari tengah, jari manis, dan kelingking)
serta ibu jari kanan dan kiri operator pada bagian atas agar.
3.4.4

Air Sampling (AS)

Air sampling berfungsi untuk mengetahui jumlah dan keberadaan

mikroorganisme yang ada di udara sekitar. Air sampling ini dilakukan sebanyak 1
kali selama proses (produksi atau pengujian) berlangsung.
Keempat pemantauan mikrobiologi tadi harus dilakukan karena untuk
mengetahui tingkat kontaminasi yang ada pada lingkungan sekitar sehingga
apabila terdapat kontaminasi pada produk/proses pengujian dapat diketahui
sumber kontaminasinya. Apabila ditemukan adanya pertumbuhan mikroorganisme
pada kelas A dan B, maka dilakukan identifikasi. Dan jika ditemukan adanya
mikroorganisme yang tumbuh melebihi action limit pada kelas C dan D, maka
dilakukan identifikasi.

3.5 Metode TPC (Total Plate Count) untuk Perhitungan Bakteri

Metode TPC (Total Plate Count) dilakukan dengan menanam suspensi
bahan uji pada media McConkey dan Agar Darah untuk kemudian dihitung koloni
yang tumbuh. Uji Angka Lempeng Total atau disebut juga TPC (Total Plate
Count) menggunakan media padat dengan hasil akhir berupa koloni yang dapat
diamati secara visual berupa angka dalam koloni (cfu) per ml/g atau
koloni/100ml. Prinsip pengujian Angka Lempeng Total menurut metode Analisis
Mikrobiologi (MA PPOM 61/MIK/06) yaitu pertumbuhan koloni bakteri aerob
mesofil setelah cuplikan diinokulasikan pada media lempeng agar dengan cara
tuang dan diinkubasi pada suhu yang sesuai. Perhitungan dilakukan setelah
diinkubasi selama 24 jam untuk seluruh koloni yang tumbuh. Satuan koloni
ditetapkan berdasarkan jumlah koloni per 10 gram sampel. Idealnya jumlah koloni
per-petri yang boleh dihitung yaitu antara 30300 cfu (colony form unit). Koloni
besar, kecil, menjalar dianggap berasal dari satu bakteri. Perhitungan dapat
dilakukan secara manual dengan memeberi tanda titik dengan me nggunakan
spidol pada petri disk atau dengan menggunakan colony counter (Unila,tt).
3.6 Identifikasi Bakteri
Identifikasi bakteri adalah suatu cara yang dilakukan untuk menentukan
jenis dan golongan bakteri yang tumbuh pada media/lingkungan. Metode
pemeriksaan bakteri terdiri dari:
1. Pewarnaan Gram adalah pewarnaan bakteri untuk membedakan bakteri
Gram posotif (berwarna ungu) dan bakteri Gram negatif (berwarna
merah).
2. Uji biokimia bakteri adalah salah satu cara identifikasi terhadap morfologi
dari suatu biakan bakteri. Proses biokimia pada makhluk hidup erat
kaitannya

dengan

metabolisme

sel,

reaksi

kimia

tersebut

akan

menghasilkan energi dan akan menggunakan energi untuk sintesis

komponen-komponen sel serta kegiatan seluler, seperti pergerakan. Suatu
bakteri

tidak

dapat

diidentifikasi

hanya

berdasarkan

sifat-sifat

morfologinya saja, sehingga perlu diteliti sifat-sifat biokimia dan faktorfaktor yang mempengaruhi pertumbuhannya. Ciri fisiologi ataupun
biokimia merupakan kriteria yang amat penting di dalam identifikasi
spesimen bakteri yang tidak dikenal karena secara morfologis biakan
ataupun sel bakteri yang berbeda dapat tampak serupa, tanpa hasil
pengamatan fisiologis yang memadai mengenai kandungan organik yang
diperiksa

maka

penentuan

spesiesnya

tidak

mungkin

dilakukan.

Karakterisasi dan klasifikasi sebagian mikroorganisme seperti bakteri

dapat

didasarkan

pada

reaksi

enzimatik

maupun

biokimia.

Mikroorganisme dapat tumbuh pada beberapa tipe media yang

memproduksi tipe metabolit yang dapat dideteksi dengan reaksi antara
mikroorganisme dengan reagen test yang dapat menghasilkan perubahan
warna reagen (Wikipedia.org).
Uji biokimia ini terdiri dari:
a. Uji gula-gula adalah uji untuk identifikasi bakteri yang mampu
memfermentasi karbohidrat. Pada uji gula-gula hanya terjadi
perubahan warna pada media glukosa yang berubah menjadi warna
kuning, artinya bakteri ini membentuk asam dari fermentasi
glukosa. Pada media glukosa juga terbentuk gelembung pada
tabung durham yang diletakkan terbalik didalam tabung media,
artinya hasil fermentasi berbentuk gas.
Reaksi fermentasi gula yaitu:
C6H12O6
C2H5OH + CO2 + asam
b. Uji reduksi nitrat ditandai dengan terbentuknya warna merah muda
setelah menambahkan reagen uji yang menunjukkan nitrat
tereduksi menjadi nitrit.
c. Uji Oksidase adalah uji untuk menentukan kemampuan
bakteri melakukan oksidasi.
d. Uji Katalase
e. Uji Indol adalah uji untuk menentukan kemampuan bakteri
dalam menghasilkan indol dengan tryptophan.

