PRAKTIKUM BIOKIMIA BLOK HEMATOLOGI

DARAH

Tujuan Umum :

1. Memahami darah sebagai jaringan cairan tubuh yang mempunyai fungsi penting
2. Memahami hemolisa sel darah merah
3. Memahami zat-zat yang terdapat dalam darah

Tujuan Khusus :

1. Agar dapat mengenal susunan dan sifat-sifat darah

2. Agar dapat mengetahui faktor apa saja yang mempengaruhi hemolisa darah
3. Agar dapat mengetahui zat-zat normal maupun abnormal.

PRAKTIKUM DARAH

I. Definisi
Darah adalah jaringan yang beredar dalam sistem pembuluh darah yang sebenarnya
tertutup.

II. Fungsi
1. Respirasi : Transport oksigen dari paru-paru ke jaringan, dari jaringan ke paru-paru.
2. Gizi : Transport zat makanan yang diserap dari tractus digestivus.
3. Ekskresi : transport sisa-sisa metabolism (metabolit) yang tidak diperlukan untuk
tubuh melalui ginjal, paru-paru, kulit dan saluran pencernaan (usus) untuk dibuang.
4. Mempertahankan keseimbangan asam basa dalam tubuh
5. Mengatur keseimbangan air yang terdapat di dalam darah dan jaringan. Kelebihan air
akan dikeluarkan dari tubuh melalui ginjal, kulit, paru-paru dan saluran pencernaan.
6. Mengatur suhu tubuh dalam batas normal
7. Berperan dalam mengatasi suatu infeksi yang merupakan fungsi leukosit dan zat-zat
anti yang beredar dalam tubuh
8. Transport hormon
9. Transport metabolit

Jumlah darah dalam ± 5-7 % B.B atau ± 85 ml/kg BB pada laki-laki, sedangkan pada
wanita sedikit lebih rendah.

B.D. darah ± 1.054 – 1.060

Viskositas : 4,5 kali viskositas air. Viskositas ini berubah-ubah tergantung dari :

1. Jumlah sel yang ada

2. Suhu tubuh
3. Derajat hidrasi tubuh
 Karena keadaan 1,2 dan 3 itu dalam keadaan normal relative konstan maka viskositas
darah biasanya tidak dipengaruhi faal sirkulasi.

Rumus volume darah :

Volume darah total (L) = Volume plasma (L)

1 – Vp Rc

L = Liter
Vp RC = volume of packed Red Cells (Hematokrit)

III. Susunan darah

Terdiri dari :
1. Cairan (plasma)
2. Sel darah :
- Eritrosit
- Leukosit
- Trombosit
 Sel darah : pada laki-laki sel darah jumlahnya 45 % x volume darah total
 Plasma : merupakan 55 % volume darah, terdiri dari :
91-92 % air. 8-9 % zat-zat yang larut di dalamnya adalah :
- Protein ± 7 %
- Enzim
- Hormon
- Vitamin
- Lipid
- Asam Amino dan metabolitnya
- Urea
- Kreatin
- Kreatinin
- Anion, kation dan lain-lain.

IV. Tekanan Osmotik Darah

Tekanan Osmotik darah dipertahankan secara relatif konstan terutama oleh ginjal.
Tekanan osmotik dapat ditentukan oleh penurunan titik beku.
Titik beku rata-rata untuk seluruh darah telah ditentukan : -0,537oC. Ini sesuai dengan
tekanan osmotik 7-8 atmosfir pada suhu tubuh.
Tekanan osmotik seluruh darah ini sesuai dengan tekanan osmotik larutan NaCl 0,9
gram/L
Larutan garam NaCl ini dinamakan isotonik atau garam fisiologis.
Larutan lain yang isotonik dengan darah yaitu :
- Larutan Ringer
- Larutan Ringer-Locke dan Tyroda

Susunan sebagai berikut :

 Garam Ringer Ringer Tyroda
(%) (%) Locke (%) (%)
NaCl 0,9 0,86 0,9 0,8
CaCl 0,033 0,024 0,02
KCl 0,03 0,042 0,02
NaHCO3 0,01-0,03 0,1
Glukosa 0,10-0,2 0,01
MgCl2 0,01
NaH2PO4 0,005

Mekanisme pembekuan darah :

Jika darah diambil dari saluran system peredarannya maka darah-darah tersebut cenderung
untuk membeku. Pembekuan darah sebenarnya adalah fenomena plasma, dimana zarah-zarah
darah ditangkap oleh jaringan fibrin yang tampak seperti selai.

