2.

4 Kerangka Konsep

Fibroblast

LPS

Gingiva

Kopi hitam

Kadar kafein tinggi

Polifenolrendah
Asam klorogenik
rendah

Respon
Peradangan
Pembentukan sitokin
pro-inflamasi TNF-

Kopi dekafein

Kadar kafein rendah

Polifenol tinggi
Asam klorogenik
tinggi

PGE2

IL-1

osteoclas

Proliferasi osteoclastic

NFKB dan MAPKs

progenitor cell

Destruksi jaringan
periodontal
Gambar/Skema

: Efek Respon Peradangan pada Kopi Dekafein dan Kopi Robusta.

Penjelasan Kerangka Konsep :

Fibroblas adalah Elemen selular yang banyak ditemukan dari jaringan ikat gingiva
adalah fibroblas (Itoiz dan Carranza, 1996). Fibroblas secara normal hanya menunjukkan
pertumbuhan yang minimal pada jaringan ikat dewasa, namun pada kondisi patologis dan
selama penyembuhan luka, fibroblas teraktivasi untuk meningkatkan level proliferasi dan
sintesis (Ross, 1968 sit Ko et al., 1981).
Bakteri gram negatif memiliki lipopolisakarida(LPS) pada dinding selnya. LPS
memiliki potensi yang kuat sebagai stimulator inflamasi apabila di injeksikan secara in vivo
karena LPS mampu menembus ke dalam jaringan periradikuler dan bertindak sebagai
endotoksin dama organisme inangnya sehingga menyebabkan peradangan. LPS berikatan
dengan lipoliskarida binding protein, terjadi suatu kompleks Keradangan akut akan berlanjut
menjadi keradangan kronik apabila sel pertahanan host tidak dapat mencapai sumber iritasi
sehingga tubuh tidak mampu untuk menghilangkan infeksi ( Yustiana dkk., 2012).
Respon keradangan awal dimulai saat LPS berikatan dengan lipoliskarida binding
protein membentuk suatu komplek molekul. Komplek molekul tersebut akan dikenali oleh
CD14 yang terletak pada permukaan sel target, kemudian dikenali oleh makrofag melalui
reseptor TLR4. Reseptor inilah yang akan mengkatifkan makrofag sebagai respon imun
adaptif dengan pembentukan sitokin proinflamatory. Sitokin yang berperan dalam dektruksi
jaringan periodontal adalah TNF- dan IL-1 yang akan meningkatkan regulasi receptor
activator
of
nuclear
factor
kB
ligand
(RANKL)
di
osteoblas
dan
matrixmetaloproteinase(MMP) di fibroblas.RANKL akan berikatan dengan RANK sebagai
proses awal detruksi tulang. Ikatan ini akan menginduksi TNF-reseptror associated factor-6
(TRAF 6) sebagai faktor kunci proses transkripsi osteoklas. TRAF6 akan mengaktivasi NF KB
dan MAPKs yang sangat penting dalam diferensiasi osteoklas. NFKBdan MAPKs kemudian
akan menginduksi faktor NFATc1 dengan adanya activator protein 1 (AP1), IKKs melalui
CFOs. NFATc1 yang aktif akan meregulasi sejumlah gen spesifik osteoklas seperti catepsin
K, tertrase resistance acid phosphate (TRAP), reseptor calsitonin, osteoclast-associate
reseptor (OSCAR) dan 3-integrin. Faktor NFATc1 memegang peranan penting dalam proses
osteoklastogenesis. Osteoklas akan mengadakan deferensiasi oleh karena adanya transkripsi
faktor yaitu cyclic AMP responsive-element-binding protein (CREB), microphtalmiaassociated transkrcription factor(MITF) dan PU1. Meningkatnya proses diferensiasi
osteoklas dipengaruhi oleh adanya fusi RANK dipermukaan sel percursor osteoklas. Hal ini
menyebabkan pematangan sel osteoklas, sehingga terjadi resopsi tulang (Takayanagi,
2007).Memiliki kandungan kafein, asam klorogenik, polifenol. Kopi jenis robusta
mengandung kafein dalam kadar yang jauh lebih banyak (Kurniawan, 2013). Asam
klorogenik merupakan asam organik non-volatil yang mampu mencegah pertumbuhan bakteri
gram positif dan negatif, senyawa antibakteri tersebut bekertja dengan cara masuk ke dalam
sel dan merusak struktur dinding sel bakteri ( Chamidah, 2012). Polifenol merupakan
antioksidan yang terbukti mampu mencegah peningkatan produksi sitokin inflamasi (IL-1,
IL-6, IL-8 dan TNF-) oleh sel makrofag dan limfosit yang teraktivasi oleh radikal bebas dan
secara teoritis dapat mempengaruhi respon inflamasi.Kopi memiliki daya antibakteri
kandungan kafein, memiliki peran penting dalam pengembangan dan resistensi kekebalan
tubuh melawan bakteri (Ramanavivience et al., 2003). namun, karena kafein memiliki
dampak negatif bagi kesehatan digunakan kopi dekafein sebagai terapi inflamasi.

