Pewarnaan Dan Cara-Cara Pewarnaan
Pewarnaan Dan Cara-Cara Pewarnaan
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Pengenalan bentuk (morfologi) mikroba, kecuali untuk kelompok mikroalga,
harus dilakukan melalui pewarnaan terlebih dahulu. Karena tanpa melalui
pewarnaa bentuk tersebut tidak akan dapat diamati secara jelas.
Pewarnaan atau pengecatan terhadap mikroba, banyak dilakukan secara
langsung bersama (bahan yang ada) ataupun secara tidak langsung (melalui
biakan murni).
Pewarna yang digunakan pada umumnya berbentuk senyawa kimia khusus
yang akan memberikan reaksi kalau mengenai bagian tubuh jasad. Karena
pewarna tersebut berbentuk ion yang bermuatan positif atau negatif.
Sel bakteri bermuatan mendekati negatif kalau dalam keadaan pH mendekati
netral. Sehingga kalau kita memberikan pewarna yang bermuatan positif,
misalnya metilen biru, hasil pewarnaan akan jelas.
Secara kimia, zat warna dapat digolongkan dalam senyawa basa dan senyawa
asam. Jika warna terletak pada muatan positif maka senyawa tersebut dinamakan
zat warna basa. Sebaliknya jika warna terdapat pada ion bermuatan negatif maka
senyawa tersebut dinamakan zat warna asam.
Contoh zat warna basa misalnya : metilen biru, safranin, merah netral dan
sebagainya, dengan anionnya adalah Cl-, SO2-4, CH3COO-, CO-OHOO- dan
sebagainya. Sedang zat warna asam misalnya Na eosinat, eosin, fukhsin, fukhsin
asam, merah kongo dan sebagainya, dengan kationnya adalah Na+, K+, Ca2+, NH3+.
Di samping zat warna asam dan zat warna basa juga didapatkan zat warna
indiferen seperti suddan III, dimetil amid azo benzol dan zat warna netral seperti
eosin metilen biru.
Salah satu sifat dan zat warna asam pada umumnya mempunyai sifat
bersenyawa lebih cepat dengan bagian-bagian sitoplasma, sedang zat warna basa
mudah bereaksi dengan bagian-bagian inti sel.
-1-
-2-
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
1.
Pewarnaan Sederhana
Pada pewarnaan sederhana hanya digunakan hanya 1 macam zat warna saja
Pewarnaan Negatif
Seperti jelas tercemin dari namanya, metode ini bukan untuk mewarnai
bakteri, tetapi hanya mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Metode ini
meliputi pencampuran mikroorganisme di dalam setetes tinta nigrosin lalu
menyebarkannya di atas sebuah kaca obyek yang bersih. Pada pewarnaan ini
mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang) dan tampak jelas di
anatara medan yang gelap karena pewarna-pewarna tersebut tidak menembus
mikroorganisme. Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel.
-3-
b.
c.
d.
-4-
Pewarnaan Gram
Pada tahun 1884, seorang bakteriologiwan Denmark Christian Gram secara
b.
diketahui bahwa komposisi dinding sel bakteri Gram positif berbeda dari bakteri
Gram negatif dan ini diduga berperanan dalam terjadinya reaksi Gram yang
berbeda-beda.
Faktor faktor yang juga dapat menimbulkan keragaman dalam reaksi gram
ialah :
a. Pelaksanaan fiksasi panas terhadap olesan.
b. Kerapatan sel terhadap olesan.
c.
Pewarnaan Spora
Jenis-jenis bakteri tertentu, terutama yang tergolong ke dalam genus
Bacillus dan Clostridium, membentuk suatu struktur di dalam sel pada tempat-
-5-
tempat yang khas, disebut endospora. Endospora dapat bertahan hidup dalam
keadaan kekurangan nutrient, tahan terhadap panas dan unsur-unsur fisik lainnya
seperti pembekuan, kekeringan, radiasi ultraviolet serta terhadap bahan-bahan
kimia yang dapat menghancurkan bakteri yang tidak membentuk spora.
Ketahanan tersebut disebabkan oleh adanya selubung spora yang tebal dank eras.
Endospora merupakan bentuk kehidupan yang paling resisten yang diketahui
sejauh ini; organisme yang bersangkutan dapat bertahan dalam debu dan tanah
selama bertahun-tahun. Misalnya, adanya endospora dalam debu menjelaskan
mengapa Bacillus merupakan kontaminan umum dalam laboratorium.
Sifat endospora yang demikian itu menyebabkan dibutuhkannya perlakuan
yang keras untuk mewarnainya. Prosedur pewarnaan Gram misalnya, tidak dapat
mewarnainya. Hanya bila diberi perlakuan panas yang cukup, pewarna yang
sesuai dapat menembus endospora. Tetapi, sekali pewarna tersebut memasuki
endospora, sukar dihilangkan. Ada dua metode yang umum dipakai, yaitu metode
Schaeffer-Fulton dan metode Dorner. Yang akan anda pakai disini adalah metode
yang pertama (lihat prosedur). Metode Dorner menggunakan nigrosin dan
menghasilkan spora berwarna merah dan sporangium yang tak berwarna.