Jika bekuan ini dibiarkan akan mengkerut dan memeras cairan kuning keluar. Cairan ini
dinamakan serum. Jadi perbedaan kimiawi antara plasma dan serum ialah bahwa yang
terakhir ini tidak lagi mengandung fibrinogen yang telah diubah menjadi fibrin dalam proses
koagulasi. Mekanisme perubahan fibrinogen menjadi fibrin melibatkan beberapa komponen
plasma yaitu protoatrombin, ion Ca, Ac, globulin plasma (Ac = accelerator), factor anti
hemofilik, komponen tromboplastin plasma, prokonvertin dan beberapa factor jaringan dan
faktor trombosit.

Pada garis besarnya proses koagulasi dan trombosit berlangsung berurutan sebagai berikut :

1. Jaringan yang mengalami cedera dan trombosit yang mengalami aglutinasi (lisis)
melepaskan prekusor tromboplastin yang bereaksi dengan :
 Faktor antihemofilik (plasma)
 Komponen tromboplastin membentuk tromboplastin
2. Tromboplastin karena adanya ion Ca, mengubah protrombin menjadi thrombin.
3. Tromboplastin dengan adanya ion Ca dan konvertin mengubah protrombin menjadi
thrombin
4. Dengan adanya thrombin yang sedikit ini, Ac globulin plasma yang tadinya inaktif,
menjadi Ac globulin serum yang aktif.
5. Protombin dengan cepat diubah manjadi thrombin karena adanya :
- Ion Ca
- Tromboplastin
- Ac. Globulin serum
- Akselarator trombosit, (1) dan
- Konvertin
6. Thrombin mengkatalisis perubahan fibrinogen menjadi fibrin reaksi ini dipercepat oleh
akselerator trombosit (no.2)
Salah satu cara guna mencegah pembekuan darah ialah defibrinasi yaitu menghilangkan
fibrin, penambahan antikoagulan atau menurunkan kadar ion Ca yang ada dalam larutan
darah.
Defibrinasi dilangsungkan sebagai berikut :
Darah segera diaduk-aduk dengan sepotong kawat atau kaca
Pada prose pengadukan ini fibrin yang ada di dalam darah akan menempel pada batang
pengaduk, yang kemudian bisa dipisahkan. Darah yang telah difibrinasi ini tidak lagi
bisa menggumpal walaupun ditambahkan ion Ca ke dalamnya.
Cara yang dipergunakan pada yang terakhir ini ialah menambahkan ion oksalat atau ion
fluoride atau ion sitrat, ion tersebut akan bergabung dengan ion Ca membentuk garam
yang sukar larut atau sukar mendissosiasi.
Darah yang demikian itu disebut darah oksalat, darah fluorida atau darah sitrat.
Jenis darah tersebut diatas dapat digumpalkan lagi dengan membubuhkan CaCl2 ke
dalamnya.
Antikoagulan : kebanyakan antikoagulan yang sering dipakai umumnya bersifat dapat
mengikat ion Ca, kecuali heparin yang bersifat antitromboplastin (menghambat
pembentukan thrombin dari protrombin).
1) Heparin
Ini merupakan antikoagulan yang baik, sebab ia tidak mengubah susunan darah.
Dibandingkan dengan antikoagulan yang lain, heparin lebih mahal.
Heparin dipakai dalam bentuk garamnya dengan Na, Li atau Ca jumlah yang
diperlukan cukup 2 mg/100 ml darah. Pemakaian yang terlalu banyak mengakibatkan
pergeseran air antara sel dan plasma. Sehingga pemeriksaan kurang tepat.
2) K atau Na oksalat
Zat-zat ini mengandung ion Ca yang lazim dipakai ialah K oksalat, karena sifatnya
yang mudah larut. Untuk mencegah pembekuan darah diperlukan 10-20 mg/ 10 ml
darah. Dalam hal ini dinding tabung tempat penampungan darah diliputi dengan
lapisan K-oksalat yang tipis 0,1 ml larutan K-oksalat 30 % dimasukkan ke dalam
tabung untuk menampung darah, kemudian cukup kira-kira 10 ml darah.
3) Campuran Ammonium oksalat dan K-oksalat (dalam perbandingan 3:2). Untuk 1 ml
darah dibutuhkan 2 mg antikoagulan. Zat-zat ini tidak boleh dipakai pada penetapan
kadar urea. Protein atau non protein nitrogen menurut Kyeldahl, sebab penggunaan
garam – garam NH4 disini akan memberikan hasil kadar M yang lebih tinggi.
4) Na citrate
Sitrat tidak mengendapkan ion Ca, akan tetapi mengikat ion Ca. Ca sitrat yang
terbentuk tidak berionisasi, sehingga pembekuan terhalang. Untuk penetapan Ca
lebih baik dipakai serum, sebab pemakaian plasma sitrat dapat mengakibatkan
pergeseran air dari sel. Untuk mencegah pembekuan diperlukan 30 mg/10 ml darah.
5) Na-fluorida
Jumlah yang diperlukan untuk mencegah pembekuan lebih banyak dari pada
antikoagulan lainnya. Disamping sebagian antikoagulan fluoarida juga dapat
menghambat pekerjaan beberapa enzim sehingga juga dapat berfungsi
mempertahankan kadar beberapa macam zat (glukosa).
6) Ethylen Diamine Tetra Acid (EDTA)
 Chelating agent ini atau garamnya dapat menegah pembekuan darah dengan
mengikat ion Ca. Untuk penyelidikan darah lebih baik diambil setelah puasa 10-12
jam supaya dapat dibandingkan dengan harga-harga normal yang biasa ditetapkan
dalam keadaan puasa.
Jika didiamkan darah dapat mengalami perubahan-perubahan dan sebagainya :
 Perubahan zat-zat karena aktivitas enzim seperti :
- Glikolisis oleh enzim di dalam eritrosit dan lekosit (glukosa, piruvat, laktat)
- Pembentukan ammonia dari urea
- Peninggian fosfat organic plasma, karena terjadinya pemecahan ester fosfat di
dalam sel yang kemudian berdifusi keluar sel.
- Keluarnya zat-zat dari dalam sel.
 Pengeluaran CO2 karena tekanan parsiil CO2 darah lebih besar daripada pCO2
udara. Supaya didapatkan hasil yang baik pada penetapan susunan darah
terutama susunan kuantitatif, harus diperhatikan beberapa hal :
- Serum atau plasma harus secepat mungkin dipisahkan, untuk penetapan
macam-macam gas di dalam darah, darah ditampung dibawah parafin dan
plasma segera dipisahkan.
- Pemeriksaan hendaknya dilakukan tanpa menunggu terlalu lama, untuk
mencegah pengaruh enzim dan kuman-kuman. Alat-alat yang dipakai harus
bersih, jika mungkin steril dan kering. Jika akan disimpan, tergantung dari
jenis penetapan, darah serum atau plasma dicampur dengan Na-fluorida dan
disimpan dalam keadaan steril dan atau pada suhu rendah.
- Banyak penetapan zat di dalam darah dipengaruhi oleh zat lain dapat
mengganggu reaksi-reaksi maupun pembacaan pada kolorimeter. Gangguan –
gangguan seperti tersebut di atas juga dapat mengganggu pada penetapan
kadar glukosa darah yang didasarkan atas reduksi. Selain glukosa, dalam
darah juga terdapat zat-zat lain dengan daya reduksi. Oleh karena itu
diusahakan untuk mengendalikan protein dan zat-zat lain yang dapat
mereduksi. Untuk itu dikenal beberapa cara pembuatan filtrate darah yang
bebas protein seperti filtrate Folin-Wr, Somoyogi dan sebagainya yang akan
diterangkan sendiri.

