Kelompok 3 Icha Vany Putri Kurniasari (174121002)

Mata Kuliah Bioproses Mefri Widya Ningrum (174121003)

Agatha Sullivania Kurniadi (174121500)

LAPORAN PRAKTIKUM BIOPROSES

Judul:
OptimasiFormulasi Media sebagai Upaya Memperbanyak Protein MIF Rekombinan
menggunakan Escherichia coli BL21 Rekombinan
Latar Belakang Masalah:
Peradangan atau inflamasi merupakan mekanisme pertahanan tubuh dalam merespon
adanya serangan penyakit atau keberadaan zat asing dalam tubuh.Terjadinya inflamasi pada
tubuh dapat dibedakan menjadi dua, yaitu: inflamasi kronik dan inflamasi akut. Perbedaan
antara kedua tipe inflamasi ini adalah dari durasi berlangsungnya inflamasi, yang mana
inflamasi akut berlangsung cepat (dalam menit hingga hari) dengan durasi yang singkat,
sedangkan inflamasi kronik berlangsung dalam durasi yang lama (dalam bulan hingga tahun)
(Zhang & Xiong, 2007). Inflamasi kronik lebih berbahaya karena prosesnya berlangsung
lambat dengan jangka waktu yang lama. Keberadaan antigen yang secara terus menerus ada
di dalam tubuh dalam jangka waktu yang lama dan kegagalan tubuh mengeliminasi
keberadaan antigen tersebut dapat memicu terjadinya inflamasi kronik. Hal tersebut dapat
berakibat pada kerusakan parah pada jaringan dan kemungkinan terburuknya adalah terjadi
disfungsi.
Inflamasi kronik dapat terjadi disebabkan oleh beberapa faktor yang berperan penting,
yakni salah satunya adalah protein Macrophage migration Inhibitory Factor (MIF). MIF
merupakan protein sitokin yang berperan dalam regulasi terhadap respon imun dalam tubuh.
Protein ini terlibat dalam patogenesis dari berbagai penyakit yang disebabkan oleh inflamasi
akut maupun kronik, seperti sepsis, rheumatoid arthritis, kanker, gangguan pernapasan akut
(ARDS), asma, jantung koroner, dan diabetes mellitus tipe 2 (Thierry & Thierry, 2003).MIF
yang telah disekresikan oleh sel imun (seperti sel limfosit, neutrofil, dan hipofisis) akan
memunculkan berbagai fungsi kemokin dan aktivitas imun, serta stimulasi terhadap sitokin
pro-inflamasi lain seperti TNF-α, IFN-γ, interleukin (IL)-1β, IL-2,IL-6, IL-12, dan IL-8, yang
juga terlibat dalam patogenesis dalam inflamasi kronik (Jugeau et al., 2005). Produksi MIF
dalam tubuh akan meningkat ketika tubuh ada pada keadaan terluka, terinfeksi, terjadi
inflamasi, dan stres.

1
 Protein MIF memiliki sifat enzimatis, yang mana mampu mengkatalisis suatu reaksi,
seperti tautomerisasi (Lue et al., 2002).Tautomerisasi merupakan reaksi perpindahan proton
dari suatu molekul ke molekul lain dengan melalui beberapa langkah dan proses reaksi ini
berlangsung dengan bantuan pelarut sebagai zat perantaranya (Oullette & Rawn,
2015).Protein MIF memiliki sisi aktif yang dapat memicu substrat untuk dapat melakukan
reaksi tautomerisasi. Aktivitas tautomerase yang terjadi berupa reaksi kesetimbangan dengan
mengkonversikan senyawa keto menjadi bentuk enolnya, ataupun sebaliknya, senyawa enol
menjadi bentuk ketonya dengan 4-hydroxyphenilpyruvate (4HPP) sebagai substratnya.
Dalam keadaan setimbangnya, senyawa akan lebih dominan dalam bentuk ketonya. Dengan
mengetahui sisi aktif dari protein MIF yang mampu memicu reaksi tautomerisasi, maka dapat
diperoleh inhibitor dari protein ini sehingga terjadinya inflamasi dapat dicegah.
Dalam aplikasi bioteknologi kesehatan, protein MIFdiproduksi secara masif untuk
menghasilkan inhibitor dari protein MIF untuk mencegah terjadinya inflamasi. Suatu molekul
yang berpotensi menjadi inhibitor diujikan dengan protein MIF secara in vitro untuk melihat
potensi molekul tersebut, dengan terbentuknya ikatan antara protein MIF dengan molekul
tersebut, maka molekul tersebut dapat berpotensi menjadi inhibitor MIF. Untuk memenuhi
kebutuhan uji secara in vitro tersebut, maka perlu diproduksi protein MIF dalam jumlah
besar. Bakteria Escherichia coli sebagai vektor yang mampu mengekspresikan protein. Selain
itu, pada E. coli telah diketahui proses transkripsi, translasi, hingga mekanisme pelipatan
proteinnya sehingga dapat dimanipulasi untuk dimanfaatkan sebagai vektor. Dalam penelitian
ini digunakan bakteri rekombinan Escherichia coli BL21 sebagai vektor untuk memproduksi
protein MIF.
Dalam upaya melakukan perbanyakan protein MIF, diperlukan metode dan sistem yang
tepat untuk dapat menghasilkan protein MIF yang memiliki aktivitas tinggi dengan cepat dan
dalam jumlah banyak.Untuk meningkatkan protein MIF yang dihasilkan, maka diperlukan
formulasi media yang tepat untuk dapat meningkatkan jumlah yield yang didapat. Media
inkubasi Escherichia coli yang umum digunakan adalah media Luria-Bertani. Dalam media
terkandung yeast extract dan tryptone, yeast extract berfungsi sebagai “suplemen”
pertumbuhan bagi bakteri, sedangkan tryptone berfungsi untuk meningkatkan biomassa dari
sel. Dengan memvariasikan konsentrasi yeast extract dan tryptone diharapkan dapat
meningkatkan produksi protein MIF rekombinan dari Escherichia coli BL21. Menurut
penelitian Rosano& Ceccarelli(2014); Kram & Finkel (2015); dan Sandromenico et al.
(2020), medium LB 2×YT, Terrific Broth (TB), dan Super Broth (SB) terbukti dapat
meningkatkan kepadatan sel dibanding dengan medium LB. Berdasarkan penelitian Kram &

