Translasi

Chris Adhiyanto
Tahap modikasi pra-mRNA
 Tahap modikasi pra-mRNA mRNA
mRNA atau pre-mRNA, sblm dilepaskan ke sitoplasma, hrs mengalami modikasi.
Slm pemprosesan, kedua ujung transkrip akan digan?.
Ujung 5 (pertama) akan ditutup dg nukleo?da guanin (G) (me?l
guanosin)membentuk suatu topi (cap) dg proses yg disebut capping.
Ujung 3 (terakhir) akan mengalami poliadenilasi dg ditambahkan ekor poli (A) yg
tdd 30 200 nukleo?da adenin
Fungsi penutupan ujung 5 adalah melindungi mRNA dari degradasi o/ enzim
hidroli?k dan mjd tanda agar stlh dilepaskan ke sitoplasma, ribosom dapat
mengenali.
Fungsi penutupan ujung 3 adalah juga melindungi mRNA dari degradasi enzim
hidroli?k dan membantu ribosom melekat padanya serta mempermudah
pengiriman mRNA dari nukleus.
Pada eukariota, bagian-bagian tertentu dari molekul pra-mRNA akan dipotong-
potong, dan bagian-bagian sisanya akan disambung mjd satu kembali (sambung-
tempel atau splicing)
Tahap modikasi pra-mRNA mRNA
 Tahap modikasi pra-mRNA
Pada gambar di atas tampak bahwa urutan nukleo?da mRNA yg dihslkan
sama dg DNA-nya, namun dari urutan nukleo?da yg panjang tsb, kira-kira
hanya dibutuhkan sekitar 1200 nukleo?da utk mengkode protein. Ini
berar? sbgn bsr transkrip RNA memiliki nukleo?da bukan pengkode dan
tdk akan ditranslasikan (intron) dan nukleo?da yg akan diekspresikan
(ekson) mjd asam amino.
Sebelum pra-mRNA mjd mRNA, maka daerah yg tdk akan diekspresikan
(intron) hrs dibuang, dan daerah-daerah ekson akan disatukan mjd
kesatuan mRNA yg utuh yg siap dilepaskan ke sitoplasma.
Molekul protein yang berperan dlm penyambungan ekson-ekson tsb
adalah snRNP (small nuclear ribonucleoprotein) dan suatu protein lain
yang mbtk kompleks molekul spliosom.
Tahap modikasi pra-mRNA
spilcing mRNA
 Tahap modikasi pra-mRNA
Dalam spliosom, transkrip RNA akan dipotong untuk melepaskan intron
dan menyambungkan ekson mjd satu.
Stlh ekson-ekson mjd satu, spliosom akan pecah dan melepaskan mRNA
yg hanya mengandung ekson.
Pd prokariot, tdk ditemukan adanya spliosom, penyambungan mRNA
melibatkan suatu enzim ribozim.
Fungsi dari intron dalam suatu molekul RNA adalah sbg regulator
(pengatur). Intron juga berperan dalam evolusi dari protein. Gen yg
memiliki intron mempunyai probabilitas pindah silang di antara dua alel
suatu gen yg ?nggi shg dpt mhslkan suatu protein yg baru dg fungsi yang
baru juga.
Setelah modikasi mRNA selesai, maka mRNA (kadang disebut mRNA yg
matang/ mature mRNA) akan siap ditranslasikan di ribosom
 Translasi : Sintesis Protein
Translasi adalah suatu mekanisme utk sintesis protein
dibawah arahan mRNA. Selama proses ini, urutan nukleo?da
dari mRNA akan diterjemahkan dalam urutan asam amino-
asam amino dari protein.
Pada proses translasi melibatkan sejumlah besar reaksi kimia,
penambahan asam nukleat dan protein. Salah satu yg terlibat
dalam prs ini adalah ribosom.
Ribosom merupakan mesin dasar dalam proses translasi.
Sejumlah besar ribosom terlibat dalam katalis reaksi berantai
suatu asam amino menjadi protein, sesuai dengan urutan
spesik dari mRNA
 Translasi : Sintesis Protein
3 tahap dalam transkripsi : inisiasi, elongasi dan
terminasi
mRNA yg mengandung kode gene?k akan
diterjemahkan membentuk suatu protein yg
diinginkan. Molekul yg berperan dalam penterjemah
ini adalah tRNA (transfer RNA)
Molekul tRNA tdk semuanya sama. Kunci utk
mentranslasi pesan gene?k mjd urutan AA spesik
adalah se?ap mol tRNA menjembatani kodon mRNA
tertentu dg AA tertentu.
 Translasi : Sintesis Protein
Pengenalan kodon-antikodon

