ISOLASI DAN IDENTIFIKASI Bacillus sp.

Oleh :
Nama : Dewi Apriyani
NIM : B1J009021
Kelompok :2
Rombongan :I
Asisten : Rosi Istiqomah

LAPORAN PRAKTIKUM BAKTERIOLOGI

KEMENTERIAN PENDIDIKAN NASIONAL

UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN
FAKULTAS BIOLOGI
PURWOKERTO
2011
 I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Menurut Soetarto (2008), Bakteri merupakan mikroba uniseluler yang

termasuk dalam kelas Shizomycetes. Pada umumnya bakteri tersebar luas di alam.
Ada yang hidup bebas, besifat saprofitik, parasit, atau patogen pada manusia,
binatang atau tumbuhan.ada beberapa jenis bakteri bersifat fotosinteteik. Ada tiga
bentuk dasar bakteri, yaitu bentuk bulat (coccus), batang (bacillus), dan melilit
(spiral) (Irianto, 2007). Identifikasi dan determinasi suatu biakan murni bakteri yang
diperoleh dari hasil isolasi dapat dilakukan dengan cara pengamatan sifat morfologi
koloni, morfologi sel bakteri, pengujian sifat-sifat fisiologi dan biokimianya. Selain
itu, identifikasi juga dapat dilakukan dengan pengujian sifat patogenitas dan
serologinya. Pertumbuhan bakteri di alam dipengaruhi oleh berapa faktor luar seperti
substrat pertumbuhan, pH, temperatur, dan bahan kimia.
Bakteri yang nampak, dapat memiliki morfologi yang sama, namun
keperluan nutrisi dan persyaratan ekologinya berbeda (Soetarto, 2008). Untuk
pengamatan morfologi bakteri dengan jelas, tubuhnya perlu diisi dengan cat warna,
pewarnaan ini disebut pengecatan bakteri ( Irianto, 2007). Menurut Pelczar (1958),
bentuk morfologi pertumbuhan koloni bakteri pada streak agar ada beberapa macam
yaitu filiform, villous, echinulate, bead, rhizoid, effuse, dan arborescent. Bentuk
pertumbuhan koloni pada nutrient cair yaitu pellicle, membranous, flocculent dan
ring. Bacillus Megaterium merupakan bakteri gram positif yang sering ditemukan di
tanah dan termasuk dalam genus Bacillus. Bakteri ini juga memiliki kemampuan
untuk membentuk endospora yang melindunginya dari perubahan lingkungan dengan
kondisi yang ekstrim. Bacillus Megaterium diklasifikasikan sebagai organisme
obligate aerob, yang berarti membutuhkan oksigen untuk hidup. Bakteri ini sangat
memerlukan kontak dengan udara langsung supaya dapat mereduksi unsur-unsur dan
oksigen. Semua genus Bacillus bersifat obligat aerob.
Secara teori, dalam medium cair bakteri akan bersifat aerob dan memiliki
bentuk koloni yang mengumpul di permukaan medium. Hasil pengamatan
menunjukkan suatu perbedaan bahwa koloni bakteri Bacillus Megaterium dalam
medium cair tersebar merata di seluruh bagian, dan bagian yang menumpuk terdapat
di bagian bawah medium. Hanya bakteri yang bersifat fakultatif anaerob yang
memiliki bentuk koloni seperti ini. Bentuk koloni Bacillus Megaterium dapat
menjadi tersebar dalam medium disebabkan terjadinya penggojogan medium ketika
melakukan pengamatan. Bentuk pertumbuhan koloni bakteri Bacillus Megaterium
dalam medium padat tegak adalah bead, Artinya koloni yang tumbuh pada garis
inokulasi terpisahkan. Sedangkan bentuk pertumbuhan koloninya pada medium padat
miring yaitu tipe echinulate, artinya batas pertumbuhan koloni bakteri mempunyai
bentuk yang menyerupaigigi atau titik-titik batas.