2.5 Hipotesa
Konsumsi minumankopi dekafein dapat menurunkan pada ekspresi TNF- yang di
papar oleh LPS

BAB 1
PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Kopi diminum oleh konsumen bukan sebagai sumber nutrisi melainkan sebagai
minuman penyegar. Penikmat kopi yang memiliki toleransi tinggi, kafein akan
membuat tubuh menjadi lebih segar. Kafein di dalam biji kopi diduga dapat
menyebabkan beberapa keluhan terutama bagi penikmat kopi yang memiliki toleransi
rendah terhadap kafein, salah satu upaya agar kopi dapat dijangkau oleh semua
penikmat kopi maka dilakukanlah proses dekafeinasi (Sukrisno et al., 2009). The
International Standards Organisation (ISO 3509-1989) mendefinisikan bahwa kopi
dekafein adalah kopi yang dilakukan proses dekafeinisasi sehingga kadar kafein
rendah. Kopi dekafein biasanya terdapat sedikit perbedaan rasa dan juga aroma, hal
tersebut tergantung dari proses dekafeinasi. Kopi dekafein warna biji kopinya setelah
melalu proses dekafeinasi terlihat jauh lebih gelap dibandingkan kopi kafein. Kopi
dekafein terdapat padatan terlarut jauh lebih sedikit dibandingkan dengan kopi
berkafein (Ramalaksmi & Raghvan, 2010). Kandungan yang dimiliki kopi bermanfaat
bagi tubuh namun kafein pada kopi dapat bersifat toksik apabila dikonsumsi secara
berlebihan, untuk itu para ahli melakukan penelitian tentang pengurangan kadar
kafein dalam kopi (Ramalakshmi & Raghavan, 2010). Kopi saat ini mulai banyak
dikembangkan sebagai obat kumur untuk terapi kontrol plak (Julia, 2015), selain itu
kopi juga dapat digunakan sebagai obat antibiotik dan sebagai obat terapi lainnya
(Yaqin & Nurmilawati, 2015).
Kopi secara alami mempunyai kandungan sebagai antioksidan seperti kafein,
senyawa fenolik, trigonelin, dan asam chlorogenik yang memiliki sifat anti bakteri
dan anti inflamasi (Farah, 2008).Kafein adalah senyawa alkaloid pada kopi, beberapa
orang alergi terhadap kafein. Kafein dapat berdampak pada sistem kardiovaskular
dengan terjadi peningkatan tekanan darah dan output jantung. Kafein dapat
mempengaruhi siklus sel, menginduksi kematian sel terprogram/apoptosis dan
menganggu protein regulator kunci, termasuk protein penekan tumor p53. p53
memiliki pengaruh besar apakah sel akan hidup/mati. Kerusakan DNA jika
berlangsung terus-menerus maka kerusakan DNA akan meluas dan sel yang terkena
akan mengalami apoptosis. Siklus sel penangkapan dan apoptosis biasanya dimediasi