Kodon mRNA harus dikenal oleh anti-kodon yang ada pada tRNA
Satu tRNA dapat mengenal lebih dari satu kodon
Molekul tRNA jg ditranskripsi dr cetakan DNA (spt RNA tipe lain)
Tiap molekul tRNA dpt digunakan berulang kali
Molekul tRNA tdd untai tunggal dg pjg hanya tdd 80 nukleotida
(mRNA tdd ratusan nukleotida)
Untai ini membentuk struktur 3-D yg diperkuat oleh interaksi antara
bgn yg berbd dari rantai nukleotida
Basa nukleotida di daerah tertentunya akan mbtk ik hidrogen dg
basa komplementernya
Secara 2-D, bentuknya spt daun semanggi, dimana salah satu ujung
yang menonjol merupakan daerah antikodon (triplet basa khusus
yang dpt terikat dg kodon mRNA spesifik), sdgkan ujung lain, yaitu
ujung 3-nya mrpkan tempat pelekatan asam amino
 Tempat pelekatan
asam amino

Ikatan hidrogen
 Translasi : Sintesis Protein

Lengkung an?kodon
dibaca dari 3 5 Tirosin (tyr)

Lengkung kodon
dibaca dari 5 3
 Translasi : Sintesis Protein
tRNA
Satu tRNA dpt digunakan utk lbh dari 1 kodon mRNA yg menentukan
suatu AA.
Kemampuan ini disbbkan aturan pemasangan-basa antara basa ke?ga
suatu kodon dan basa yg terkait dg an?kodon tRNA tdk seketat aturan
untuk kodon-kodon DNA dan mRNA.
Basa U dari an?kodon tRNA dpt berpasangan dg basa A atau G di posisi
ke?ga dari kodon mRNA
Aturan pemasangan basa ini disebut aturan wobel (wobble)
Basa serbaguna an?kodon tRNA adalah I (inosin), pada posisi wobel, yg
dpt berpasangan dg basa U, C dan A dari kodon mRNA.
Jk an?kodon tRNA tdd dr basa CCI, maka dapat mengikat diri pd kodon-
kodon GGU, GGC dan GGA, yg semuanya merupakan kode untuk asam
amino glisin.
 Wobbling pada posisi ketiga

Basa pertama Basa ketiga kodon

antikodon yang dikenal
U A atau G
C Hanya G
A Hanya U
G C atau U
I A atau C atau U

Kodon unik hanya ditemukan jika basa ketiga G atau U

 Translasi : Sintesis Protein
tRNA

Sebelum tjd pengikatan antara kodon dan an?kodon, harus didahului oleh
pengikatan antara tRNA dan AA. tRNA yg nan?nya akan mengikatkan diri pd
kodon mRNA yg menentukan AA tertentu, harus hanya membawa AA
tersebut ke ribosom.
Pengikatan AA dg tRNA dibantu oleh aminoasil-tRNA sintetase. Tdpt 20 mcm
enzim ini dlm sel dan satu enzim utk ?ap asam amino.
Tempat ak?f dari enzim ini hanya cocok untuk kombinasi AA dan tRNA
tertentu. Jadi hanya AA X yg dpt ditempelkan ke tRNA X oleh enzim
aminoasil-tRNA sintetase X.
Secara singkat reaksi ini dpt dituliskan sbb
aminoasil-tRNA sintetase
tRNA + Asam amino + ATP tRNA-Asam amino + AMP


Proses penggabungan AA
spesifik ke tRNA :
1. Tempat aktif enzim
mengikat AA spesifik dan
molekul ATP
2. ATP kehilangan 2 ggs
fosfat dan bergab dg aa
sbg AMP (adenosin
mono fosfat)
3. tRNA berikatan kovalen
dg AA, menggantikan
AMP di tempat aktif
4. Enzim melepaskan
tRNA-aminoasil dan siap
ke ribosom.
 Translasi : Sintesis Protein
Ribosom