B. Tujuan

Tujuan dari praktikum ini adalah mengisolasi bakteri Bacillus sp. dan
mengidentifikasi bakteri Bacillus sp. Hasil isolasi dengan pendekatan mikrobiologis.
 II. MATERI DAN METODE

A. Materi

Alat yang digunakan adalah jarum ose, object glass, mikroskop,

mikrometer, kertas merang, tabung reaksi, pipet tetes, beaker glass, cawan petri,
oven, pembakar spirtus, inkubator, wrapper.
Bahan yang digunakan dalam praktkum ini adalah akuades, alkohol 70%,
Alumunium foil, medium Nutrient Agar (NA), Nitrat Broth (NB), Malachite Green,
Sterch Agar (SA), SIMA semisolid, Skim Milk Agar (SMA), Simon Citrat, MR-VP
Broth, KOH-alfanaftol, reagen A dan B, NB 0%, NB +Nacl (6,5%, dan 10 %),
Kristal Violet, lugol’s iodine, safranin, etanol 96%, reagen H2O2, media rafinosa,
laktosa, reagen oksidase.

B. Metode
a. Pengambilan Sampel
1. Tanah diambil secara aseptis
2. Alumunium foil disiapkan yang sebelumnya disterilkan terlebih dahulu
dengan alkohol 70%
3. Sampel diambil dengan cepat dan dengan hati-hati dimasukkan ke dalam
alumunium foil steril kemudian ditutup rapat.
b. Tahap Isolasi Bacillus
1. Preparasi suspensi dilakukan
2. Sampel tanah dimasukkan ke dalam tabung pengenceran pertama
3. Sampel tanah direbus pada suhu 80oC selama 10 menit
c. Tahap Pemurnian Dengan Metode Streak Kuadran
1. Dipilih satu koloni yang nampak terdiri dari satu tipe sel
2. Jarum ose dibakar, setelah dingin disentuhkan ke permukaan koloni bakteri
yang akan disteak pada plating NA
3. Streak ini dianggap sebagai sterak primer pada permukaan NA
4. Jarum ose dibakar, diangkat lalu didinginkan dan disteakan melewati streak
primer kesatu atau kedua dan kemudian dilanjutkan kestreak sekunder tanpa
kembali kestreak primer
 5. Jarum ose dibakar, diangkat lalu didinginkan melewati streak sekunder dan
kemudian dilanjutkan kestreak tersier tanpa kembali kestreak primer dan
sekunder diinkubasi pada suhu 30oC selama 2 x 24 jam
d. Pengamatan Morfologi Koloni
1. Dibuat biakan pada media Nutrient Agar (NA) cawan
2. Diinkubasi 2 x 24 jam pada suhu 30oC
3. Diamati perbedaan bentuk koloni, ukuran, margin, elevasi, dan permukaan.
e. Pengukuran Panjang Dan Lebar Sel
1. Disiapkan mikroskop yang telah dipasang mikrometer okuler yang sudah
terkalibrasi
2. Dibuat preparat ulas bakteri uji dengan metode pewarnaan sederhana
mengggunakan pewarna Methylen Blue
3. Diukur panjang dan lebar sel, kemudian dihitung panjang dan lebar sel
sebenarnya
f. Uji Pewarnaan Gram
1. Dibuat ulasan bakteri pada object glass, kemudian difiksasi
2. Ditetesi dengan gram A (Kristal violet), dibiarkan selama 60 detik
3. Dicuci dengan air mengalir, lalu dikeringanginkan
4. Ditetesi dengan gram B (lugol’s iodine), dibiarkan selama 60 detik
5. Dicuci dengan air mengalir, lalu dikeringanginkan
6. Dicuci dengan gram C(ethanol 96%) setetes demi settee sampai etanol yang
jatuh berwarna bening
7. Ditetesi dengan gram D (safranin), dibiarkan selama 45 detik, dicuci dan
dikeringanginkan
8. Diamati dibawah mikroskop
g. Uji Pewarnaan Endospora
1. Dibuat ulasan bakteri pada object glass lalu ditutupi dengan kertas merang
2. Ditetesi dengan Malachite Green diatas kertas merang dan diletakkan di atas
air mendidih
3. Dibiarkan selama lim menit, jika pinggir mulai mongering, ditambahkan lagi
Malachite Green
h. Uji Motilitas
1. Diinokulasikan bakteri uji pada medium SIMA semisolid sebanyak 1 ose