2
Finkel (2015), formulasi media LB 2×YT memiliki kepadatan sel tertinggi dibandingkan
dengan media LB, TB, dan SB.

Rumusan Masalah:
1. Bagaimana pengaruh formulasi media terhadap produksi MIF rekombinan dari
Escherichia coli BL21 rekombinan?
2. Formulasi media manakah yang mampu memproduksi lebih banyak protein MIF
rekombinan dari Escherichia coli BL21 rekombinan?
Tujuan:
1. Melakukan produksi protein MIF rekombinan melalui Escherichia coli BL21
rekombinan sebagai vektor dengan memvariasikan formulasi media.
2. Mengetahui formulasi media yang tepat dalam memproduksi MIF rekombinan melalui
Escherichia coli BL21 rekombinan.
Alat dan Bahan :
Alat :
Tabung duduk
Ose
Bunsen
Botol semprot
Botol akuades
Eppendorf 1,5 mL
Gelas ukur 100 mL
Gelas ukur 50 mL
Gelas ukur 10 mL
Beaker glass 500 ml
Beaker glass 250 ml
Beaker glass 100 ml
Beaker glass 50 ml
Sendok besi
Erlemeyer 500 ml
Erlemeyer 250 ml
Erlemeyer 100 ml
Erlenmeyer 50 ml
Tabung falcon 50 mL
Kotak Tip 10-100
Kotak Tip 100-1000
Klem
Botol coklat besar
Botol coklat kecil
Botol bening besar
Botol bening kecil
Kaca arloji

3
Bahan :

Yeast Extract
NaCl
Tryptone
Ampisilin
IPTG 20 mM
LB
Tris-Cl
Gliserol
HCl pekat 37%
NaOH
Resin Ni-NTA
Imidazole
CBBG
Asam Fosfat 85%
Etanol teknis 96%
Bovine Serum
Albumin
Ammonium asetat
Amoniak 25%
Asam asetat
4-HPP
Asam borat
DMSO 100%
Etanol 96%
Akuades
Tip 1-10
Tip 10-100
Tip 100-1000
Aluminium foil
Kapas

Metode:
1. Membuat media:
- Media 2YT (250 mL (big culture) + 7,5 mL (small culture) + 7,5 mL (blanko))
-Media LB (250 mL (big culture) + 7,5 mL (small culture) + 7,5 mL (blanko))
2. Melakukan Sterilisasi tip (kecil, sedang, besar) dan microtube
3. Membuat reagen dengan langkah sebagai berikut :
1. NaCl 0,9%, NaOH 1M , HCl 1M, washing buffer (Tris HCl dilarutkan di akuades, kemudian
ditambahkan gliserol, selanjutnya ditambah akuades kembali, diadjust pH sampai
mendekati 7,4), elution buffer (washing buffer + imidazole (0,68 g/10 mL)), reagen
bradford (25mg CBBG + 12,5 mL etanol p.a + 25 mL as. fosfat + akuades sampai 250 mL )
2. Menambahkan AMP pada media pada masing masing kultur dengan kadar sebagai
berikut
- 2YT (250 uL, 7,5 uL, 7,5 uL)
- LB (250 uL, 7,5 uL, 7,5 uL)
3. Melakukan inokulasi bakteri ke small culture (diinkubasi di suhu 28 °C)

4
 4. Memiindahkan inokulasi bakteri ke big culture (7,5 mL + 250 mL)
5. Unit Miller yang telah dimodifikasi kemudian melakukan perhitungan berdasarkan
titer sel (CFU per mililiter) setiap kultur, dari kepadatan optik 600 nm (OD600) pada
media 2YT dan LB kemudian dilakukan pengamatan tiap jamnya
6. Membuat larutan stok IPTG sebanyak 800 mM
7. Kemudian ditambahkan pada media (257.5 mL) sebanyak 16 uL
8. Selanjutnya dilakukan inkubasi dengan suhu 37°C pada 175 rpm
9. Inkubasi semalam

Hasil :
Kesimpulan :

Lampiran
Small Culture

Media LB Media 2YT

Big Culture

Sebelum dinokulasi IPTG Setelah diinokulasi IPTG

5
 Jam ke-1 Jam ke-2

Jam ke -3