oleh aktivitas p53 (Ann and zigang, 2007). Chlorogenic acid mampu memblokade
translokasi NFKB oleh LPS (Kim et al., 2013). Kandungan lain pada kopi adalah
adanya polifenol. Polifenol merupakan antioksidan kuat dan dapat melindungi sel
imun dari kerusakan biologis akibat radikal bebas. polifenol mampu mencegah
peningkatan produksi sitokin inflamasi, oleh makrofag dan limfosit yang teraktivasi
oleh radikal bebas (Yuniarti, 2007). Kafein, senyawa fenolik, trigonelin, dan asam
chlorogenik dapat sebagai antioksidan. Namun aktivitas antioksidan akan lebih tinggi
pada kondisi kopi yang memiliki kadar kafein yang rendah (Yashin et al., 2013).
Fibroblas merupakan elemen seluler primer pada proses perbaikan untuk
pembentukan protein struktural yang berperan penting dalam pembentukan jaringan
ikat gingiva dalam rongga mulut. Fibroblas berperan dalam proses penyembuhan luka
dan aktifitas fisiologis dari tiap jaringan dan organ tubuh. Fibroblas mudah untuk
dikultur karena memiliki kemampuan tumbuh dan melekat yang tinggi dan regenerasi
cepat. Fibroblas terlibat secara aktif dalam pembentukan serat terutama serat kolagen
dan matriks ekstraseluler lainnya(Freshney, 2005). Fibroblas akan menghasilkan
sitokin proinlflamasi seperti TNF- ketika diinduksi oleh Lipopolisakarida (Saynur et
al., 2009).
Lipopolisakarida merupakan komponen yang terdapat pada dinding sel bakteri
Gram negatif. LPS memiliki potensi yang kuat sebagai stimulator inflamasi (Kumaret
al., 2007). Respon keradangan awal dimulai ketika bakteri Gram negatif
mengeluarkan endotoksin berupa LPS. LPS yang dilepaskan berikatan dengan
lipoliskarida binding protein (LBP). Ikatan kedua komponen tersebut membentuk
suatu komplek molekul. Komplek molekul ini akan dikenali oleh CD14 yang berada
dipermukaan sel target, kemudian dikenali oleh makrofag melalui reseptor TLR4.
Reseptor inilah yang akan mengaktifkan makrofag sebagai respon imun adaptif
dengan pembentukan sitokin proinflamasi. Sitokin yang dihasilkan oleh makrofag
sebagai proses kerusakan tulang adalah IL-1 dan TNF- (Takayanagi, 2007).
TNF- merupakan sitokin inflamasi yang paling berperan pada proses inflamasi
dan dipakai sebagai indikator untuk sel yang mengalami stres oksidatif, apoptosis atau
nekrosis. Ekspresi TNF- akan meningkat pada kondisi inflamasi (Astuti, 2008).TNF disekresi utama oleh monosit dan makrofag. TNF- akan meregulasi produksi
kolagenase, PGE2, kemokin dan sitokin, molekul adhesi sel dan faktor yang
berhubungan dengan resobsi tulang (Yoshikawa et al., 2006)

Berdasarkan uraian diatas maka perlu dikaji kopi dekafein sebagai antiinflamasi dibandingkan dengan kopi hitam dan diharapkan dapat menjadi minuman
sehat.
1.2 Rumusan Masalah
Berdasarkan latar belakang diatas, maka rumusan masalah penelitian ini adalah
Apakah minuman kopi dekafein (robusta) dapat menekan ekspresi TNF- yang lebih
tinggi dibandingkan dengan kopi hitam ?
1.3 Tujuan Penelitian
1.3.1 Tujuan umum
Tujuan umum dari penelitian ini untuuk membedakan pengaruh anti-inflamasi
pada kopi dekafein dan kopi hitam
1.3.2

Tujuan Khusus
1. Mengetahui efek kopi hitam sebagai anti-inflamasi.
2. Mengetahui efek kopi dekafein sebagai anti-inflamasi.
3. Membandingkan pengaruh anti inflamasi antara kopi hitam dan dekafein.