Ribosom tdd 2 subunit : subunit besar dan subunit kecil

Subunit ribosom dibangun oleh protein dan molekul RNA yg disbt rRNA
Pd eukariot, subunit dibuat dinukleus kemudian dikeluarkan mll pori-pori nukleus
ke sitoplasma.
rRNA mrpkan ?pe RNA yg plg bnyk ditemukan dalam sel
Di sitoplasma, subunit besar dan kecil bergabung mjd ribosom fungsional ke?ka
kedua subunit terikat pd molekul mRNA.
Ribosom prokariot dan eukariot bbd dlm struktur ukurannya. Perbdan ini mmlk
pengaruh ptg pd bdg medis. Obat2 tetrasiklin dan streptomisin dpt mhambat
kemampuan ribosom prokariot namun aman utk ribosom eukariot
Ribosom selain tmpt mengikat mRNA, jg mengikat tRNA.
Ada 3 situs dlm ribosom sbg tempat pengikatan tRNA yaitu : situs P, sbg tempat
mengikat tRNA-AA yg membawa rantai polipep?da yg sdg tumbuh (tempat tRNA-
pep?dil); situs A, sbg tempat mengikat tRNA-AA yg akan di tambahkan rantai
polipep?da; dan situs E, sbg tempat t-RNA yg sdh tdk mengikat AA (tRNA tdk
bermuatan) dan akan segera dilepaskan dr ribosom.
Translasi : Sintesis Protein
Ribosom
Translasi : Sintesis RNA
ribosom
Translasi : Sintesis Protein
Ribosom
Translasi : Sintesis Protein
 Translasi : Sintesis Protein

Pada slide sblmnya, tampak bhw

translasi, sintesis polipep?da/protein
tjd dlm 3 thp spt pd transkripsi yaitu
inisiasi, elongasi dan terminasi
Pd prs ini diperlukan protein maupun
faktor lain yg membantu mRNA, tRNA
dan ribosom slm translasi. Faktor tsb
dinamakan protein faktor inisiasi
(eIFs), faktor elongasi (eEFs) dan
faktor pelepasan (eRFs)
Energi pd prs ini diperoleh dr GTP
(guanosin trifosfat).
 Inisiasi translasi (pbtkan polipep?da)
Pd thp inisiasi dimulai dr pengikatan
subunit ribosom (rRNA)(subunit kecil) yg
tlh berikatan dg faktor inisiasi eIF-3, dg
mRNA dan tRNA inisiator (tRNA me?onin-
UAC) yg akan berpasangan dg kodon
mRNA-AUG sbg kodon start.
Penyatuan mRNA, tRNA inisiator dan
ribosom subunit kecil akan memberi sinyal
agar ribosom subunit besar bergabung
membentuk kompleks ribosom. Pd prs ini
juga diperlukan protein faktor inisiasi agar
proses berlangsung sempurna. tRNA
inisiator pd ribosom akan melekat pada
situs P, jadi situs P juga merupakan
tempat awal pengikatan tRNA agar inisiasi
berlangsung.
Setelah tRNA inisiator berikatan dg situs P
maka akan diiku? dg tRNA-AA lain yang
akan melekat di situs A.

 Translasi : Sintesis Protein
Inisiasi pada eukariota

1. Pd eukarita, ribosom terpisah menjadi 2 subunit, yaitu

subunit besar 60S dan subunit kecil 40S. Subunit kecil
akan berikatan dg protein faktor inisiasi eIF-3 dan eIF-1A.
2. Sdgkan tRNA inisiator (met-tRNA) jg tlh berikatan dg
eIF-2 dan GTP (eIF2 mrpkan pusat mekanisme
pengaturan inisiasi)
3. Terjadi penggab tRNA inisiator-faktor inisiasi dg ribosom
subunit kecil-faktor inisiator mbtk komplek ribosom
subunit 40S
4. Struktur cap pd daerah 5 mRNA akan dikenali oleh
eIF-4 yang akan menuntun dan menggerakan ribosom
40S-tRNA inisiator ke 5 mRNA
5. Ribosom 40S-tRNA akan bergerak di mRNA dan tdk akan
menterjemahkan kodon di mRNA sebelum menemukan
kodon mulai (start codon: AUG). Saat telah menemukan
kodon mulai (AUG), maka ribosom subunit besar 60S
akan bergabung
6. Adanya faktor inisiasi eIF-5 akan membantu pelepasan
faktor inisiator dari ribosom
7. Pada ribosom, met-tRNA akan terikat pada situs P
Insiasi pada prokariot
1. Adanya protein inisiator IF1 dan IF3
akan memisahkan ribosom 70S
menjadi subunit kecil 30S dan
subunit besar 50S
2. Scr bersamaan IF2 akan berikatan dg tRNA-GTP
3. IF1 dan IF 3 akan berikatan dg ribosom 30S, dan
bersama2 dg kompleks inisiator tRNA-IF2-GTP
akan berikatan dengan kodon mulai (start
codon) di mRNA yg berada di blkg sekuen
Shine-Dalgarno. Sekuen kodon mulai adalah
AUG, GUG atau UUG.
Saat yang bersamaan IF3 akan terlepas dari
ribosom 30S.
4. Kmdn kompleks 30S ini akan bergabung dg
ribosom 50S. Pd prs penggabungan ini GTP akan
terhidrolisis mjd GDP diikuti pelepasan IF1 dan
IF2
5. Kompleks ribosom inisiasi 70S kini siap
melakukan langkah selanjutnya.
6. tRNA inisiator dalam ribosom terikat pada situs P
 Elongasi