Ukuran dan letak endospora di dalam sel merupakan ciri-ciri yang
digunakan untuk membedakan spesies-spesies bakteri yang membentuknya.
Spora pada bakteri merupakan struktur yang tahan-panas dan bahan kimia.
Spora dibentuk oleh bakteri tertentu untuk mengatasi lingkungan yang tidak
menguntungkan bagi bakteri. Contoh bakteri pembentuk spora adalah Bacillus,
Clostridium, Thermoactinomyces, dan Sporosarcina. Spora terbentuk dalam sel
sehingga seringkali disebut sebagai endospora ; dalam sel bakteri hanya terdapat 1
spora. Spora ini tidak berfungsi untuk reproduksi.
Dalam lingkungan yang menguntungkan spora bergerminasi kembali
menjadi seperti vegetatif, sebaliknya jika tidak menguntungkan sel vegetatif
berubah menjadi spora. Lingkungan yang tidak menguntungkan disebabkan
langkanya sumber karbon, energi, atau fosfat. Selain itu bahan yang bersifat
toksik, suhu yang tidak sesuai, atau lingkungan yang kering (hipotonik)
menginduksi pembentukan spora. Spora tahan terhadap suhu dan bahan kimia
-6-
yang mematikan sel vegetatif. Sebagai contoh, spora Clostridium botulinum tahan
terhadap suhu mendidih selama beberapa jam. Kekeringan dan kekurangan zat
hara tidak menyebabkan kematian spora; spora dapat bertahan dalam tanah selama
puluhan tahun. Spora juga tahan terhadap sinar ultra violet dan antibiotika yang
mematikan sel vegetatif.
Lingkungan yang menguntungkan menggertak spora menjadi sel vegetatif;
proses ini disebut germinasi . Germinasi ditandai kepekaan terhadap suhu panas,
bahan toksik dan kimiawi, antibiotik dan sinar ultra violet.
Lapisan luar spora merupakan penahan yang baik terhadap bahan kimia,
sehingga spora sukar diwarnai. Spora bakteri dapat diwarnai dengan dipanaskan.
Pemanasan menyebabkan lapisan luar spora mengembang, sehingga zat warna
dapat masuk.
-7-
BAB III
METODOLOGI PERCOBAAN
3.1.2
Objek gelas
Lampu bunsen
Mikroskop
Jarum ose
Pipet tetes
Cawan Petri
Penjepit Kayu
Bahan
-
Aquadest
Alkohol 95 %
Larutan Safranin
Kertas Saring
Pewarnaan Sederhana
-8-
Pewarnaan Negatif
1. Dibersihkan objek gelas dengan alkohol hingga bebas lemak,
kemudian difiksasi diatas nyala lampu spiritus.
2. Setelah dingin, diambil suspensi biakan murni Bacillus sp dengan ose
secara aseptis dan diletakkan diatas objek gelas.
3. Kemudian diambil sedikit zat warna tinta cina dengan batang gelas dan
dicampur dengan suspensi bakteri yang telah diletakkan diatas objek
gelas.
4. Campuran bakteri dengan larutan tinta cina ini kemudian diratakan
dengan batang gelas hingga merupakan lapisan yang tipis sekali.
5. Selanjutnya preparat dikeringkan, dianginkan.
6. Diamati di bawah mikroskop dengan kuat, sel sel bakteri akan
tampak transparant dengan latar belakang hitam (gelap).
3.2.3
Pewarnaan Gram
-9-
Pewarnaan Spora
1. Dibuat preparat ulas lalu ditutup dengan secarik kertas saring
2. Diteteskan 2-3 tetes malachite green
3. Dilewatkan slide di atas api selama 5 menit hingga uap terlihat dan
tidak sampai mengering
4. Diamkan selama 1 menit kemudian dibuang kertas saring dan dibilas
dengan akuades
5. Diteteskan safranin selama 30 detik dan dikeringkan tanpa difiksasi
6. Diamati di bawah mikroskop spora akan berwarna hijau, dan bagian
lainnya atau sel vegetatif berwarna merah.
BAB IV
- 10 -
Keterangan
Bakteri
: Bacillus subtilis Sp
Warna
: Ungu
Bentuk
: Batang
Perbesaran : 1000 x
2. Pewarnaan Negatif
Keterangan
Bakteri
: Bacillus subtilis Sp
Warna
Bentuk
: Batang
3. Pewarnaan Gram
Keterangan
Bakteri
: Bacillus subtilis Sp
Warna
: Ungu
Bentuk
: Batang
Perbesaran : 1000 x
Keterangan
Bakteri
: Escherichia coli Sp
Warna
: Kemerah-merahan
- 11 Bentuk
: Bulat
Perbesaran : 1000 x
4. Pewarnaan Spora
Keterangan
Bakteri
: Bacillus subtilis Sp
Warna
Bentuk
: Batang
4.2 Pembahasan
Sesuai dengan jenisnya, pewarnaan terhadap mikroba ada dua kelompok
besar, yaitu :
1. Pewarnaan tunggal atau pewarnaan sederhana, yaitu cara pewarnaan yang
hanya menggunakan satu jenis pewarna saja, misalnya dengan metilen biru,
gentiana violet, fuhsin basa dan safranin.
