ReviewJurnalKakao

PERBEDAANKANDUNGANSENYAWAFENOLIKDANKAPASITASANTIOKSIDAN
BIJIKAKAODARIBERBAGAINEGARADANDARIVARIETASHIBRIDA

DisusunOleh:
Kelompok1
IdyaRachmawati ( )
PryasMustikaR. ( )
SriWijanarti ( )
EnyOrinda ( )

PROGRAMSTUDIILMUDANTEKNOLOGIPANGAN
FAKULTASTEKNOLOGIPERTANIAN
UNIVERSITASGADJAHMADA
2015
PERBEDAANKANDUNGANSENYAWAFENOLIKDANKAPASITASANTIOKSIDAN
BIJIKAKAODARIBERBAGAINEGARADANDARIVARIETASHIBRIDA

Abstrak
Kakao (Theobroma cacao L.) adalah tanaman internasional utama yang secara ekonomi
penting dan telah dikaitkan dengan beberapa manfaat nutrisi. Kakao memiliki kapasitas
antioksidan yang tinggi. Kakao merupakan sumber yang kaya dengan senyawa fenolik. Banyak
penelitian melaporkan bahwa senyawa fenolik memiliki hubungan yang erat dengan kapasitas
antioksidan. Asal dan varietas kakao dapat menyebabkan perbedaan kandungan nutrisi, senyawa
fenolik,dankapasitasantioksidanbijikakao.Reviewinimengulasmengenaikapasitasantioksidan
bijikakaodariberbagainegarasepertiMalaysia,Ghana,PantaiGading,danIndonesia(Sulawesi),
kemudianmembandingkanbijikakaotradisionaldarinegaraGhanadenganvarietashibridanya.
Penelitian dilakukan dengan mengukur kandungan senyawa fenolik dalam biji kakao
menggunakan reagen FolinCiocalteu. Kapasitas antioksidan dari berbagai negara ditentukan
menggunakan 3 analisa, yaitu carotenelinoleate bleaching assay, DPPH (2,2diphenyl2
picrylhydrazyl) radical scavenging assay, dan ferric reducing/antioxidant power (FRAP) assay.
Kapasitas antioksidan biji kakao dari Ghana dan hibridanya dibandingkan menggunakan ferric
reducing/antioxidant power (FRAP) assay dilanjutkan dengan melakukan fraksinasi komponen
fenoliknyamenggunakanHighPerformanceChromatography(HPLC)PerkinElmerLC200.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa biji kakao dari negara yang berbeda memiliki
kapasitas antioksidan yang berbedabeda. Metode pengujian kapasitas antioksidan yang berbeda
juga memberikan hasil yang berbeda pula. Hal ini diduga karena komponen senyawa fenolik
dominan bervariasi dari satu jenis biji kakao dengan yang lainnya. Di negara Ghana, biji kakao
hibrida cenderung memiliki kapasitas antioksidan yang lebih tinggi dibandingkan biji kakao
tradisionalnya, namun secara keseluruhan kandungan nutrisinya tidak memiliki perbedaan yang
signifikan.
A. Pendahuluan
Senyawa antioksidan merupakan mikronutrien dalam makanan yang dapat menunda atau
menghambat oksidasi lipid, dengan cara menghambat inisiasi atau propagasi reaksi berantai
oksidasi, dan juga terlibat dalam menetralkan radikal bebas. Makanan seperti buahbuahan,
sayuran, dan bijibijian dilaporkan mengandung berbagai macam senyawa antioksidan, termasuk
senyawafenolik.Senyawainiditemukanberkorelasibaikdenganpotensiantioksidan(Katalinic,
Milos, Modun, Musik, & Boban, 2004). Beberapa studi epidemiologi menunjukkan korelasi
negatif antara asupan flavonoid diet dan penyakit jantung koroner (Hertog, Fesken, Hollman,
Katan, & Kromhout, 1993 Knekt, Jarvinen, Reunanen, & Maatela, 1996), kanker, dan stroke.
Senyawafenolataupolifenoltelahmenerimabanyakperhatiankarenafungsifisiologisnya,seperti
kapasitasantioksidan,antimutagenik,danantitumor(Kono,Shibata,Kodama,&Sawa,1995Air
liur,Darmin,Fernandez,&Mitjavila,1991).
Winedanminumansepertikakao,redwine,tehhitam,dantehhijautelahdikonsumsisecara
luas dan dikenal kaya akan senyawa fenolik. Secara khusus, teaflavin dalam teh hitam,
epigalokatekin galat dalam teh hijau, resveratrol dalam red wine, dan prosianidin dalam kakao
telah dipertimbangkan sebagai agen kemopreventif karena kapasitas antioksidannya yang kuat
(Leeetal.,2003).Bijikakao(TheobromacacaoL.)sangatkayapolifenol(Wollgast&Anklam,
2000) dan juga merupakan salah satu sumber terkaya antioksidan alami. Produk kakao
mengandungkapasitasantioksidandanjumlahflavonoidyanglebihbesardibandingkantehatau
redwine(Leeetal,2003.Steinberg,Bearden,&Keen,2003).
Bijikakaomemilikikandunganfenoliktinggisekitar1218%(beratkering)padabijikakao
tanpafermentasi(Kim&Keeney,1984).Dreosti(2000)melaporkanbahwa60%daritotalfenolat
di biji kakao mentah adalah monomer flavanol (epicatechin dan catechin) dan procyanidin
oligomer (dimer untuk decamer). Senyawasenyawa tersebut dilaporkan menjadi kandidat
potensialuntukmelawanradikalbebasyangberbahayabagitubuhdansistempangan(Adamsonet
al,1999Sanbogietal,1998).Studiinvitromenunjukkanbahwasenyawainimemilikibeberapa
kapasitasbiologis,sepertikemampuanuntukmengikatradikalsuperoksidadanradikalhidroksil,
mengurangiradikalperoksillipiddanmenghambatperoksidasilipid.
Penelitian telah menunjukkan bahwa konsumsi kakao atau cokelat mengurangi resiko penyakit
kardiovaskular (Keen, 2001. Osakabe et al, 1998). Selain itu, ekstrak yang dibuat dari bubuk
kakao dan biji kakao menunjukkan efek antihipergligemik pada tikus diabetesyangdiinduksi
denganstreptozotocin(Amin,Faizul,&Azli,2004bRuzaidi,Amin,Nawalyah,Hamid,&Faizul,
2005). Amin, Koh, dan Asmah (2004a) menunjukkan bahwa ekstrak etanol dibuat dari cocoa
liquor Malaysia memiliki potensi dalam mengurangi keparahan hepatokarsinogenesis di tikus.
SebuahreviewolehDuke(2000)diasumsikanbahwaduasendokkakaodalamsecangkirairatau
susudapatdigunakansebagaitreatmentuntukmeringankanpenyakitParkinson,mastitis,penyakit
hati, disfungsi seksual, demam, sistitis, flu, luka bakar, asma, bronkitis, diabetes, dan obesitas.
Diet yang mengandung sumber utama antioksidan dan polifenol direkomendasikan untuk tujuan
pencegahan.
Kakao(TheobromacacaoL.)merupakantanamanpentingdalamekonomibeberapanegara
sepertiGhana,PantaiGading,Nigeria,Indonesia,danMalaysia.Malaysiaadalahnegaraterbesar
kelimaprodusenbijikakaodiduniadansalahsatuprodusenutamaprodukberbasiskakaodidunia
dan yang terbesar di Asia. Namun, biji kakao Malaysia yang dijual dengan harga yang lebih
rendahdibandingkandenganbijikakaoAfrikaBarat,karenabeberapakelemahandalamkualitas
yaitu memiliki aroma kakao lemah, rasa sepat, dan pahit. Salah satu faktor yang dapat
menyebabkan hal ini adalah tingginya kandungan senyawa fenolik. Sebuah penelitian yang
dilakukan oleh Natsume et al. (2000) melaporkan bahwa kandungan fenolik dalam cocoa liquor
bervariasi tergantung dari negara asal. Namun, belum ada penelitian yang telah dipublikasikan
mengenaikapasitasantioksidanbijikakaodarinegarayangberbeda.
Produktivitaskakaoseringmenurunkarenaadanyahamayangmenyerang.Olehkarenaitu,
banyakdikembangkanvarietasbaruuntukmeningkatkanproduktivitaskakao.Ghanaadalahsalah
satu produsen terbesar kakao berkualitas tinggi. Konsumsi kakao meningkat selama satu dekade
terakhir, namun hasil tanaman kakao di Ghana menurun. Untuk meningkatkan hasil, mulai
dikembangkan varietas hibrida dari persilangan antara genotip Amazon, Trinitario, dan
Amelonado untuk menambah Seri II hibrida (AduAmpomah & Sersah, 1987/1988) yang sudah
ditanam oleh petani (AduAmpomah, 1996). Beberapa hibrida ini dipilih atas dasar buah yang
dihasilkan yang sebanding dengan genotip kokoa tradisional Amelonado dan Trinitario, atau
berdasarkan pada penyakit yang menyerang dan resistensi terhadap hama. Hibrida ini belum
diperkenalkansecarakomersialnamunakandiperkenalkandalamwaktudekat.Sayangnya,hanya
sedikityangdiketahuimengenaikandungannutrisipentingnyasepertikandungansenyawafenolik
dankapasitasantioksidanbijikakaohibrida.
 Tujuandarireviewiniadalahuntukmengetahuikandungansenyawafenolikdankapasitas
antioksidan pada biji kakao dari negaranegara yang berbeda dan biji kakao hasil persilangan
(hibrida).