V. Laju Endap Eritrosit

Pemeriksaan ini dipakai dalam klinik sebagai cara pemeriksaan non spesifik untuk
mengetahui adanya infeksi. Laju endapan eritrosit ini tergantung terutama dari
fibrinogen dan globulin serta konsentrasi sel darah merah. Fibrinogen dan globulin
dalam plasma disebut juga sebagai makromolekul asimetris plasma.
Bila konsentrasi makromolekul dalam plasma meningkat seperti pada pelbagai keadaan
radang, sel darah merah berkelompok dan mengendap lebih sempurna. Sehingga laju
endapan eritrosit meningkat. Cara yang paling sering dipakai untuk pengukuran laju
endapan eritrosit adalah teknik WINTROBE dan WESTERGREEN. Cara WINTROBE
memakai tabung 100 mm panjang. Cara WESTERGREEN memakai tabung 180 mm
panjang. Tabung westergreen mempunyai lubang yang lebih kecil. Darah diencerkan 1:3
 dengan larutan garam. Darah yang diencerkan dimasukkan dalam tabung pengulur dan
banyaknya endapan (sedimentasi) dicatat setelah 1 jam.

PRAKTIKUM DARAH

1. Hemolisa sel darah merah

Larutan hipotonis
Siapkan sederetan tabung reaksi berisi campuran berikut :
Tab Air (ml) NaCl 2 % (ml)
1 10,0 0,0
2 9,0 1,0
3 8,0 2,0
4 7,5 2,5
5 7,0 3,0
6 6,5 3,5
7 6,0 4,0
8 5,5 4,5
9 5,0 5,0
10 4,5 5,5
- Campur dengan baik pada masing-masing tabung
- Tambahkan 2 tetes eritrosit yang telah dicuci pada masing-masing tabung
- Campur lagi dengan membaliknya perlahan-lahan, lalu diamkan selama 1 jam.
- Catatlah derajad hemolisa pada masing-masing tabung
- Berapakah resistensi osmotic minimum sel darah merah?