2. Diinkubasi selama 2 x 24 jam pada temperatur 30oC
3. Dilihat pertumbuhan koloni bakterinya yang ada pada amedium SIMA
semisolid
i. Uji Hidrolisis Starch
1. Diinokulasikan bakteri uji pada medium padat Starch Agar sebanyak 1 ose.
2. Diinkubasi selama 2 x 24 jam pada temperature 30oC
3. Permukaan media ditetesi dengan larutan Lugol’s Iodine.
4. Diamati perubahan yang terjadi, jika terbentuk zona jernih di sekitar koloni
menandakan hasil uji positif, dan jika tidak terbentuk zona jernih (warna biru
reagen) menandakan hasil uji negatif
j. Uji Hidolisis kasein
1. Diinokulasikan bakteri uji pada medium padat SMA sebanyak 1 ose.
2. Diinkubasi selama 2 x 24 jam pada temperatur 30oC
3. Diamati perubahan yang terjadi, jika terbentuk zona jernih di sekitar koloni
menandakan hasil uji positif, dan jika warna media tetap menandakan hasil
uji negatif
k. Uji VP (Voges Proskauer)
1. Diinokulasikan bakteri uji pada medium cair MR-VP sebanyak 1 ose
2. Diinkubasi selama 2 x 24 jam pada temperatur 30oC
3. Bakteri ditetesi dengan alfanaftol 3 tetes dan KOH 40 % 2 tetes
4. Diamati perubahan yang terjadi, jika media berubah menjadi merah muda s.d
merah setelah penambahan alfanaftol dan KOH 40% menandakan hasil uji
positif, dan jika tidak terbentuk warna tersebut maka menandakan hasil uji
negatif
l. Uji Katalase
1. Dibuat preparat ulas bakteri pada objek glass
2. Ditetesi dengan larutan H2O2
3. Diamati perubahan yang terjadi
4. Jika terbentuk gelembung gas menunjukka bahwa hasil uji positif dan
sebaliknya
m. Uji Oksidase
1. Dibuat preparat ulas bakteri pada objek glass, tutup dengan potongan tissue
2. Ditetesi dengan reagen oksidase
3. Diamati perubahan yang terjadi
4. Hasil positif jika berwarna biru marun, hasil uji negatif yaitu tidak terbentuk
warna biru marun
n. Uji Penggunaan Sitrat
1. Diinokulasikan bakteri uji pada medium agar miring Simon’s Citrate
sebanyak 1 ose
2. Diinkubasi selama 2 x 24 jam pada temperatur 30oC
3. Diamati perubhan yang tejadi, jika hasil positif media berwarna biru
sedangkan hasil negatif tetap berwarna hijau.
o. Uji Gula
1. Bakteri uji ditumbuhkan pada medium Rafinosa dan Laktosa
2. Diinkubasi selama 2 x 24 jam pada temperatur 30oC
3. Diamati perubahannya, hasil positif jika media berubah warna dari ungu
menjadi kuning dan hasil negatif jika media tetap berwarna ungu.
p. Uji Reduksi Nitrat
1. Diinokulasikan bakteri uji pada medium cair Nitrate Broth sebanyak 1 ose
2. Diinkubasi selama 2 x 24 jam pada temperatur 30oC
3. Diteteskan 1 ml nitrat reagen A dan dilanjutkan dengan nitrate reagen B
4. Hasil positif jika terbentuk warna merah tua/ merah gelap, jika belum
terbentuk warna merah, ditambahkan bubuk seng (sampai dengan 5 mg/ml
media) dan diamati jika terbentuk warna merah maka hasi pengujian positif
q. Uji Toleransi NaCl
1. Dibuat tiga buah tabung Nutrient Broth yang mengandung Nacl 0%, 6,5 %,
dan 10 %
2. Isolat diinokulasikan dengan streak kontinyu
3. Diinkubasi selama 2 x 24 jam pada temperatur 30oC
4. Diamati hasilnya dengan melihat tingkat kekeruhan pada media
R. Penentuan Spesies Melalui Pendekatan Homologi
1. Data-data yang diperoleh dibandingkan dengan data karakter bakteri dari
sumber
2. Ditentukan persen homologinya dengan rumus
% Homologi = Jumlah karakter yang sama x 100%
Jumlah karakter yang diujikan
 III. HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil

Pemurnian Pemurnian Stok

Uji Gula Pewarnaan Gram Pewarnaan

Endospora

Uji Hidrolisis Casein Uji Oksidase MR VP negatif

Toleransi NaCl MR VP (sebelum perlakuan) Uji
0%, 6,5%, 1% dan Nitrat Broth Hidrolisis Starch

Uji Katalase Uji Motilitas Uji Penggunaan

Sitrat
Tabel 1. Hasil Uji Terhadap Bakteri Dari Tanah TPA

Uji Hasil
Pewarnaan Gram Gram Positif
Pewarnaan Endospora + berwarna biru
Uji Motilitas -
Uji Hidrolisis Starch +
Uji Hidrolisis Kasein +
Uji VP -
Uji Katalase +
Uji Oksidase +
Uji Penggunan Sitrat +
Uji Gula (Rafinosa & Laktosa) -
Uji Toleransi NaCl -

Hasil Persen Homologi

 Uji Hasil B. B. B. B. B.
subtilis polymyxa cereus antrachis megaterium
1. Pewarnaan + + + + + +
Gram
2. Pewarnaan + + + + +
Endospora +
3. Uji Motilitas - + + + - +
+
4. Uji + + + + + +
Hidrolisis
Starch
5. Uji + + - + + +
Hidrolisis
Kasein
6. Uji VP - + - + + -
7. Uji Katalase + + + + + +
8. Uji Oksidase + + - - +
9. Uji + + - + + +
Penggunaan
Sitrat
10. Uji Gula - - + - - -
11. Uji - + - + + +
Toleransi
Nacl
Jumlah 8 5 7 8 9
Karakter
yang sama
% Homologi = Jumlah karakter yang sama x 100%
Jumlah karakter yang diujikan