B. Bahan&Metode
1. Bahan
a. BijiKakaoGhana,Malaysia,PantaiGading,danIndonesia(Sulawesi)
Bijikakaomentah(dikeringkandandifermentasi)dariMalaysia,Ghana,PantaiGading,
danSulawesidibelidariKLKepong(ProdukKakao)Sdn.Bhd,Selangor,Malaysia.
b. BijiKakaoHibrida
Berbagai varietas hibrida baru kakao telah dikembangkan oleh Cocoa Research
Institute of Ghana. Empat hibrida yaitu (HV1HV4) (Tabel 1) ini dipilih karena
digunakanuntukpenelitianlebihlanjutberdasarkanproduktivitasnyayangtinggi.Kakao
ditanam dalam kondisi tropis di peternakan eksperimental Cocoa Research Institute of
GhanadiTafo,sebuahkotadiWilayahTimurGhana.BijidipanenpadabulanNovember
2002.BijiTradisional(TV)tumbuhdibawahkondisiyangsamatetapipadapeternakan
yang berbeda, dan dipanen pada waktu yang sama dengan hibrida. Cangkang dirusak
untukmendapatkanbijikemudiandifermentasiselamaenamhari.Setelahfermentasi,biji
dijemur dengan tikar di atas tanah. Biji mentah atau rusak dihilangkan setelah
pengeringandanbijidikemasdengankarunggoni.BijikemudiandikirimkeDepartemen
Riset Divisi Pengendalian Mutu untuk memeriksa kualitas, kemasan, dan transit
penyimpanan jangka pendek sebelum dikirirm ke Inggris pada Maret 2003 untuk
penelitian.
Bijikakaokeringdiayakuntukmenghilangkankotoran.Bijidijadikansatukemudian
dibagi sama besar secara diagonal. Salah satu bagian dipilih secara acak untuk sampel
pertama dan ditimbang sebanyak 500 g. Sisa biji dijadikan satu kembali dan dibagi
menjadi 3 bagian, proses ini diulang kembali hingga 2 kali. Biji kakao kemudian
disimpan dalam kabinet yang terkontrol pada suhu 30 2 C dan kelembaban relative
mulai dari 70 2%, berdasarkan kondisi yang berlaku pada gudang kakao di Ghana.
Sampeldiambildaritokosetelah31hariuntukanalisis.
2. EkstraksiBijiKakao
Sebanyak10gsampelkeepingbijikakaodigilingdenganblenderkopidan2gbubukkakao
yangdihasilkandihomogenisasidengan50mL80%metanolselama1menitpadasebuahalaslabu
datar menggunakan homogenizer Polytron di 25.000 rpm. Suspensi kakao direfluks selama 30
menitdankemudiandisaring.Ekstrakinidigunakanuntukmenentukankapasitasantioksidandan
totalkandunganfenolik.