Pd thp elongasi, kodon mRNA pd situs A-ribosom akan membentuk ikatan hidrogen dg
an?kodon dari tRNA-AA yg sesuai utk kodon mRNA. Pd prs ini juga dibutuhkan energi
yg diperoleh dr hidrolisis GTP. Molekul rRNA subunit besar akan ber?ndak sbg ribozim
utk mengkatalisis pbtkan ik pep?da yg menghub.kan AA di tRNA situs P dan AA di
tRNA situs A. Pada prs ini juga dipengaruhi oleh eEFs (eukaryo?c Elonga?on Factors)
dan GTP
 Pada tahap penggabungan ik pep?da tRNA situs P dg tRNA situs A, akan diiku? dg
pemisahan AA yg terikat pd tRNA yg ada di situs P.
tRNA dari situs P akan bergeser ke situs E (gambar tdk tampak) dan akan sgr
dilepaskan dari ribosom. Pada prs pergerakan ini jg diperlukan energi dr hidrolisis GTP.
Pergerakan mRNA tetap dari
5 3
 Proses perpanjangan atau elongasi akan terus berlanjut
hingga ribosom menemukan kodon akhir/berhen? (stop
codon)
Proses elongasi masih berlanjut
 Translasi : Sintesis Protein
Terminasi

Jika kodon akhir atau kodon stop mRNA yaitu dg urutan nukleo?da UAG/ UAA/UGA telah
berada di situs A ribosom, maka proses elongasi/perpanjangan akan berhen?. Kodon ini
?dak ada an?kodonnya di tRNA. Kodon stop ini akan dikenali oleh protein faktor pelepas
(eRFs/eukaryo?c release factors)
 Terminasi dan pelepasan protein