2. Pengaruh zat kimia

- Isilah 6 tabung reaksi dengan 10 ml NaCl 0,9 %
- Tabung pertama digunakan sebagai control
- Pada kelima tabung lainnya diisi masing-masing dengan 2 tetes : chloroform, eter
aceton, toluene dan alcohol.
- Lalu pada keenam tabung tersebut tambahkan 2 tetes darah yang telah dicuci
- Kocok dan biarkan selama ½ jam
- Bandingkan dengan control

3. Pengaruh ion Ca
- Ke dalam 2 tabung reaksi ditambahkan masing-masing 2 ml darah oksalat (darah
sitrat) dan darah non fibrin.
- Kemudian ke dalam tiap tabung ditambahkan 5 tetes 5% CaCl2
- Kocoklah amati terjadinya pembekuan dan catat waktu pembekuan.

4. Pengendapan globulin
- Tambahkanlah 3 ml larutan (NH)4SO4 jenuh ke dalam tabung yang sebelumnya
telah diisi dengan 3 ml serum.
 - Gojoklah. Endapan globulin yang terjadi dipisahkan dengan jalan menyaring
larutan.
- Simpan filtrate untuk percobaan berikutnya
- Endapan diatas dipindahkan ke dalam tabung, kemudian dituangi sedikit air dan
digojok supaya bekuannya larut
- Encerkanlah dengan air.
- Biarkanlah dan catat apa yang terjadi

5. Pengendapan albumin
- Ke dalam filtrate (p.l) ditambahkan ammonium sulfat padat berlebihan. Gojoklah,
akan tampak terjadinya endapan (albumin)
- Saring endapannya dipindahkan ke dalam tabung, tambahkan air dan gojok
- Endapannya akan larut, encerkan lagi, biarkan.
- Amati dan catat ada atau tidak adanya endapan lagi.

6. Deproteinasi serum darah

- Tambahkan 5 ml darah dengan 10 ml air dan didihkan
- Selanjutnya tambahkan setetes demi setetes 2 % larutan asam asetat ke dalam
didihan diatas, sehingga terjadi endapan.
- Saringlah endapan yang terjadi
- Teteskan indicator khlorofenol merah. Kemudian asamkan hingga pH menunjukkan
5,4 (warna indikator tepat hilang)
- Didihkan dan bila perlu saringlah
- Filtrate ini dipergunakan untuk percobaan berikutnya

7. Uji klorida
- Ambil sedikit filtrate (pl) dan tambahkan 1 tetes HNO3 pekat dan beberapa larutan
AgNO3
- Larutan menjadi putih atau terjadi endapan putih
- Endapan akan larut lagi bila dituangkan NH4OH ke dalamnya.

8. Uji fosfat
- Tuangkan sedikit filtrate (pl) ke dalam tabung dan tambahkanlah beberapa tetes
ammonium molibdat dan 1 tetes HNO3 pekat.
- Panaskan akan terjadi endapan kuning.

9. Uji kalsium
- Tambahkan ke dalam filtrate (pl) beberapa tetes larutan Kalium oksalat
- Warna putih keruh atau terjadinya endapan putih menunjukkan adanya Ca dalam
filtrate

10. Uji Glukosa

- 2 ml sisa filtrate (pl) diatas dibubuhi dengan 2 tetes gliserol, sedikit bubuk Na2CO3
bebas air dan 2 tetes 2,5 % larutan CuSO4
 - Didihkan selama beberapa menit
- Bila terjadi warna kuning keruh atau merah bata maka hal itu menunjikkan adanya
glukosa (gula reduksi)

11. Pigmen Darah (Uji Benzidin)

- Encerkan satu tetes darah dengan 10 ml air
- Ambil 1 ml larutan diatas dan tambahkan berturut-turut 1,5 ml larutan Benzidin dan
0,5 ml larutan H2O2
- Amati warna biru yang terjadi

12. Uji Hematin

- Ratakanlah 1 tetes darah diatas obyek lalu keringkanlah diatas api kecil (keringkan
bagian bawah gelas)
- Tambahkan 2 tetes 0,1 5 larutan KCL dalam asam acetat glacial pada darah kering
diatas
- Tutuplah dengan gelas penutup dan panaskan di atas api kecil sampai mendidih.
- Tambahkanlah 1 atau 2 tetes pereaksi tersebut diatas melalui tepi gelas penutup dan
kemudian lihatlah di bawah mikroskop. Amati bentuk dan warna Kristal yang ada di
gelas obyek.