3. CaroteneLinoleateBleachingAssay
Kapasitas antioksidan dari ekstrak kakao diuji berdasarkan metode carotenelinoleate
bleachingassayyangdikembangkanolehVeliogluetal.(1998).BHTdigunakansebagaistandar.
carotene (0,2 mg dalam 1 ml kloroform), asam linoleat (0,02 ml) dan Tween 20 (0,2 ml)
dipindahkankedalamdasarlabu.Campurankemudianditambahkanke0,2mlekstrakkakaoatau
standar atau etanol (sebagai kontrol). Kloroform dihilangkan pada suhu kamar di bawah vakum
padatekananrendahmenggunakanrotaryevaporator(Unimax1010,Heidolph,Jerman).Setelah
penguapan, 50 ml air suling ditambahkan ke dalam campuran, kemudian dikocok dengan keras
untuk membentuk emulsi. Dua mL aliquot emulsi dipipet ke dalam tabung uji dan ditempatkan
dalamwaterbath(Techne,DuxfordCambridge,Inggris)pada50oC.Absorbansidibacakanpada20
intervalmenitselama2jampada470nm,menggunakanspektrofotometerSECOMAMAnthelie
Advanced 5. Degradation rate (DR) dihitung menurut kinetika orde pertama, menggunakan
persamaanberdasarkanAlSaikhan,Howard,danMiller(1995):

dimana ln adalah log alami, adalah absorbansi awal (470 nm) pada waktu 0, b adalah
absorbansi(470nm)pada20,40,60,80,100atau120menitdantadalahabsorbansiawal(470
nm) pada waktu 0. Kapasitas antioksidan (AA) dinyatakan sebagai persen penghambatan relatif
terhadapkontrol,menggunakanberikutrumus:
4. UjiFRAP
Kapasitas antioksidan diukur dengan menggunakan uji potensi antioksidan untuk mereduksi
besi(FRAP)sepertiyangdijelaskanolehBenziedanRegangan(1996),menggunakantrolox(020
nmol)sebagaistandar.Piringpengujimikrodisusundenganmenempatkan10Letanol(kosong),
standar trolox, atau larutan sampel ke wellplate microtitre diikuti oleh penambahan100 L uji
reagen FRAP untuk semua sumur. Absorbansi pada 630 nm diukur menggunakan plate reader
(BioRad550)dankapasitasantioksidansampeldihitungsebagaitroloxekuivalen.

5. UjiKandunganFenolik
JumlahkandunganfenolikdiukurmenggunakanUjiFolin&Ciocalteu(Forrest&Bendall,
1969).SatumLsampeldisaring,direfluks,dandiencerkandengan49,0mLairdestilasi.Reagen
fenol Folin Ciocalteu terdilusi 50%, kemudian 0,25 mL 50% reagen ditambahkan ke 0,25 mL
sampel dan diinkubasi dalam bak air selama3 menit pada suhu 25C. Hal ini diikuti dengan
penambahan 0,5 mL larutan jenuh Na2CO3 cair dan selanjutnya diinkubasi dalam waterbath
selama60menit.Absorbansidiukurpada750nm.Hasildinyatakansebagaiferulicacidequivalent
(FAE)menggunakankurvastandarasamferulat(020g).