Seper? telah dijelaskan di slide sebelumnya, adanya faktor terminasi akan menghen?kan
proses elongasi. Proses ini juga diiku? dengan pelepasan protein atau polipep?da dari tRNA
di situs P. Dengan berakhirnya proses ini, maka siklus akan kembali ke kondisi awal yaitu
inisiasi.
 Pascatranslasi
Rantai polipep?da (protein) yg dihslkan di ribosom dpt mengalami
2 perlakuan, yaitu langsung dilepaskan ke sitosol atau dilepaskan ke
re?kulum endoplasma kasar (rough endoplasmic re?culum) utk
mengalami proses lainnya.
Saat rantai polipep?da (protein) keluar dari ribosom, maka residu
asam amino di ujung terminal-N dan akan mengalami pelipatan
mbtk struktur 3-D
Polipep?da yg msh belum sempurna ini disbt nascent protein dan
akan mengalami modikasi dimana me?onin di ujung terminal-N
akan dilepaskan dari rantai polipep?da dg bantuan enzim protease
Modikasi ini tdk hanya utk pemutusan me?onin di ujung terminal-
N, namun jg dpt dg penambahan ggs fungsional tertentu agar
struktur dan fungsi protein yg dihslkan sesuai dg yg diinginkan.
Pd proses pelipatan ini, ada juga protein lain yg berperan dalam
mencegah terjadinya interaksi yg ?dak diharapkan dan
membawanya ke tempat yg diinginkan. Protein tsb dinamakan
chaperon.
 Pascatranslasi
Bbrp protein yg memiliki residu AA hidrofobik di ujung terminal-N, akan
dibawa ke RER.
Mekanismenya dimulai dari sinyal yg dihslkan dari residu AA hidrofobik
(tdd 20-25 AA) rantai polipep?da nascent (yg msh blm meninggalkan
ribosom) yang akan ditangkap oleh SRP (signal recogni?on par?cle).
SRP kemudian berikatan dg ribosom, polipep?da akan msk ke dlm RER,
sekaligus prs translasi msh berlangsung hingga prs translasi berhen?.
Saat di dalam RER, pep?dase akan memutuskan residu AA yg bekerja sbg
pengirim sinyal dari rantai polipep?da nascent, kemudian stlh sintesis
polipep?da selesai maka akan dilepaskan dan melakukan penyusunan
struktur 3-D
Protein pascatranslasi
 Mutasi
Mutasi adalah perubahan pd urutan nukleo?da pd molekul DNA
atau akibat kesalahan selama replikasi yg tdk dpt diperbaiki..
Perubahan awal tdk pd template pada molekul DNA, namun pd
anak molekul DNA, shg saat anak molekul DNA terpisah dan
melakukan penggandaan akan menimbulkan perbedaan dg molekul
induk pertamanya.
Perubahan basa dpt tjd sbg perubahan transisi dan transversi.
Perubahan transisi contohnya suatu pirimidin berubah menjadi
pirimidin lain (T C) atau suatu purin mjd purin lain (A G)
Perubahan transversi contohnya suatu pirimidin berubah menjadi
purin atau sebaliknya
Bila suatu urutan nukleo?da dari gen mengandung mutasi
ditranskripsi ke dalam suatu molekul RNA, maka molekul RNA ini
kelak akan mempunyai perubahan basa pelengkap pd tempat yg
sesuai ini.
 Mutasi
Perubahan satu basa pd mRNA dpt menimbulkan bbrp efek bila ditranslasikan ke dlm
protein atau tdk menimbulkan efek.
Mutasi dpt kelompokkan dlm
1. Mutasi ??k (point muta?on) tjd bila hanya satu basa pd DNA yg mengalami perubahan
dan mengakibatkan perubahan satu basa pd kodon mRNA
2. Mutasi insersi/sisipan tjd bila satu atau lebih nukleo?da ditambahkan ke DNA. Bila insersi
tdk menimbulkan kodon stop, dpt dihslkan prot dg jmlh AA lbh dr normal.
3. Mutasi delesi/penghilangan tjd bila satu atau lbh nukleo?da dikeluarkan dari DNA. Bila
delesi tdk mempengaruhi kodon start atau kodon stop, dpt dihslkan prot dg jmlh AA lbh
sdkt dr normal
4. Mutasi fargmeshie/pergeseran tjd bila jmlh nukleo?da yg diinsersikan atau didelesikan
bukan kelipatan 3 shg tjd pergeseran kerangka.

Mutasi ??k dpt dibg mjd :
1. silent muta?on apabila mutasi tsb tdk mempengaruhi urutan AA protein. Cth
perubahan CGA mjd CGG. Kedua kodon ini adalah menentukan AA arginin.
2. missense muta?on bila mutasi menyebabkan 1 AA digan?kan oleh 1 AA lain. Cth
perubahan kodon CGA utk arginin dengan CCA utk prolin.
3. nonsense muta?on bila mutasi ini menyebabkan penghenteian sintesis polipep?da
lebih awal dari seharusnya. Cth perubahan kodon CGA utk arginin dengan kodon UGA
yang merupakan kodon stop
 Mutasi
Normal Pro Gln Trp Ser Arg His
wild type 5.. CCA CAG UGG AGU CGA CAU U..3

