LAPORAN PEWARNAAN BAKTERI (

PEWARNAAN GRAM )
Laporan pewarnaan gram

A. Tujuan
Mengetahui bakteri gram positif dan bakteri gram negatif

B. Dasar Teori
Pewarnaan pada bakteri dibagi menjadi tiga, yaitu :
1. Pewarnaan sederhana
Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak digunakan. Disebut
sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna untuk mewarnai organisme
tersebut. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan-pewarnaan sederhana
karena sitoplasamanya bersifat basofilik (suka dengan basa). Zat-zat warna yang digunakan
untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkolin. Dengan pewarnaan sederhana dapat
mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa yang biasa digunakan untuk
pewarnaan sederhana ialah metilen biru, kristal violet, dan karbol fuehsin yang mana
pewarnaan sederhana ini dibagi lagi menjadi dua jenis pewarnaan.

a. pewarnaan asam
Merupakan pewarnaan yang menggunakan satu macam zat warna dengan tujuan hanya untuk
melihat bentuk sel. Adapun zat warna yang dipakai dalam pewarnaan positif adalah metilen
biru dan air furksin.

b. Pewarnaan Basa
Pewarnaan basa atau negatif merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai bakteri tetapi
mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme
kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan
ukuran sel. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina.

2. Pewarnaan Diferensial (Gram)

Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies
bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif dan gram negatif, berdasarkan sifat
kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya,
ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (18531938) yang mengembangkan teknik ini pada
tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae.
Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada
metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna metil ungu
 gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram negatif tidak. Pada uji
pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu,
yang membuat semua bakteri gram negatif menjadi berwarna merah atau merah muda.
Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan
struktur dinding sel mereka.
a. Bakteri Gram Negatif
Bakteri gram negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada
metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan warna ungu gelap
setelah dicuci dengan alcohol, sementara bakteri gram negative tidak.
b. Bakteri Gram Positif
Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu sewaktu
proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop,
sedangkan bakteri gram negative akan berwarna merah muda. Perbedaan klasifikasi antara
kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri
(Aditya,2010)

Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu lipoposakarida
(lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat diwarnai dengan safranin akan
berwarna merah. Bakteri gram positif memiliki selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang
tebal. Setelah pewarnaan dengan kristal violet, pori-pori dinding sel menyempit akibat
dekolorisasi oleh alkohol sehingga dinding sel tetap menahan warna biru (Fitria, 2009).

Sel bakteri gram positif mungkin akan tampak merah jika waktu dekolorisasi terlalu lama.
Sedangkan bakteri gram negatif akan tampak ungu bila waktu dekolorisasi terlalu pendek
(Fitria, 2009).
Perbedaan relatif sifat bakteri gram positif dan gram negatif.
Sifat Bakteri garam (+) Bakteri gram negatif(-)
Komposisi dinding sel Kandungan lipid rendah (1- Kandungan lipid tinggi
4%)
Ketahanan terhadap Lebih sensitif Lebih tahan
penisilin
Penghambatan oleh Lebih dihambat Kurang dihambat
pewarna basa (VK)
Kebutuhan nutrisi Kebanyakan spesies relatif Relatif sederhana
kompleks
Ketahanaa terhadap Lebih tahan Kurang tahan
perlakuan fisik
(Manurung, 2010).
 Pewarnaan tahan asam yang umum digunakan adalah pewarnaan Zieh Neelson dengan
pewarna utama karbol fuksin dengan pemanasan dan pewarna tandingan metilen blue
Loeffler. Perlakuan panas tersebut diganti dengan penggunaan pembasah yaitu suatu deterjen
untuk mengurangi tegangan permukaan lemak, untuk menjamin penetrasi. Pewarna yang
mengandung pembasah ini disebut pewarna Kinyoun (Purwoko, 2010).

Sekali sitoplasma terwarnai, maka sel-sel organisme seperti mikobakteri menahan zat warna
tersebut dengan erat, artinya tidak terpucatkan sekalipun oleh zat yang bersifat keras seperti
asam alkohol (yaitu 3% HCL dalam etanol 95%). Alkohol asam ini merupakan pemucat yang
sangat intensif dan jangan dikelirukan dengan alkohol-aseton yang banyak digunakan dalam
prosedur pewarnaan Gram. Kondisi pewarnaan ini, organisme yang dapat menahan zat warna
itu dikatakan tahan asam dan tampak merah. Bakteri biasa yang dindingnya tidak bersifat
terlampau lipoidal, pewarna karbol fuksin yang mewarnai sel dapat dengan mudah
dipucatkan oleh alkohol-asam dan karenanya dikatakan tak tahan asam. Tercucinya karbol
fuksin dapat diperagakan oleh terserapnya pewarna tandingan biru metilen oleh sel, sehingga
bakteri tersebut tampak biru (Hadioetomo, 1993).