6. ProfilFenolik
Profil fenolik ditentukan dengan menggunakan HPLC (Perkin ElmerLC 200). HPLC yang
dilengkapi dengan kolom C18 Supelco Discovery, 4.6 mm x 15 cm, dan diode array detector
denganabsorbansiditetapkanpada280nm.
Sampel (5 g) dari keping biji kakao digiling dan dimasukkan ke dalam gelas kemudian
ditambahkan200mL70%metanol.Hesperitin(1mg)ditambahkansebagaistandarinternaluntuk
memantaufenolicrecovery.Campurandiadukdenganpengadukmagnetikselama2jamkemudian
disaringdibawahvakummelaluikertasWhatmanGF/A.Filtratdipindahkansecarakuantitatifke
alas labu bulat dan methanol diuapkan menggunakan rotary evaporator, R3000, pada 170 rpm
dan suhu 30C untuk menyisahkan sekitar 60 mL larutan. Sodium hidroksida (50 mL x 2 N)
ditambahkan untuk menghidrolisisnya semalam pada suhu kamar. Campuran tersebut kemudian
ditransfer secara kuantitatif pada 3 x 50 mL tabung centrifuge, dan disentrifugasi pada 2000g
selama15menit.SupernatandituangdaripeletdandisaringmelaluikertasWhatmanNo.4pada
corongpisah.Sebanyak80mLeterditambahkan,dikocok,danlarutankiriuntukpartisi.Fasecair
dipertahankan.Langkahpartisiinidiulangduakalilagi.Ekstrakcairakhirkemudiandiasamkan
sampai pH 1,5 dengan asam klorida dan disaring melalui kertas Whatman No 1 pada corong
pemisah. Ekstrak eter dikumpulkan dan dikeringkan dengan MgSO4 (anhidrat), disaring melalui
kertas WhatmanNo 1 ke dalam dasar labu bulat dan diuapkan pada rotary sampai hanya sisa
beberapamLeter.Laludipindahkansecarakuantitatifketabungsampelkecildaneterdiuapkan
sampaikeringdalamalirannitrogen.
Sampeldiambil2mLpadacampurangradeHPLCmetanol(25%)dandaparfosfat0,02M
pH2,4(75%),disaringmelalui0,2msyringefilterdan10LdisuntikkankedalamHPLC.Saat
itudielusidengangradienlinearmenggunakanmetonolgradeHPLCdan0,02MfosfatbuferpH
2,4hingga25menit,kemudiandimulaidengan20%methanoldan80%bufer,dandiakhiridengan
80%metanoldan20%bufer.

7. Statistika
Semua pengukuran dilakukan dalam rangkap tiga dan hasil dianalisis dengan ANOVA
menggunakanProgramstatistikGENSTAT3.1.

C. Hasildandiskusi
1. Kandungan fenolik dan kapasitas antioksidan biji kakao tradisional dari berbagai
negara
a. carotenelinoleatebleaching
Padapengujiankapasitasantioksidanmenggunakanmetodecarotenelinoleatebleaching,asam
linoleat menghasilkan hidroperoksida sebagai radikal bebas selama inkubasi pada 50oC.
Keberadaan antioksidan dalam ekstrak akan meminimalkan oksidasi karoten akibat
hidroperoksida. Hidroperoksida yang terbentuk dalam sistem akan dinetralkan oleh senyawa
antioksidandariekstrak.Terdapatkorelasiantaralajudegradasidanpemucatankarotendimana
ekstrak dengan degradasi karoten terendah memiliki kapasitas antioksidan tertinggi. Seluruh
ekstrak memiliki kapasitas antioksidan yang lebih rendah dibandingkan dengan BHT seperti
ditampilkandalamGambar1dan2.
Gambar 1. Laju degradasi biji kakao mentah (ekstrak etanolik) diuji menggunakan metode
carotene bleaching (n=3). Konsentrasi sampel adalah 0,04 g/mL (40.000 ppm). BHT pada
konsentrasi200ppmdigunakansebagaistandar.Koefisienvariankurangdari11%.

Gambar2.Lajudegradasibijikakaomentah(ekstrakair)diujimenggunakanmetodecarotene
bleaching(n=3).Konsentrasisampeladalah0,04g/mL(40.000ppm).BHTpadakonsentrasi200
ppmdigunakansebagaistandar.Koefisienvariankurangdari18%.