1.4 Manfaat Penelitian

Dari hasil penelitian ini nantinya diharapkan dapat memberikan manfaat sebagai
berikut:
1.4.1 Mengetahui perbedaan pengaruh kopi dekafein dan kopi hitam terhadap
1.4.2
1.4.3
1.4.4

ekspresi TNF- pada fibroblas

Sebagai informasi ilmiah yang bermanfaat masyarakat.
Sebagai acuan dasar penelitian berikutnya.
Sebagai pencegahan dan terapi penyakit gigi dan mulut

BAB 3
METODE PENELITIAN

3.1

Jenis Penelitian

Jenis penelitian ini adalah penelitian eksperimental laboratoris in vitro

3.2

Tempat dan Waktu Penelitian

3.2.1 Tempat Penelitian

Perawatan LPS dan tahap penelitian dilaksanakan di Laboratorium Universitas
Gajah Mada. Pemeriksaan dengan metode ICC dilaksanakan di Laboratorium Fakultas
Kedokteran Gigi Universitas Jember. Pemeriksaan Kadar Kopi dilaksanakan di Laboratorium
Fakultas Farmasi Universitas Jember.
3.2.2 Waktu penelitian
Penelitian dilaksanakan pada bulan November 2016.
3.3

Sampel Penelitian

3.3.1 Bentuk Sampel

Sampel berupa sel fibroblas gingiva manusia yang telah di kultur.
3.3.2 Kriteria Sampel
Sampel harus memenuhi kriteria yang telah ditetapkan, yaitu:
a. Kriteria Inklusi
Fibroblas gingiva dalam keadaan steril tanpa terkontaminasi senyawa lain pada
media kultur
b. Kriteria Ekslusi
Fibroblas gingiva dalam keadaan terkontaminasi pada media kultur

3.3.3 Besar Sampel

Besar sampel yang digunakan dalam penelitian ini berdasarkan rumus berikut:
n=

log
log p

Keterangan:
= probabilitas melakukan kesalahan (0,05)
p = proporsi sampel yang tidak terpapar

n = jumlah sampel
Dalam penelitian ini terdapat 4 perlakuan yaitu 3 kelompok perlakuan dan 1 kelompok
kontrol sehingga nilai p yang digunakan:
1
p= =0,25
4
Maka, hasil perhitungan sampel minimal adalah sebagai berikut:
n=

log 1,301
=
log p 0.602
n =2,161
n=3

Berdasarkan perhitungan rumus tersebut, maka didapatkan besar sampel minimal dalam
penelitian ini adalah 3 sampel kultur fibroblas.
3.4

Identifikasi Variabel Penelitian

3.4.1 Variabel Bebas

Variabel bebas dalam penelitian ini adalah kopi dekafein Robusta dan kopi hitam
robusta
3.4.2 Variabel Terikat
Variabel terikat dalam penelitian ini adalah sel fibroblas
3.4.3 Variabel Terkendali
a. Alat dan bahan
b. Sterilisasi alat dan bahan
c. Prosedur penelitian diamati selama 24 jam, 48 jam, 72 jam

3.5

Definisi Operasional Penelitian

3.5.1 Kopi dekafein

Kopi dekafein merupakan kopi yang telah mengalami proses dekafeinasi. Dekafeinasi
pada sampel menggunakan metode dari Politeknik Negeri Malang. Dekafeinasi menggunakan
proses swiss water untukmengurangi kadar kafein dalam kopi sehingga konsumen dapat
menikmati flavor dan rasa khas dari kopi tanpa efek stimulan, metode terlampir. Berdasarkan
legislasi dari pasar European Union, pengurangan kadar kafein pada kopi sangrai adalah
sebesar 0.1% dan 0.3% pada kopi instan.