2. Pewarnaan bertingkat yaitu cara pewarnaan dengan menggunakan beberapa
jenis pewarna secara bertahap. Ini mengingat bentuk dan sifat sel mikroba
yang berbeda penerimaannya terhadap pewarna, sehingga pada akhirnya cara
pewarnaan bertingkat ini dapat pula dipergunakan sebagai salah satu cara
untuk membedakan kelompok mikroba.
Adapun tujuan dari pewarnaan adalah :
1. Mempermudah melihat bentuk jasad, baik bakteri, ragi ataupun jamur.
2. Memperjelas ukuran dan bentuk jasad.
3. Melihat struktur luar dan kalau memungkinkan struktur dalam.
- 12 -
4. Melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat-sifat fisik
dan kimia yang ada akan dapat diketahui.
Ada beberapa faktor-faktor penentu keberhasilan dalam pewarnaan mikroba
adalah :
1. Fiksasi
Yang dilakukan sebelum zat warna digunakan. Dimana fiksasi ini bertujuan
untuk :
1. Melekatkan sel pada gelas objek.
2. Membunuh mikroba, karena sel dalam keadaan mati lebih mudah diwarnai
daripada sel dalam keadaan hidup.
3. Melepaskan granular protein menjadi gugus reaktif NH3 yang akan
bereaksi dengan gugus OH- dan zat warna.
4. Mencegah terjadinya otolisis sel, yang proses pecahnya sel yang
disebabkan oleh enzim yang ada di dalamnya.
5. Merubah daya ikat zat warna.
Fiksasi dapat dilakukan secara fisik dengan pemanasan ataupun
pengeringan secara dingin, sedang yang paling umum dilakukan secara
kimia dengan penambahan sabun, formalin, fenol dan sebagainya.
2. Peluntur warna
Bermaksud untuk menghilangkan warna sel yang telah diwarnai. Senyawa ini
digunakan untuk menghasilkan keadaan yang kontras pada sel mikroba
sehingga dengan jelas dapat dilihat di bawah mikroskop misalnya, sel mikroba
yang mudah diwarnai akan lebih cepat pula dilunturkan, sedang sebaliknya sel
mikroba yang sukar diwarnai akan sulit pula untuk dilunturkan.
3. Substrat
Yang berhubungan dengan kandungan sel yang terdiri dari karbohidrat,
protein, lemak dan asam nukleat. Zat warna asam ataupun basa yang dapat
bereaksi dengan isi sel akan dipengaruhi oleh kehadiran senyawa diatas,
apakah menjadi cepat atau lambat. Sehingga berdasarkan komposisi selnya,
sel tersebut dapat dibagi menjadi sel yang asidofilik, sel basofilik dan sel
sudanofilik. Ini berarti bahwa sel asidofilik dapat mengikat zat warna asam,
- 13 -
sel basofilik dapat mengikat zat warna basa dan sudanofilik yang larut dalam
minyak.
4. Intensifikasi pewarnaan
Bermaksud untuk mempercepat pewarnaan mikroba, misalnya dengan
penambahan mordan, sehingga zat akan terikat lebih kuat dalam jaringan.
Mordan juga sesuai dengan sifatnya terbagi menjadi mordan asam, yaitu yang
dapat bereaksi dengan zat warna basa, missal asam tannin dan asam pikrat.
Kedua mordan basa, yaitu yang dapat bereaksi dengan zat warna asam, missal
FeSO4,
K-antomonium,
asetil
pirimidnium
khlorida.
Selain
dengan
Sp,
BAB V
- 14 -
PENUTUP
5.1 Kesimpulan
Setelah menyelesaikan percobaan ini, dapat ditarik kesimpulan yaitu :
1.
2.
3.
5.2 Saran
Dalam melakukan percobaan ini sebaiknya jarum ose yang digunakan harus
disterilkan terlebih dahulu dengan dipanaskan di atas lampu spiritus agar mikroba
yang akan diamati dapat sesuai dengan yang diharapkan.
Daftar Pustaka
- 15 -
Pelczar, M.J, dan Chan, E.C.S., 1986. Dasar-dasar Mikrobiologi. Jilid 1. Penerbit
UI : Jakarta
Suriawiria, Unus. 2005. Mikrobiologi Dasar. Papas Sinar Sinanti: Jakarta
Waluyo, Lud. 2004. Mikrobiologi Umum, Universitas Muhammadiyah Malang :
Malang
- 16 -
LAPORAN PRAKTIKUM
BIOLOGI DAN MIKROBIOLOGI
Pewarnaan dan Cara-cara Pewarnaan
DISUSUN OLEH :
KELOMPOK III :
Mery Natalia M.S
Munaji Mahbub Afif
Ni Luh Juniati
Suitsi Siswanto
Uswatun Hasanah
Windra Anjas
UNIVERSITAS MULAWARMAN
2007
- 17 -