Dalampenelitianini,duamediumekstraksidigunakanuntukmembuatekstrakkakao.Penelitian
sebelumnya melaporkan bahwa kapasitas antioksidan dan yield kandungan fenolik dipengaruhi
oleh pelarut yang berbeda (Sun & Ho, 2005). Sebagai contoh, ekstrak air Terminalia chebuta
menunjukkanaktivitasantioksidanyangbaik,dibandingkandenganekstrakmetanolLycopersicon
esculentum(Cai,Qiong,Mei,&Harold,2004).Selainitu,darisudutpandangtoksikologi,etanol
dan air lebih aman daripada aseton, metanol, dan pelarut organik lainnya (Oktay, Gulcin, &
Kufrevioglu, 2003). Aktivitas antioksidan ekstrak etanol biji kakao dari yang tertinggi adalah
Ghana Pantai Gading Malaysia > Sulawesi (Tabel 1). Ada perbedaan yang signifikan (p <
0,05)antarakapasitasantioksidanbijikakaoSulawesidenganyanglainnya.Tidakadaperbedaan
signifikan yang ditemukan antara biji kakao Pantai Gading dan Ghana. Aktivitas antioksidan
ekstrakkakaoMalaysiamenunjukkanperbedaansignifikan(p<0,05)dibandingkandengansemua
ekstraklainnyakecualidenganPantaiGading.
EkstrakairbijikakaodariPantaiGadingmemilikikapasitasantioksidantertinggi(p<0,05)
diikuti oleh Ghana, Malaysia, dan Sulawesi. Namun, analisis varian menunjukkan tidak ada
perbedaanyangsignifikanantaraGhanadanMalaysia.Semuaekstrakairbijikakaomenunjukkan
aktivitas antioksidan yang lebih tinggi dibandingkan dengan etanol ekstraknya. Senyawa
antioksidanyangterlarutdalamairtampaknyamenghambatoksidasikarotendalam
sistemkarotenlinoleatyanglebihbaikdaripadasenyawayanglarutdalametanol.Temuanini
didukungolehpenelitianpadajamur(L.edodesdanV.volvacea),yangmenunjukkanekstrakair
memilikiaktivitasantioksidanlebihtinggidariekstrakmetanol(Cheung,Peter,&Vincent,2003).
Amin dan Tan (2002) melaporkan bahwa ekstrak air dari rumput laut (Laminaria sp.) Memiliki
aktivitas antioksidan yang lebih tinggi, dibandingkan dengan ekstrak etanol. Komponen
antioksidanyangterdapatdalamekstrakairsepertiasamamino,fenolikasamdanflavonoiddalam
propolis(Nagai,Reiji,Hachiro,&Nobutaka,2003),pirokatekoldijelatang(Gulcin,Irfan,Oktay,
&Mehmet,2004),katekindalamteh,wine,anggur,apel,pirdanpersik(Dreosti,2000Nicolas,
RichardForget, Goupy, Amiot, & Aubert, 1994 Spanos & Wrolstad, 1990 Cheng & Crisoto,
1995)memilikiantioksidantinggiaktivitas.Dalambijikakao,senyawaantioksidanlarutdalamair
bisa menjadi () epicatechin, (+) katekin, dan quercetin (Sanbogi, Suzuki, & Sakane, 1997).
Faktorfaktorlainyangjugamempengaruhiaktivitasantioksidanadalahkonsentrasiantioksidan,
mediaekstraksi,suhu,pHmedium(Gazzani,Papetti,Massolini,&Daglia,1998),strukturkimia
danposisidalammolekul(Prior,Wu,&Schaich,2005).
Tabel2.Kapasitasantioksidan(%)bijikakaomentahdiujimenggunakancarotenelinoleate
bleaching

Total kandungan fenolik dari biji kakao ditunjukkan pada Gambar 3. Biji kakao Malaysia
memiliki kandungan fenolik tertinggi, diikuti oleh Sulawesi, Ghana, dan Pantai Gading untuk
kedua pelarut, air dan etanol. Beberapa penelitian menunjukkan korelasi antara aktivitas
antioksidandankontenfenolik(Nagaietal,2003Veliogluetal,1998Yang,Lin,&Mau,2002).
Namun, berdasarkan carotene bleaching assay dalam penelitian ini menunjukkan tidak ada
korelasi antara aktivitas antioksidan dan konten fenolik untuk kedua ekstrak. Temuan ini sesuai
dengan Amarowicz, Wanasundara, Wanasundara, dan Shahidi (1993), yang melaporkan bahwa
biji rami dengan konten fenolik terendah, memberikan aktivitas antioksidan tertinggi. Selain itu,
aktivitasantioksidankemiri,jambumete(Tsuda,Makino,Kato,Osawa,&Kawakishi,1993)dan
soba (Sun & Ho, 2005) adalah berbanding terbalik dengan kandungan fenolik. Berdasarkan uji
pemucatan karoten, senyawa fenolik biji kakao lemah menghambat oksidasi karoten oleh
hidroperoksida. Aktivitas antioksidan tinggi yang ditunjukkan dapat juga terjadi karena adanya
senyawalainselainfenolikyangdapatlarutdalamairdanetanol.
Gambar 3. Kandungan total fenolik ekstrak biji kakao. Konsentrasi sampel adalah 0,01 g/mL.
Hasil ditunjukkan sebagai asam ferulat ekuivalen. Nilai ditampilkan sebagai ratarata standar
deviasi (n=3). Ratarata dengan huruf yang berbeda menunjukkan perbedaan yang signifikan
denganlevelp<0,05.

b. RadikalDPPH
Aksi penetralan radikal proton merupakan salah satu mekanisme yang digunakan untuk
mengukur kapasitas antioksidan. DPPH adalah salah satu senyawa yang memiliki sebuah proton
radikalbebasdanmenunjukkanserapanmaksimumpada517nm.KetikaDPPHbertemudengan
protondariradicalscavenger,warnaungumemudardengancepat.Pengujianinimenentukansisa
radikalDPPHyangbelumdistabilkanolehantioksidandalamektrak.
Ekstrak etanol biji kakao Ghana menunjukkan efek scavenging yang tertinggi dan Sulawesi
menunjukkan aktivitas terendah (Gambar 4). Biji kakao dari Pantai gading sedikit lebih tinggi
dibandingkanMalaysianamuntidakberbedasecarasignifikan.
Aktivitas scavenging ekstrak air dari yang tertinggi adalah Ghana>Malaysia>Pantai
Gading>Sulawesi.Adaperbedaanyangsignifikan(p<0,05)antarbijikakao.BijikakaoMalaysia
menunjukkan aktivitas scavenging yang signifikan lebih tinggi (p <0,05) dibandingkan dengan
Pantai Gading (Gambar 5). Aktivitas penetralan dari kedua ekstrak kakao pada DPPH radikal
meningkat pesat dari 0,622,5 mg/ml. Hasil menunjukkan bahwa aktivitas penetralan meningkat
denganmeningkatnyakonsentrasiekstrakhingga2,5mg/ml.Padakonsentrasi4,96mg/ml,ekstrak
etanol menunjukkan aktivitas penetralan lebih tinggi dari ekstrak air (Gambar. 4 dan 5). Sebuah
studi oleh Cheung et al. (2003) dari jamur (V. volvaco) ditemukan bahwa aktivitas penetralan
ekstrakmetanollebihtinggisecarasignifikandaripadaekstrakair.
 Nilai EC50 ditentukan dari grafik dengan memasukkan aktivitas penetralan terhadap
konsentrasikakaoekstrak.NilaiEC50didefinisikansebagaijumlahantioksidandiperlukanuntuk
mengurangikonsentrasiradikalawalDPPHsebesar50%(Tabel3).