3.5.2 Fibroblas gingiva

Fibroblas gingiva adalah komponen seluler primer yang langsung diambil dari jaringan
gingiva pada rongga mulut manusia dan dilakukan kultur sesuai dengan metode yang telah
terlampir.
3.5.3 Lipopolisakarida (LPS)
Lipopolisakarida/ endotoksin LPS merupakan komponen struktural dari membran luar
bakteri gram negatif. LPS diperoleh dari sigma adriel, Jerman
3.5.4Tumor Necrosis Factor- (TNF-)
TNF- merupakan sitokin pro-inflamasi yang diperiksa di antibodi anti TNF- dari
abcam
3.6

Rencangan Penelitian
Rancangan penelitian yang digunakan adalah the pre test and the post test control

group design yaitu dengan melakukan pengamatan atau pencatatan sebelum dan setelah
perlakuan dan hasilnya dibandingkan dengan kontrol (Notoatmojo, 2005).
3.7

Alat dan Bahan Penelitian

3.7.1 Alat Penelitian

a. Alat pembuatan kultur fibroblas
Gunting, syringe, petridish, deckglass, inkubator CO2/ anaerobic gas pack 5%,
mikroskop inverted, tabung sentrifugasi, flask kultur
b. Alat pembuatan sediaan LPS
Syringe, tabung reaksi
c. Alat pembuatan Kopi dekafein
Neraca timbangan, gelas kimia, whatman, oven
d. Alat untuk tahap immunocytochemstry
Cover slip, inkubator CO2/ anaerobic gas pack 5%, deck glass
e. Alat untuk tahap Immunohistaining
Plastic microplate (24 wells), Cover slip, Inkubator CO2/ anaerobic gas pack 5%,
Inkubator Shaker
f. Alat untuk penghitungan jumlah sampel yang akan digunakan sampel
Flask, Inkubator, Tabung sentrifugasi, Pipet pasteur, Mikroskop binokuler,
hemositometer
3.7.2 Bahan Penelitian
a. Bahanisolasi dan pembuatan kultur fibroblas
Sel fibroblas dari Jaringan gingiva yang berasal dari potongan sisa pencabutan yang
menempel pada permukaan gigi yang telah dicabut, betadine, antibiotik, Media DMEM,
Tripsin

b. bahan pembuatan sediaan LPS

LPS E.Coli (sigma), Larutan salin
c. Bahan pembuatan kopi dekafein Kopi bubuk robusta berat 251,23 g, Dichloromethane,
Pelarut metanol
d. Bahan untuk tahap immunocytochemstry
Antibodi primer (TNF-), PBS, Biotinylated Goat Anti-Polyvalent, Streptavidin
peroxidase, Pewarna kromogen DAB (1,3- diamino benzidin), Aquades, Etanol absolute,
e.

Xylol, Etelen, Methanol absolute, H2O2, Sel fibroblas (105 sel)

Bahan untuk penghitungan jumlah sampel yang akan digunakan sampel
Tripsin,Media kultur sel fibroblas 1mL
1.7 Prosedur Penelitian
Prosedur penelitian meliputi :
1. Isolasi dan pembuatan kultur sel fibroblas
Sel fibroblast di peroleh dari jaringan gingiva yang berasal dari potongan gingiva
sisa pencabutan yang menempel pada permukaan gigi yang telah dicabut.
1. Asepsis daerah gingiva yang akan digunakan sebagai sampel dengan betadin
2. Blok anastesi
3. pengambilan jaringan gingiva
4. jaringan gingiva yang terambil langsung masuk media DMEM,
5. sampel dipotong kecil-kecil dengan gunting dengan ukuran 1 mm 3 dan
ditempatkan dalam petridish.
6. Potongan jaringan gingiva dimasukkan petridish ditutup dengan deckglass,
diberi larutan media dan diinkubasi ke dalam inkubator CO2 / anaerobic gas
pack 5%, pada suhu 37oC selama 4 hari.
7. Media kultur sel dibuang dan diganti dengan media kultur sel yang segar
setiap 2-4 hari,
8. Pengamatan dilakukan di bawah mikroskop inverted apabila ada kontaminan.
9. Setelah konfluent 80% dilakukan passase.
10. Selanjutnya, potongan jaringan dibuang setelah mencapai kofluensi yang
diharapkan (80%), serta media kultur diganti dengan yang baru (2 mL) dan
ditambahkan antibiotik (3L Gentamycin) agar terbebas dari kontaminan.
11. Kemudian dibuat kultur sel primer dengan cara : media kultur sel dalam
petridish dibuang, diberi tripsin lalu disimpan dalam inkubator selama 10
menit.
12. Suspensi sel dan tripsin dipindahkan ke dalam tabung sentrifugasi dan diisi
DMEM sampai 15 L serta disentrifugasi 7 menit.
13. Sel yang melekat didasar tabung dipindahkan ke flask kultur.
(Tantin Ernawati, 2015 dan Agustin Wulan Damayanti, 2016)