=9 = 81,82%
11
 B. Pembahasan

Berdasarkan kunci identifikasi, hasil uji terhadap bakteri yang diisolasi dari
tanah TPA, didapatkan hasil identifikasinya yaitu Bacillus megaterium. Cirinya yaitu
bakteri gram positif, menghasilkan endospora pada lingkungan yang bersuhu tinggi,
motil, mampu menghidrolisis starch dan casein, uji VP negative, uji katalase dan
oksidase positif, mampu menggunakan sitrat, uji gula (rafinosa dan laktosa) negatif,
dan tidak toleran terhadap konsentrasi NaCl tinggi (Cowan, 1974). Dengan
diketahuinya genus dari masing-masing bakteri maka identifikasi dapat dilanjutkan
hingga ke tahap penentuan spesies. Dilakukan kembali serangkaian uji biokimia yang
sesuai untuk penentuan spesies pada Genus Bacillus. Teori dari identifikasi bakteri
dengan teknik konvensional adalah membandingkan bakteri yang sedang
diidentifikasi dengan bakteri yang telah teridentifikasi sebelumnya. Bila tidak
terdapat bakteri yang ciri-cirinya 100% serupa, maka dilakukan pendekatan terhadap
bakteri yang memiliki ciri-ciri yang paling menyerupai (Dwipayana, 2008).
Cara untuk mendapatkan biakan murni disebut isolasi. Isolasi merupakan
salah satu tahapan yang sangat penting dalam Industri. Isolat yang diperoleh dan
bersifat unggul akan digunakan untuk memproduksi senyawa yang bernilai ekonmis.
Mikroba dapat diisolasi dari alam: sayur, buah-buahan (segar atau busuk) tanaman,
hewan tanah, lumpur danau atau sungai, limbah dan sebagainya. Namun untuk
mendapatkan isolat yang lebih spesifik, isolasi dilakukan dari lingkungan khusus atau
kondisi lingkungan yang ekstrim, seperti mikroba temofilik dapat diisolasi dari
lingkungan air panas. Karakterisasi atau penentuan sifat fisiologis mikroba,
merupakan dasar dalam identifikasi mikroba secara sistematik. Selain itu
pengetahuan tentang sifat fisologis isolat juga diperlukan dalam kemudahan proses
pemeliharaan dan optimisasi proses fermentasi. Beberapa karakter yang perlu
diketahui dari isolat, antara lain adalah;
a. Morfologi dan struktur sel (spora,flagel)
b. Sifat Gram
c. Morfologi koloni pada media padat
d. Sifat petumbuhan pada medium cair
e. Kebutuhan oksigen
f. Kebutuhan energi dan nutrien
g. Suhu dan pH optimal untuk pertumbuhan
h. Kurva pertumbuhan Selanjutnya identifikasi isolat dapat dilakukan dengan
berbagai cara, antara lain berdasarkan:
a. Reaksi enzimatik/tes biokimia: fermentasi gula, TSIA, Indol, Metil red, Vouges
Pros kauer, Citrat, Urease, katalase, oksidase dan sebagainya
b. Tes serologi: yakni reaksi antigen dengan antibodi
c. Sifat genetik: yakni dengan menentukan komposisi basa, urutan basa nukleotida
dan hibridisasi DNA
d. Urutan asam amino: urusan asam amino yang menyusun protein adalah spesifik,
karena merupakan merupakan refleksi dari urutan basa DNA, dan lain-lain
(Yulneriwarni, 2008).
Mikroba tanah merupakan berbagai jenis mikroorganisme yang hidup di tanah.
Jumlah dan jenis mikroorganisme yang hidup ditanah tergantung dari ciri- ciri
lingkungan tanah dan unsur– unsur yang terkandung di dalam tanah tersebut.
Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan, dalam setiap hektar tanah terdapat
2.200 kilogram jamur, 1.100 kilogram bakteri, 220 kilogram protozoa, 125 kilogram
algae, dan 125 kilogram ragi (Dinata, 2002). Salah satu mikroorganisme yang hidup
dalam tanah adalah bakteri. Bakteri tersebut berperan penting dalam proses
penguraian unsur dan senyawa-senyawa yang terkandung dalam tanah menjadi
senyawa atau unsur yang bermanfaat bagi jasad hidup lainnya.

Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan, bakteri yang biasa terdapat dalam
tanah adalah Arthrobacter (5- 60% ) , Bacillus (7- 67%), Pseudomonas (3- 15%),
flavobacterium (2- 10%), dan Alkaligenes (2- 12%). Sedangkan untuk
Corynebacterium, Xanthomonas, Sarcina, Mycobacterium dan Staphylococcus
kurang dari 5% ( Suwandi., 1993). Berdasarkan data tersebut, dapt diketahui bahwa
Bacillus merupakan genus yang paling banyak terdapat di dalam tanah. Genus
Bacillus ini pun dilaporkan merupakan salah satu bakteri proteolitik.

Identifikasi dan determinasi suatu biakan murni bakteri yang diperoleh dari
hasil isolasi dapat dilakukan dengan cara pengamatan sifat morfologi koloni,
morfologi sel bakteri, pengujian sifa-sifat fisiologi dan biokimianya. Selain itu,
identifikasi juga dapat dilakukan dengan pengujian sifat patogenitas dan serologinya.
Pertumbuhan bakteri di alam dipengaruhi oleh berapa faktor luar seperti substrat
pertumbuhan, pH, temperatur, dan bahan kimia. Bakteri yang nampak dapat memiliki
morfologi yang sama, namun keperluan nutrisi dan persyaratan ekologinya berbeda
(Soetarto, 2008). Untuk pengamatan morfologi bakteri dengan jelas, tubuhnya perlu
diisi dengan cat warna, pewarnaan ini disebut pengecatan bakteri (Irianto, 2007).