Gambar4.ScavengingeffectekstraketanolikpadaradikalDPPH.Nilaiditunjukkansebagairata
rata standar deviasi (n=3). Asam askorbat digunakan sebagai standar. Koefisen varian kurang
dari12%.

Gambar5.ScavengingeffectekstrakairpadaradikalDPPH.Nilaiditunjukkansebagairatarata
standar deviasi (n=3). Asam askorbat digunakan sebagai standar. Koefisen varian kurang dari
20%.

The EC50 terendah menunjukkan kemampuan terkuat dari ekstrak untuk bertindak sebagai
penetral DPPH. Untuk ekstrak etanol, biji kakao Malaysia dan Ghana memiliki EC50 yang sama,
namun sedikit lebih rendah dari biji kakao Pantai Gading. Meskipun menunjukkan nilai yang
berbeda, tidak ada perbedaan yang signifikan di antara biji kakao tersebut. Nilai EC50 biji kakao
Sulawesiekstraketanoldanairtidakdapatditentukan.EkstrakairbijikakaoGhanamenunjukkan
EC50terendahdibandingkandenganbijikakaolainnya.EC50bijikakaoMalaysiasecarasignifikan
lebih tinggi (p <0,05) dibandingkan dengan biji kakao Ghana. Analisis varians mengungkapkan
perbedaan signifikan (p <0,05) antara nilainilai EC50 dari ekstrak etanol dan air. Sun dan Ho
(2005)melaporkankorelasisignifikanantaratotalfenolikdankemampuanpenetralanekstraksoba
pada radikal DPPH. Namun, penelitian ini menunjukkan tidak ada korelasi antara kemampuan
penetralandantotalfenolik.Temuaninimiripdenganhasilyangdiperolehdariujipemucatan
karoten.SebuahstudiolehYuetal.(2002)tidakmenemukankorelasiantaraaktivitaspenetralan
radikal dan total fenolik. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa kemampuan penetralan yang
tinggipadaradikalDPPHdapatdisebabkanolehkomponenselainsenyawafenolikdalamekstrak
bijikakao.

Tabel3.Scavengingactivity(EC50)bijikakaopadaradikalDPPH.

c. UjiFRAP(Ferricreducing/antioxidantpower)
EkstraketanolbijikakaoSulawesimenunjukkankapasitasantioksidantertinggiberdasarkan
ujiFRAP(Gambar6).BijikakaoMalaysiadanSulawesimemilikipotensiantioksidanyanglebih
tinggidibandingkandenganGhanadanPantaiGading.Untukekstrakair,bijikakaoSulawesijuga
memberikan kapasitas antioksidan tertinggi diikuti oleh Ghana, Malaysia dan Pantai Gading.
Semuaekstrakairmenunjukkanperbedaanpotensiantioksidanyangsignifikan(p<0,05),kecuali
GhanadenganMalaysia.PengujianFRAPmengukurpotensimereduksidarisenyawaantioksidan
berdasarkan reaksinya dengan kompleks tripiridiltriazinebesi (Fe3+TPTZ) dan menghasilkan
tripiridiltriazinebesi (Fe2+TPTZ) berwarna (Benzie & Saring, 1996, 1999). Umumnya, sifat
mereduksi berhubungan menunjukkan bahwa senyawa tersebut dapat memutus rantai radikal
bebas dengan mendonorkan ato hidrogennya (Gordon, 1990 Duh, Du, & Yen, 1999). Menurut
Benzie dan Strain (1996), reduksi kompleks Fe3+TPTZ menghasilkan kompleks Fe2+TPTZ
berwarnabiruterjadipadapHrendah.
Gambar 6. Kapasitas antioksidan ekstrak kokoa yang diuji menggunakan uji FRAP. Konsentrasi
sampel adalah 0,04 g/mL. Nilai ditunjukkan sebagai ratarata standar deviasi (n=3). Ratarata
denganhurufyangberbedamenunjukkanperbedaanyangsignifikandenganlevelp<0,05.