Pewarnaan Ziehl Neelsen. Larutan carbol fuchsin 0,3% dituang pada seluruh permukaan
sediaan, kemudian dipanaskan diatas nyala api sampai keluar asap tetapi tidak sampai
mendidih atau kering selama 5 menit. Sediaan kemudian dibiarkan dingin selama 5-7 menit
lalu kelebihan zat warna dibuang dan dicuci dengan air yang mengalir perlahan. Setelah itu
larutan asam alkohol 3% (hydrochloric acid-ethanol) dituang pada sediaan dan dibiarkan 2-4
menit kemudian dicuci dengan air mengalir selama 1-3 menit, kelebihan larutan dibuang.
Larutan methylene blue 0,1% dituang sampai menutup seluruh permukaan, dibiarkan 1 menit
lalu larutan dibuang dan dicuci dengan air mengalir (Karuniawati, 2005).

4. Pewarnaan Khusus
Pewarnaan khusus merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai struktur khusus atau
tertentu dari bakteri seperti bagian spora, kapsul, flagel dsb. Contoh pewarnaan khusus
:Pewarnaan Endospora Anggota dari genus Clostridium, Desulfomaculatum,
dan Bacillus adalah bakteri yang memproduksi endospora dalam siklus hidupnya. Endospora
merupakan bentuk dorman dari sel vegetatif, sehingga metabolismenya bersifat inaktif dan
mampu bertahan dalam tekanan fisik dan kimia seperti panas, kering, dingin, radiasi, dan
bahan kimia. Tujuan dilakukannya pewarnaan endospora adalah membedakan endospora
dengan sel vegetatif, sehingga pembedaannya tampak jelas. Endospora tetap dapat dilihat di
bawah mikroskop meskipun tanpa pewarnaan dan tampak sebagai bulatan transparan dan
sangat refraktil. Namun jika dengan pewarnaan sederhana, endospora sulit dibedakan dengan
badan inklusi (Aditya, 2010)
a. Pewarnaan kapsul
 Pewarnaan ini menggunakan larutan kristal violet panas, lalu larutan tembaga sulfat sebagai
pembilasan menghasilkan warna biru pucat pada kapsul, karena jika pembilasan dengan air
dapat melarutkan kapsul. Garam tembaga juga memberi warna pada latar belakang yang
berwana biru gelap.
b. Pewarnaan spora
Dinding spora relatif tidak permeable, namun zat warna bias menembusnya dengan cara
memanaskan preparat.
c. Pewarnaan flagel
Pewarnaan flagel dengan memberi suspensi koloid garam asam tanat yang tidak stabil,
sehingga terbentuk presipitat tebal pada dinding sel dan flagel.
d. Pewarnaan nucleoid
Pewarnaan nucleoid menggunakan pewarna fuelgen yang khusus untuk DNA (Rudi, 2010).

A. Alat dan Bahan

NO Alat Jumlah Bahan
Biakan murni B.
1 Jarum ose 1 cereus dan E.colipada
medium NA yang
berumur 24 jam
2 Pembakar 1 Aquades steril
spirtus
3 Kaca preparat 1 Larutan huckers
crystal violet
4 Pipet tetes 1 Larutan mordan lugol
iodine
5 Mikroskop 1 Larutan alkohol 96%
6 Gelas kimia 3 Larutan safranin
7 Kaca objek 1
8 Tabung reaksi 1

B.
Kaca Objek
Cara Kerja

Dibersihkan dengan menggunakan alkohol

Dikeringkan dengan cara dianging-anginkan pada api
 Kaca objek yang telah steril
Ditetesi aquades

Jarum ose

Dibakar sampai merah

Dicelupkan pada alkohol
Jarum ose yang steril
Dikeringkan dengan cara diangin-anginkan pada api

Sampel e.coli dan Bacillus

Diambil menggunakan jarum ose (medianya jangan sampai terambil).

Disimpan di atas kaca objek
Aduk pelan-pelan sampai tercampur dengan aquades yang telah ada pada kaca objek
Kaca objek yang telah berisi sampel
Dikeringkan dengan cara dipanaskan di atas api kecil.