Mutasi 5.. CCA CAG UGG AAG UCG ACA U ..3

Frameshi* Pro Gln Trp Lys Ser Thr

Insersi/delesi 3 nukleo?da
Met Phe Gly Kodon stop
wild type 5..AUG UUU GGC UAA ..3
Mutasi 5..AUG AAG UUU GGC UAA ..3
Met Lys Phe Gly Kodon stop
 Manfaat teknik DNA
Teknologi DNA akan memungkinkan para
pakar Biokimia-Biologi Molekular untuk
peneli?an yang ditujukan untuk memproduksi
senyawa atau organisme baru yang
bermanfaat bagi kesejahteraan umat manusia.
Salah satu pemanfaat teknik ini adalah untuk
membuat vaksin, forensik, an?bio?ka jenis
baru, produk pangan jenis baru dan lain-lain.
 Teknik DNA rekombinan
Teknik dasar dalam DNA rekombinan yg hrs
dimiliki, bila kita ingin mempelajari
pemanfaatan DNA dlm dunia kesehatan-
medis adalah :
1. Teknik utk memperoleh fragmen DNA
2. Teknik utk mengiden?kasi urutan DNA
3. Teknik utk mengamplikasi urutan DNA
Teknik utk memperoleh fragmen DNA
1. Mempelajari mengenai fragmen restriksi
2. Mempelajari mengenai RT DNA (reverse
transcriptase)
3. Mempelajari sintesis DNA scr kimia.
 Fragmen restriksi
Enzim restriksi suatu endonuklease yang dpt memotong DNA di
lokasi-lokasi tertentu
Di alam, enzim ini bergn utk melindungi bakteri thdp DNA asing spt
virus atau bakteri lain.
Enzim ini sangat spesik dalam mengenali urutan nukleo?da pendek
dalam molekul DNA.
Molekul DNA yg terpotong akan mhslkan fragmen2.
Fragmen restriksi ini berupa fragmen DNA untai ganda, dan ujung-
ujung fragmen tsb disebut ujung lengket.
Dengan bantuan DNA ligase, fragmen molekul DNA A dapat
ditempelkan dengan fragmen molekul DNA B.
Pengetahuan mengenai hal ini sering digunakan dalam membuat DNA
rekombinan (menggabungkan urutan DNA menjadi kombinasi baru)
atau chimeric (DNA rekombinan in vitro)
 Fragmen restriksi
5 ...G A A T T C ..3
EcoRI
3 ...C T T A A G ..5 5 ...G A A T T C ..3