BijikakaoSulawesidanMalaysiadikenalmemilikipHkotiledonrendah,sementaraGhana
memilikipHsedang,danPantaiGadingmemilikipHtinggi(Misnawi,Jinap,Nazamid,&Jamilah,
2002). Potensi antioksidan tertinggi biji kakao Malaysia dapat disebabkan karena sifat kotiledon
sangatasam(rendahpH),yangbanyakberpengaruhpadapHmediumsaatpengujian.
Selain itu, ada korelasi positif antara hasil uji FRAP dan kandungan fenolik untuk ekstrak
etanol (r = 0,764) dan ekstrak air (r = 0,782). Hasil ini sesuai dengan Benzie dan Stezo (1999),
yangmenemukankorelasikuatantarakandunganfenolikdanujiFRAP.Gardner,White,McPhail,
dan Duthie (2000) telah menilai radikal bebas sintetik kalium nitrosodisulfonate (dengan
menggunakan electron spin resonance) dan Fe3+ (dengan menggunakan FRAP) dan menemukan
korelasi yang kuat dengan kandungan fenolik. Dalam penelitian ini, senyawa fenolik dari biji
kakao memberikan aktivitas yang tinggi dalam mereduksi Fe3+TPTZ. RiceEvans, Miller, dan
Paganga (1997) melaporkan bahwa senyawa fenolik memiliki sifat redoks, yang memungkinkan
untukbertindaksebagaireduktor,donaturhidrogen,danquenchersoksigensinglet.Potensiredoks
senyawafenolikmemainkanperanpentingdalammenentukankapasitasantioksidan(RiceEvans
etal.,1997).Analisavariansmenunjukkanbahwaekstraketanolbijikakaosignifikanlebihkuat(p
<0,05) mereduksi dibandingkan ekstrak air. Hal ini bisa disebabkan oleh tingginya jumlah
kandungan fenolik dalam ekstrak etanol, dibandingkan dengan ekstrak air. Cheung et al. (2003)
melaporkanbahwajumlahsenyawafenolikdalamekstrakorganiklebihtinggidaripadadiekstrak
air.
 Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa kapasitas antioksidan dan kandungan fenolik biji
kakao Malaysia sebanding dengan Pantai Gading, Ghana dan Sulawesian. Hal ini menunjukkan
bahwabijikakaoMalaysiamemilikikapasitasantioksidanyangmiripdenganbijikakaolainnya.
Jenis pelarut secara signifikan mempengaruhi kandungan fenolik dan kapasitas antioksidan biji
kakao. Ekstrak etanol menunjukkan antioksidan tertinggi pada pengujian dengan DPPH dan
FRAP,sedangkanekstrakairmenunjukkanaktivitasantioksidantertinggiketikadievaluasidengan
ujipemucatankaroten.Selainitu,kandunganfenoliktertinggiditemukandalamekstraketanol.
Berdasarkan pengujian antioksidan, diduga bahwa senyawa fenolik dalam ekstrak biji kakao
memilikikemampuanpenetralanradikaldanmereduksiferiyangkuatdibandingkanaktivitasnya
pada pengujian pemucatan karoten. Hal ini disebabkan oleh mekanisme antioksidan senyawa
fenolik terhadap radikal bebas. Selain senyawa fenolik, keberadaan metil xantin (teobromin dan
kafein) dan antosianin dalam biji kakao dapat mempengaruhi kapasitas antioksidan. Selain itu,
senyawainilarutdalamairatauairetanol.
Namun, ada beberapa keterbatasan metodologis untuk penentuan antioksidan (Kaur &
Kapoor, 2001). Metode yang paling banyak digunakan untuk mengukur aktivitas antioksidan
adalah dengan melibatkan generasi spesies radikal, di mana kehadiran antioksidan menentukan
hilangnyaradikalbebas(Cao,Alessio,&Cutler,1993).Olehkarenaitu,pentinguntukdilakukan
pengujian menggunakan beberapa metode daripada hanya menggunakan satu metode untuk
diperbandingkan.

2. Kandunganfenolikdankapasitasantioksidanbijikakaohibrida
Biji kakao tradisional dan hibrida diekstrak kandungan fenoliknya menggunakan 70%
metanol. Total ekstraksi fenolik diukur dan ditampilkan pada (Gambar 7). Semua varietas biji
kakao yang diuji memiliki kandungan senyawa fenolik relatif tinggi, yaitu sekitar 70 sampai 80
mg/g.Totalkandunganfenolikdaribijikakaotelahdilaporkanberkisarantara67dan149mg/g
daribijikakaosegardandari101144mg/gdaribijikakao2harifermentasi(Niemenak,Rohsius,
Elwers,Ndoumoua,&Lieberei,2006).Nilaidarihasilpenelitianinisedikitlebihrendah,halini
dapatdisebabkankarenabijidisimpansebelumdianalisaataukarenaperbedaanvarietas.Gambar
7 menunjukkan bahwa tidak ada perbedaan yang signifikan antara biji kakao hibrida dan
tradisional.
Gambar 7. Total fenolik terekstrak dari biji kakao tradisional dan hibrida. Nib giling dari biji
kakao tradisional (TV) dan hibrida (HV1HV4) diekstrak menggunakan 70% metanol dan total
fenolik ditentukan menggunakan Uji FolinCiocalteau. Hasil dihitung sebagai ekuivalen asam
ferulat dan ditampilkan sebagai ratarata dan SE (n=3). Tidak ada perbedaan yang signifikan
secarastatistikdarikelimabijikakaoyangdianalis.