Ditetesi violet sampai sampel bakteri terendam (diamkan selama 1 menit)

Dicuci dengan air yang mengalir
Ditetesi lugol sampai sampel bakteri terendam (diamkan selama 1 menit)
Dicuci dengan air yang mengalir
Ditetesi alkohol 96% ( diamkan selama 45 detik)
Dicuci dengan air yang mengalir
Ditetesi safranin sampai sampel bakteri terendam (diamkan selama 1 menit)
Dicuci dengan air yang mengalir
Dikeringkan pada udara terbuka
Hasil
Diamati dibawah mikrosko

A. Hasil Pengamatan dan Pembahasan

Tabel pengamatan
Gambar 1. Fiksasi Bakteri yang telah di ambil kemudian di
Sumber : dokumentasi Pribadi simpan pada kaca objek yang dicampur
dengan setetes aquades. Setelah itu

Gambar 2. Pada saat ditetesi violet
Sumber : dokumentasi pribadi
Gambar 3. Penambahan lugol
Sumber : dokumentasi pribadi
Gambar 4. Saat ditetesi alkohol 96%
Sumber : dokumentasi pribadi
Gambar 5. Pada saat ditetesi safranin
Sumber : dokumentasi pribadi
Gambar 7. Hasil pengamatan pada mikroskop (pembesaran 40x10)
Sumber : dokumentasi pribadi
Gambar B. cereus pada pembesaran 16x10
Sumber : Purna,2012.laporan praktikum mikrobiologi
Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak
digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting dalam
difiksasi di atas api sampai kering.
Pemanasan tidak boleh terlalu panas karena
bisa merusak sel bakteri.
Setelah difiksasi, sampel ditetesi violet.
Sampai bakteri terendam. Lalu biarkan
selama 1 menit. Setelah itu, cuci di air yang
mengalir. Hasilnya terdapat warna ungu
pada kaca objek.
Kemudian bakteri ditetesi lugol sampai
terendam lalu biarkan 1 menit dan cuci di
air yang mengalir. Setelah dicuci, kaca
objek tetap berwarna ungu akibat dari
tetesan violet.
Setelah ditetesi lugol dan dicuci, bakteri
ditetesi alkohol 96% dan dibiarkan selama
45 detik. Setelah itu, cuci di air yang
mengalir. Setelah dicuci, warna ungu pada
kaca objek menghilang akibat penambahan
dari alkohol.
Setelah warna ungu pada bakteri hilang,
kemudian bakteri ditetesi safranin sampai
terendam dan biarkan selama 1 menit.
Kemudian cuci di air yang mengalir.
Hasilnya, bakteri yang dihasilkan berwarna
merah muda.
Gambar 6. Hasil pewarnaan
Sumber : dokumentasi pribadi
langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan
peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri.
Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram
negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis.
Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis
membran sel (Manurung, 2010).

Penambahan violet pada bakteri. Kristal violet merupakan reagen yang berwarna ungu.
Kristal violet ini merupakan pewarna primer (utama) yang akan memberi warna pada
mikroorganisme target. Kristal violet bersifat basa sehingga mampu berikatan dengan sel
mikroorganisme yang bersifat asam. Dengan perlakuan seperti itu, sel mikroorganisme yang
transparan akan terlihat berwarna (ungu). Pemberian kristal violet pada bakteri gram positif
akan meninggalkan warna ungu muda. Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan
gram pada bakteri adalah didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri
gram positif mengandung protein dan gram negatif mengandung lemak dalam persentasi
lebih tinggi dan dinding selnya tipis. Kristal violet yang diteteskan didiamkan selama 1
menit bertujuan agar cat atau pewarna ini dapat melekat sempurna pada dinding sel bakteri.

Penambahan lugol pada bakteri. Lugol merupakan pewarna Mordan, yaitu pewarna yang
berfungsi memfiksasi pewarna primer yang diserap mikroorganisme target atau
mengintensifkan warna utama. Pemberian lugol pada pengecatan Gram dimaksudkan untuk
memperkuat pengikatan warna oleh bakteri. Kompleks zat lugol terperangkap antara dinding
sel dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari
dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alkohol memungkinkan hilang dari
sel. Lugol yang diteteskan didiamkan selama 1 menit bertujuan agar pengikatan warna oleh
bakteri menjadi semakin lebih kuat.