3.6.1 Pewarnaan Gram

Salah satu pewarnaan yang paling banyak dipergunakan adalah pewarnaan
Gram yang dikembangkan oleh Christian Gram (1884) yang kemudian lebih
disempurnakan secara bertahap. Adapun tahapan-tahapan pewarnaan Gram itu
menghasilkan dua kelompok besar jasad (bakteria) yaitu, Gram positif dan Gram
negatif. Hasil Gram positif dan Gram negatif ini disebabkan oleh perbedaan
kandungan dinding sel bakteria, yaitu bahwa kandungan senyawa peptidoglikan
pada dinding sel Gram positif lebih tebal dibandingkan dengan dinding sel Gram
negatif.
Sistem pewarnaan Gram dilaksanakan berdasarkan tahapan yang sudah
ditentukan di dalam penggunaan pewarna ataupun pelunturannya sesuai dengan
tabel di bawah:
Tabel III.4 Tahapan Pewarnaan Gram
Tahapan

Perlakuan

Pewarnaan awal
Mordan
Dekolorisasi
Zat warna lawan

Kristal Violet (1 menit)

Larutan Lugol (30 detik)
Etanol 95% (10-20 detik)
Safranin (20-30 detik)

Hasil Pewarnaan
Gram (+)
Gram (-)
Warna ungu
Warna ungu
Warna tetap
Warna tetap
Warna tetap
Tidak berwarna
Ungu muda
Warna merah

(Sumber: Unus, tt. Pengantar Mikrobiologi Umum)

3.6.2 RapID test

Untuk sistem identifikasi manual telah tersedia uji gula gula yang sudah siap
digunakan yaitu RapID Systems yang hasilnya dapat diketahui dalam 4 jam.
Sistem ini merupakan sistem yang berdiri sendiri atau untuk melengkapi sistem
otomatis ketika menguji Staphylococci, bakteri anaerob, Enterobacteriaceae,
Neisseria-Haemophillus, non-fermentore, Streptococci, dan ragi.
Setiap panel terdiri satu seri dari test biokimia. Tidak seperti metode
alternatif lainnya, RapID tidak bergantung pada tumbuhnya mikroorganisme, tapi
dari deteksi spesifik enzim. Sebagai hasilnya setiap panel dapat diinkubasi secara
anaerobik, menghemat waktu dan biaya. Metode inokulasi pada setia test
membuat prosedur lebih mudah dan tidak membutuhkan banyak waktu.

Sistem RapID dilengkapi oleh software ERIC (Electronic RapID

Compendium) yang user friendly dan windows base. Database yang ada
mengakibatkan analisa lebih akurat. Sampai saat ini data base pada software telah
mencapai lebih dari 400 mikroorganisme yang berbeda. Adapun kelebihan dari
mengunakan RapID System ini adalah:
1. Mengidentifikasi dengan cepat berbagai organisme yang luas.
2. Memberikan ukuran reaksi reaksi biokimia tunggal.
3. Inokulasi satu langkah yang sederhana hanya menuang dan
memiringkan.
4. Hasil-hasil yang cepat- hanya empat jam inkubasi aerobik.
5. Mudah membaca hasil reaksi reaksi warna yang khusus dengan
hasil hasil yang pasti.
6. Hasil uji ditafsirkan oleh software ERIC atau perbandingan terhadap suatu
RapID Compendium.
7. Database yang luas dan diperbaharui memberikan kemungkinankemungkinan identifikasi yang lebih.
3.6.3 BBL Crystal Identification System
BBL Crystal Identification System adalah miniature metode identifikasi
bakteri menggunakan alat yang merupakan modifikasi metode konvensional,
menggunakan substrat fluorogenik dan chromogenic. BBL Crystal Identification
System terdiri dari BBL Crystal Gram-Positive, BBL Crystal Enteric
Nonfermenter, BBL Crystal Anaerob (Dickinson, USA).
3.6.4 Nefelometer
Nefelometer adalah alat yang digunakan untuk menguji angka kekeruhan
suatu cairan/suspensi. Adapun standar yang digunakan untuk pemakaian alat ini.
Standar yang digunakan inoculum fluid jika alat ini digunakan untuk
mengidentifikasi angka kekeruhan pada bakteri. Satuan dari angka kekeruhan ini
adalah McFarland.
3.7 Evaluasi Mikroflora Lingkungan
Evaluasi mikroflora lingkungan adalah suatu metode yang dilakukan pada
sampel yang positif mengandung mikroorganisme kemudian diidentifikasi dan
hasilnya akan dijadikan isolate lingkungan untuk disimpan. Setiap bakteri yang

muncul pada sampel, dilakukan entry data kemudian di evaluasi setiap tahun.
Berikut adalah langkah yang dilakukan untuk evaluasi mikroflora:
1. Isolat lingkungan yang muncul disimpan oleh bagian Pengujian Mutu
Mikrobiologi.
2. Evaluasi terhadap mikroflora lingkungan dilakukan per tahun, untuk
mikroflora yang terbanyak muncul akan digunakan sebagai kontrol
positif uji growth test di tahun berikutnya.