Totalfenolikmerupakanindikatorpotensimanfaatgiziyangpotensialnamunprofilfenolik
yang sebenarnya lebih penting. Dengan demikian profil fenolik dari ekstrak yang dihidrolisis
alkalikemudianditentukanmenggunakanHPLC.ProfilHPLCditunjukkanpadaGambar2A.Dari
varietas yang dianalisa, diperoleh 25 puncak namun tidak dapat diidentifikasi jenis senyawanya.
Penelitian serupa dilakukan oleh Niemenak et al., (2006) namun tanpa tahapan hidrolisis alkali.
Hasilnya terdapat 8 peak, 3 diantaranya adalah teobromin, epikatekin, dan kafein. Analisa
komparatifdilakukandenganmembandingkanluaspuncakrelatifantara5varietasbijikakaoyang
berbeda.Masingmasingdari25peak,setelahdikoreksiuntukstandarinternal,dinyatakansebagai
persentasedaritotalluaskeseluruhan.Adaperbedaansejumlahkecilantarajenistradisionaldan
varietashibrida(Gambar2B).Nilaiuntukpuncak1dan3lebihtinggipadasemuavarietashibrida
dibandingkanjenistradisional.Peak11tidakhadirdalamvarietashibridatetapijugasangatrendah
dalam jenis tradisional. Puncak 17, 18, 19 dan 20, rendah di semua varietas hibrida, tidak
terdeteksi dalam jenis tradisional. Tidak ada perubahan yang konsisten dalam hibrida
dibandingkan dengan biji jenis tradisional karena kandungan tiap senyawa fenolik dalam biji
kakaohibridatidakberubahsecarasignifikandibandingkanbijikakaotradisional.
Gambar 8. Profil fenolik ekstrak metanol dari biji kakao kering. Biji kakao giling diekstrak
menggunakan70%metanoldanhasilekstraksidikeringkandandiberiperlakuanhidrolisisalkali
sebelum difraksinasi menggunakan HPLC pada deteksi panjang gelombang 280 nm. (A) typical
HPLC trace untuk varietas hibrida menunjukkan nomor puncak besar. IC = internal control
(hesperitin).(B)kontribusirelatiftiappuncakterhadapkandungantotalfenolik.Nilaiditampilkan
sebagai%daritotalareapuncaksetelahdikorelasikandenganinternalcontrol.

Kapasitas antioksidan biji kakao ditentukan menggunakan uji FRAP (Gambar 9). Hasilnya
12,47,3molTE/guntukvarietastradisional,sementaranilaiuntukhibridaberkisarantara21,6
+2,7hingga45,5+2,86molTE/g.NilaiuntukHV1(p=0,001),HV2(p=0,004)danHV3(p=
0,002) signifikan lebih tinggi dari biji tradisional. Nilai untuk HV4 lebih tinggi daripada biji
tradisional namun secara statistik tidak signifikan (p = 0.055). Hal ini sulit untuk dibandingkan
nilai kapasitas antioksidan dengan peneliti sebelumnya karena perbedaan di kedua metodologi
ekstraksidanuji.Namun,Gu,House,Wu,Ou,danPrior(2006)menggunakanekstraksetanoldan
ujiORACmelaporkannilai826+103molTE/guntukbubukkakaoalami.Nilainilaiinilebih
tinggidibandingpadapenelitianini.Fenoliksbgkomponenutamadaribijikakaoyangmerupakan
sumberutamakapasitasantioksidandalambijikakaodanproduknya.Othman,Ismail,Ghani,dan
Adenan (2007) meneliti mengenai kandungan fenolik dan kapasitas antioksidan dalam biji dari
berbagaikawasangeografisyangberbeda,termasukGhana,danhasilnyamenunjukkanbahwaada
pengaruh yang signifikan dari ''wilayah produksi" pada kedua parameter ini. Selain itu, ada
korelasi yang baik antara kandungan senyawa fenolik dengan kapasitas antioksidan. Demikian
pula, Gu et al. (2006) telah menunjukkan korelasi yang baik antara total fenolik dan kapasitas
antioksidan pada biji kakao dan produkproduk turunannya. Sangat menarik untuk dicatat dalam
penelitianini,bahwatotalkandunganfenoliktidakterpengaruhdalambijikakaohibrida,namun
kapasitas antioksidannya meningkat. Hal ini diduga karena terdapat senyawa antioksidan lain
dalambijikakao.

Gambar9.Kapasitasantioksidantotaldaribijikakaotradisionaldanhibrida.Nibgilingdaribiji
kakao tradisional (TV) dan hibrida (HV1HV4) diekstrak menggunakan 70% metanol dan total
kapasitas antioksidan ditentukan menggunakan uji FRAP. Hasil ditunjukkan sebagai ekuivalen
trolox dan ditampilkan sebagai ratarata dan SE (n=3). Nilai dengan tanda (*) menunjukkan
sampel memiliki kapasitas antioksidan yang signifikan (p<0,005) lebih tinggi dibandingkan biji
kakaotradisional(TV).

D. Kesimpulan
Wilayah produksi dan varietas memberikan sedikit pengaruh terhadap kandungan senyawa
fenolikdankapasitasantioksidandalambijikakao.Kandungansenyawafenolikdalambijikakao
tampaknya memiliki korelasi yang baik dengan kapasitas antioksidannya, namun masih ada
senyawaantioksidanlainyangjugaberperanpentingterkandungdalambijikakao.Haliniditandai
dengan kandungan total fenolik yang tidak berbeda nyata pada berbagai jenis kakao namun
memilikikapasitasantioksidanyangbervariasi.