3 ...C T T A A G ..5

UJUNG LENGKET/ STICKY

5 ...C C C G G G ..3
SmaI
3 ...G G G C C C ..5 5 ...C C C G G G ..3

3 ...G G G C C C ..5

UJUNG TUMPUL/ BLUNT
 RT DNA (reverse transcriptase DNA)
mRNA yg dihslkan dr prs transkripsi suatu gen, dpt
digunakan utk membuat DNA baru.
DNA yang diperoleh dinamakan cDNA/ salinan DNA/
copy DNA.
Pd prs ini diperlukan suatu enzim yang dinamakan
reverse transcriptase yg dpt membalikan reaksi dari
DNA mRNA (prs transkripsi biasa) mjd mRNA DNA
DNA yang dihslkan melalui proses ini tdk memiliki intron
spt DNA pada umumnya.
 Sintesis DNA scr kimia
Makin majunya teknologi terutama di bidang
bioteknologi, kini kita dapat membuat DNA sintesis
menggunakan mesin otoma?s.
Hasil yg diperoleh adalah fragmen DNA dalam bentuk
tunggal, dg panjang hingga 100 nukleo?da, tergantung
permintaan peneli?.
Fragmen DNA ini banyak digunakan dlm proses
iden?kasi, amplikasi gen dll
Fragmen ini biasanya disebut primer atau probe (primer
yang diberi zat berpendar)
 Teknik iden?kasi urutan DNA
Hal awal yg hrs dilakukan adalah merancang primer atau probe. Primer
yg kita rancang harus komplementer dg DNA yg kita miliki.
Hal kedua yg hrs kita siapkan adalah elektroforesis gel. Gel
elektroforesis adalah suatu teknik yg menggunakan medan listrik utk
memisahkan molekul berdsrkan ukuran. Krn DNA mengandung ggs
fosfat yg bermuatan nega?f, di dlm medan listrik, DNA akan bergerak
menuju elektroda posi?f. Fragmen DNA yg pdk, lbh cpt bermigrasi mll
pori-pori drpd yg pjg, shg pemisahan dilandasi kpd pjg fragmen.
Hal ke?ga adalah deteksi urutan DNA spesik dg memindahkannya ke
kertas nitroselulusa. Teknik yg digunakan dinamakan Southern blot.
DNA yg tdk diinginkan ?dak akan dipindahkan ke kertas nitroselulosa
 Teknik iden?kasi urutan DNA
Penemuan Frederick Sanger, sangat
membantu kita dlm melakukan penentuan
urutan nukleo?da pd untai DNA.
Prinsip dasar teknik ini menggunakan sistem
 Amplikasi urutan DNA
Utk melakukan peneli?an DNA, isolasi DNA yg kita
peroleh harus dlm jumlah yg cukup. Jk jumlahnya sangat
sedikit atau sedikit, maka harus dilakukan perbanyakan
DNA (amplikasi DNA).
Pengklonan DNA mrpkan teknik yg pertama kali
dilakukan utk memperbanyak DNA. Pd teknik ini,
fragmen DNA yg diinginkan di sisipkan ke plasmid (vektor
pembawa yg tdd DNA). Plasmid chimeric (mengandung
DNA plasmid dan DNA sisipan) ditransformasikan ke
dalam sel bakteri utuh. Saat bakteri membelah, otoma?s
DNA chimeric juga ikut membelah.
 Amplikasi urutan DNA
Teknik lain adalah menggunakan PCR
(polymarese chains reac?on) atau teknik
reaksi polimerasi berantai.
Metoda ini lebih mudah dan cepat dalam
memperoleh DNA anakan shg sering
digunakan dlm pemeriksaan klinis maupun
forensik.
Pd teknik ini hanya diperlukan sedikit sampel
DNA namun anakan DNA yg diperoleh sangat
banyak.
 Amplikasi urutan DNA
PCR
Langkah-langkah dlm PCR melipu? :
1. Isolasi sampel DNA. DNA dpt diperoleh dari sel yg berin?. Untuk
memperolehnya, kita harus melakukan pemecahan membran sel dan
membran in? shg DNA keluar dari sel. Tahap ini dinamakan tahap isolasi
DNA/ preparasi DNA
2. DNA yang kita inginkan kita masukkan dlm sebuah tabung kecil (tube).
3. Dalam tabung, kita juga menambahkan primer (DNA sinte?k yg urutannya
telah kita rancang dahulu dan bersifat komplementer/ saling melengkapi
thdp urutan DNA pendek pd satu untai DNA yg diamplikasi), keempat
deoksiribo- nukleosida trifosfat (dATP, dGTP, dCTP, dTTP dNTP), DNA
polimerase, larutan ka?on-anion
4. Tabung kemudian di taruh dalam mesin PCR. Prinsip teknik dasar PCR
adalah perlakukan pemanasan dan pendinginan yg berulang, hingga jumlah
DNA yang kita inginkan tercapai. Umumnya siklus yg dilakukan sebanyak 20
siklus (pemanasan-pendinginan) untuk memperoleh DNA > 1 jt.
Prinsip PCR
PCR
 Pemanfaatan teknik DNA
Dengan mengetahui teknik DNA, maka kita
dapat melakukan :
1. Diagnosis suatu penyakit
2. Pembuatan obat atau vaksin
3. Mengetahui silsilah keluarga atau suku/ras
4. Membantu dalam proses penyidikan suatu
?ndak kejahatan
 Diagnosis suatu penyakit
Polimorsme adalah suatu kondisi dimana terjadi adanya variasi
dalam urutan DNA.
Adanya mutasi ??k, subs?tusi satu basa dg basa lain menyebabkan
adanya variasi urutan DNA
Polimorsme dpt tdj di dlm daerah pengkode gen (yg akan
diterjemahkan) maupun daerah yg bukan daerah pengkode gen.
Deteksi polimorsme dpt digunakan utk mendeteksi :
1. Polimorsme panjang fragmen menggunakan enzim restriksi (RFLP)
2. Adanya mutasi dg menggunakan probe oligonukleo?da spesik
3. Adanya mutasi dg menggunakan PCR
4. Adanya mutasi pd daerah yang sangat variabel (VNTR)
 Restriksi polimorsme panjang
fragmen (RFLP)
Bila ada mutasi ??k di satu daerah restriksi DNA, maka enzim restriksi akan
memotong molekul DNA di daerah restriksi lain.
Akibatnya, fragmen restriksi yg dihslkan lbh besar utk molekul DNA yg termutasi
dibdgkan molekul DNA normal.
Jk mutasi menyebabkan munculnya daerah restriksi baru yg tdk ada diindividu
normal, akan mybbkan fragmen restriksinya akan lbh pdk drpd normal.
Variasi pjg fragmen res?ksi dikenal sbg panjang fragmen restriksi polimorsme /
RFLP ( restric?on fragment length polymorphism)
Kadang, mutasi jd ditempat restriksi yg terletak jauh di luar daerah regio
pengkode, namun daerah tersebut memiliki hubungan yg erat dg gen abnormal yg
menyebabkan penyakit.
Pemeriksaan RFLP dpt digunakan utk :
1. Mencari adanya variasi DNA SNPs (single nucleo?de polymorphsms) dan VNTR
(variable number of tandem repeats)
2. Mencari kromosom dari orang tua ke keturunannya
3. Diagnosis prenatal
 Gen normal Hb - C C T G A G G
tempat Mst II
Gen Hb sabit - C C T G T G G