2. Pembuatan Sediaan Lipopolisakarida (LPS)

LPS yang digunakan adalah LPS E.coli (Sigma) yang digunakan untuk
pemaparan terhadap sel fibroblas untuk menginduksi adanya inflamasi.
Pembuatan stok LPS didapatkan dengan cara 1mg/ml LPS. 1 mg LPS dilarutkan
dalam 1 ml larutan salin. Konsentrasi LPS yang dipaparkan adalah sebanyak 50
L/well.(Tantin Ernawati, 2015)
3. Prosedur Pembuatan Kopi dekafein
Metode ini dikembangkan di Swiss dan telah dipatenkan sehingga disebut
proses Swiss Water (Swiss Water Process). Proses ini berlangsung selama 8 jam,
sampai biji kopi 99,9% bebas kafein. Prinsip dari metode ini adalah ketika biji
kopi diseduh di dalam air, kafein akan terlarut di dalam air akan tetapi akan
terjadi kehilangan senyawa aromatik dari kopi sehingga untuk menanggulangi ini
digunakan activated carbon untuk menyerap kafein sehingga ekstrak kopi bebas
kafein dapat diproses kembali. Prosedur dari metode ini ialah:
1

Biji kopi direndam dalam air panas sehingga flavor dan kafein terekstrak.

Biji kopi kemudian dipisahkan dari air perendamannya dihasilkan ekstrak.

3

Ekstrak kemudian dilewatkan pada karbon aktif atau arang aktif untuk
penyerapan kafein.

Ekstrak tanpa kafein (flavor-charged water) digunakan untuk merendam biji kopi
setengah kering yang telah diambil kafeinnya tadi, sehingga komponen flavor
yang terdapat dalam ekstrak kembali ke dalam biji kopi.

Dengan metode ini terjadi kehilangan beberapa komponen larut air pada biji kopi
seperti karbohidrat dan asam klorogenat.

Gambar 2. Diagram alir dekafeinasi kopi dengan metode dekafeinasi

menggunakan air
Keuntungan dekafeinasi menggunakan air yaitu hasil ekstraksi lebih tinggi,
kafein murni, penggunaan panas lebih rendah dan proses lebih sederhana karena
tanpa dilakukan pre-steaming dan pre-wetting.
4. Immunostaining dengan ICC
1.

Sel fibroblas (105 sel) yang telah dilakukan pengenceran dimasukkan pada
plastic microplate (24 wells) yang didasarnya telah diberi cover slip (tiap
well 200 L), kemudian diberi media kultur dan diinkubasi 48 jam suhu
37C. Setelah 48 jam media kultur dibuang

2.

Sel fibroblas diberi ekstrak kafein konsentrasi 1,8 mg/ml, 0,9 mg/ml, 0,18
mg/ml, 0,09 mg/ml sebanyak 200 l dan dipapar LPS sebanyak 200 l.
Inkubasi dalam inkubator shaker 37C

3.

Perlakuan diamati selama 24 jam, 48 jam dan 72 jam

4.

Selanjutnya,

coverslip

dicuci

dan

diambil

untuk

pemeriksaan

immunostaining.
(Tantin Ernawati, 2015).
1.8 Analisis data
Penelitian ini menghasilkan data kuantitatif berupa uji varian dan uji beda.

1.9 Alur penelitian

Gingiva
Manusia

Kultur

Fibroblas

Kultur
fibroblas

Pemaparan
LPS

Sel+medium+L
PS+kopi
dekafein
n:3

Sel+medium+L
PS+Kopi hitam
n:3

Sel+medium+L
PS
n
:3

Analisis
Data
Uji ICC
Kesimpulan
penelitian

Sel+medium
n:3