Selanjutnya, 1 tetes alkohol 96% diteteskan di atas objek glass tersebut kemudian didiamkan
selama 45 detik. Setelah itu, kaca objek dibilas dengan air hingga warnanya hilang. Etanol
95% merupakan solven organik yang berfungsi untuk membilas (mencuci) atau melunturkan
kelebihan zat warna pada sel bakteri (mikroorganisme). Tercuci tidaknya warna dasar
tergantung pada komposisi dinding sel, bila komponen dinding sel kuat mengikat warna,
maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat menelan
warna dasar, maka warna akan tercuci. Pemberian alkohol pada pengecatan ini dapat
mengakibatkan terjadinya dua kemungkinan yaitu mikroorganisme (bakteri) akan tetap
berwarna ungu atau bakteri menjadi tidak berwarna. Pemberian alkohol 96% juga
menyebabkan terekstraksi lipid sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel.

Selanjutnya diteteskan 1 tetes safranin di atas kaca objek tersebut kemudian didiamkan
selama 1 menit. Setelah itu, kaca objek dibilas dengan air hingga warnanya hilang. Safranin
 merupakan pewarna tandingan atau pewarna sekunder. Zat ini berfungsi untuk mewarnai
kembali sel-sel yang telah kehilangan pewarna utama setelah perlakuan dengan alkohol.
Dengan kata lain, safranin memberikan warna pada mikroorganisme non target serta
menghabiskan sisa-sisa cat atau pewarna. Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan
menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri gram negatif sedangkan pada bakteri
gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori pori mengkerut,
daya rembes dinding sel dan membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat
masuk sehingga sel berwarna ungu.

Pemberian reagen atau pewarna yang berganti dari satu pewarna ke pewarna lain dengan
waktu yang telah ditentukan disebabkan karena zat-zat warna tersebut dapat berikatan dengan
komponen dinding sel bakteri dalam waktu singkat. Karena itulah rentang waktu pemberian
zat warna yang satu ke yang lainnya tidak lama sehingga proses identifikasi bakteri
berlangsung cepat.

Setiap akhir pemberian reagen atau pewarna, selalu dilakukan pembilasan terhadap kaca
objekdengan menggunakan air. pembilasan ini bertujuan untuk mengurangi kelebihan setiap
zat warna yang sedang diberikan. Setiap akhir pembilasan pada masing-masing reagen, perlu
dilakukan penyerapan air bilasan dari air dengan menggunakan kertas tissu agar aquades
tidak tercampur dengan reagen atau pewarna baru yang akan diberikan. Setelah pembilasan
terakhir, gelas benda dikeringkan dan diamati di bawah mikroskop. Jika terbentuk warna
ungu maka termasuk golongan bakteri gram positif , dan jika terbentuk warna merah atau
merah muda maka termasuk golongan bakteri gram negatif.

B. Kesimpulan
Dari praktikum ini dapat disimpulkan bahwa, bakteri e.coli yang berwarna merah merupakan
gram negatif dan bacillus yang berwarna ungu merupakan gram positif.

Daftar Pustaka
Aditya,Mushoffa.2010.Teknik Pewarnaan Bakteri.
http://mushoffaditya.blogspot.com/2010/01/teknik-pewarnaan-bakteri.html. 11 November
2010

Fitria, Bayu. 2009. Pewarnaan Gram (Gram positif dan Gram

Negatif).http://biobakteri.wordpress.com/2009/06/07/7-pewarnaan-gram-gram-positif-dan-
gram-negatif. 11 November 2010.

Hadioetomo, R. S. 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta : Gramedia.

Karuniawati, Risdiyani, S. Nilawati, Prawoto, Y. Rosana, B. Alisyahbana, I. Parwati, Wia
Melia, dan T.M. Sudiro. 2005. Perbandingan Tan Thiam Hok, Ziehl Neelsen dan Fluorokrom
sebagai Metode Pewarna Basil Tahan Asam untuk Pemeriksaan Mikroskopik
Sputum. Makara Kesehatan Vol. 9 No. 1.

Manurung, Pebrin.2010.Pengamatan Bentuk Bakteri.

http://pebrinmanurung.blogspot.com/2010/10/pengamatan-bentuk-bakteri.html. 11 November
2010.

Purwoko, Tjahjadi. dkk. 2010. Petunjuk Praktikum Mikrobiologi. Laboratorium Mikrobiologi

UNS.
Diposkan 25th October 2013 oleh Ale