Tdk tdpt tempat restriksi di globin-B sel sabit
Mst II Mst II Mst II
gen globin-B

Gen normal 1,1 kb
Ket :
Psn A kedua alelnya tdk
Gen sabit 1,3 kb mmlk tmpt utk MstII (+ bln
sabit)
pasien A pasien B kontrol normal kontrol sabit Psn B, 1 alelnya mmlk tmpt
Mst II dan 1 alel lain tdk

ada tmpt Mst II (senya
pembawa/ carrier)
1.3 kb
1.1 kb
RFLP utk suatu penyakit keturunan
 Deteksi menggunakan probe
Kadang mutasi tjd tdk di area restriksi, shg perlu
dikembangkan teknik lain
Deteksi ini mggnkan probe nuklo?da utk alel yg
komplementer dg urutan DNA pendek yg termutasi.
Region yg diduga termutasi akan diperbanyak oleh PCR,
lalu dipindahkan ke kertas nitroselulosa (slot blojng).
Kmdn kertas diberi probe normal dan mutan. Ada tdknya
mutasi akan diketahui apakah tjd komplemen atau tdk
antara DNA termutasi dg probe.
 Deteksi dg PCR
Bila urutan DNA termutasi sdh diketahui, mk dpt
disintesis sbh oligonukleo?da yg komplementer dg regio
tsb.
Oligonukleo?da ini hanya akan mbtk psg basa dg DNA yg
diperoleh dr individu yg mengalami mutasi
Tlh banyak diproduksi oligonukleo?da khusus utk suatu
urutan DNA termutasi dan digunakan sbg primer. Bila
sampel DNA ssorg yg diduga mengalami mutasi dan
diamplikasi mggnkan primer termutasi serta
membentuk komplemen, mk hslnya dpt diama?
mggnkan stlh dielektroforesis.
 Deteksi utk daerah yg variable
Pd manusia, srg ditemukan daerah urutan yg mengalami pengulangan lebih
dari satu kali dalam lokus gen.
Daerah tsb dinamakan regio hipervariabel (variable number of tandem
repeats) atau daerah yg mengalami banyak pengulangan.
Enzim restriksik akan mengenali daerah yg mengapit regio VNTR.
Fragmen yg diperoleh dr pencernaan enzim restriksi ?ap individu berbeda
satu sama lain, tergantung pd jumlah ulangan.
Pola fragmen yg khas ini memiliki keakuratan yg sama dg sidik jari dan dpt
digunakan utk iden?kasi individu.
Teknik fragmen restriksi ini disebut sidik jari DNA DNA ngerprin?ng, dan
banyak digunakan utk analisis forensik.
Hubungan kekeluargaan jg dpt ditentukan oleh teknik ini, krn individu yg
memiliki hubungan erat scr gene?k, akan memiliki pola fragmen sidik jari DNA
yg lbh serupa daripd individu yg hubungan gene?knya jauh.
Pd kembar monozigot, pola sidik DNAnya akan 100 % iden?k.
 EcoRI EcoRI


VNTR
Fragmen EcoRI dr 3 individu :
Individu I Individu II Individu III
6 3 12

9 15 18


I II III

18

15

12

9

6

3

Sidik DNA utk forensik
Sidik DNA utk kasus kejahatan

Suspect C is (+)
 Pemanfaat teknik DNA rekombinan utk pengobatan dan
pencegahan

Gambar di samping memperlihatkan pembuatan

insulin. Pertama dipersiapkan DNA yg sesuai utk rantai
insulin A dan B manusia, kemudian disisipkan ke
plasmid. Stlh itu ditransformasikan ke E.coli. Saat
bakteri membelah diri, DNA sisipan juga ikut
membelah. Pd saat yg bersamaan bakteri juga
mensintesis rantai insulin. Kemudian insulin dimurnikan
dan dibiarkan membentuk lipatan serta ikatan disulda
shg diperoleh insulin ak?f dan siap di distribusikan.
Ini adalah salah satu pemanfaatan teknik DNA
rekombinan untuk pengobatan
Vaksin dibuat dari agen infeksius yang dima?kan atau dilemahkan
shg tdk dpt berkembang biak dlm individu yg diinokulasikan dg
agen tsb. Pd keadaan tertentu, vaksin tsb mungkin tercemar shg
dpt menimbulkan persoalan baru.