Bacillus Megaterium merupakan bakteri gram positif yang sering ditemukan di

tanah. Bakteri ini juga memiliki kemampuan untuk membentuk endospora yang
melindunginya dari perubahan lingkungan dengan kondisi yang ekstrim. Bacillus
Megaterium diklasifikasikan sebagai organisme aerob obligat, yang berarti
membutuhkan oksigen untuk hidupnya. Bakteri ini sangat memerlukan kontak
dengan udara langsung supaya dapat mereduksi unsur-unsur dan oksigen. Semua
genus Bacillus bersifat obligat aerob. Secara teori, dalam medium cair bakteri ini
akan bersifat aerob dan memiliki bentuk koloni yang mengumpul di permukaan
medium. Hasil pengamatan menunjukkan suatu perbedaan bahwa koloni bakteri
Bacillus Megaterium dalam medium cair tersebar merata di seluruh bagian, dan
bagian yang menumpuk terdapat di bagian bawah medium. Hanya bakteri yang
bersifat fakultatif anaerob yang memiliki bentuk koloni seperti ini. Bentuk koloni
Bacillus Megaterium dapat menjadi tersebar dalam medium disebabkan terjadinya
penggojogan medium ketika melakukan pengamatan (Aksoy, 2002).

Bentuk pertumbuhan koloni bakteri Bacillus Megaterium dalam medium

padat tegak adalah bead, Artinya koloni yang tumbuh pada garis inokulasi
terpisahkan. Sedangkan bentuk pertumbuhan koloninya pada medium padat miring
yaitu tipe echinulate, artinya batas pertumbuhan koloni bakteri mempunyai bentuk
yang menyerupai gigi atau titik-titik batas. Macam uji biokimiawi pada Bacillus sp.
Antara lain sebagai berikut :
1. Pewarnaan Sederhana

Pada pewarnaan sederhana bakteri Bacillus Megaterium zat pewarna yang

digunakan adalah kristal violet. Biakan murni diambil dari tabung reaksi
secara aseptik dan diletakkan langsung pada objek glass kemudian difiksasi
agar protein bakteri terkoagulasi serta dapat menempel pada objek glass dan
tidak ikut tercuci sewaktu dibilas dengan akuades. Hal yang dilakukan
selanjutnya adalah mengamati dalam mikroskop. Sel bakteri berukuran sangat
kecil dan tebal lapisan air tipis diantara cover glass dan objek glass masih
bisa menampung beberapa bakteri bacillus yang ditumpuk vertikal, artinya
 tebal tersebut masih bisa digunakan sel untuk berenang ke atas dan ke bawah.
Jangan menganggap gambar yang terlihat pada mikroskop adalah gambar
datar. Kontrol sangatlah penting, meskipun kita sulit untuk mendapatkannya.
Akan tetapi lebih baik jika bakteri yang dilihat dapat dibandingkan dengan
bakteri lain yang telah diketahui bentuknya dengan pasti. Dari pengamatan
mikroskopis diperoleh bentuk morfologi dari bakteri Bacillus Megaterium
yaitu strukutr morfologinya berbentuk batang (bacil), dan susunan bakterinya
adalah berantai.
2. Pewarnaan Gram

Pewarnaan gram pada Bacillus Megaterium digunakan empat pewarna, yaitu

Kristal violet sebagai pewarna utama, iodine sebagai pengikat warna utama
(mordant), alkohol sebagai dekolorisasi, dan safranin sebagai pewarna
tandingan. Pada pengamatan dengan menggunakan mikroskop nampak
Bacillus Megaterium berbentuk basil (batang) dan merupakan bakteri gram
positif. Ini bisa diketahui saat tahap dekolorisasi. Pada tahap tersebut warna
yang dihasilkan sama dengan warna utama, yaitu warna ungu. Ini
menunjukkan bahwa pada Bacillus Megaterium memiliki dinding yang tebal
sehinnga saat bakteri mengalami dehidrasi, pori-porinya menciut yang
akhirnya menyebabkan warna utama tidak bisa keluar. Pada Bacillus
Megaterium, koloninya bergerombol sedikit terpisah-pisah bahkan
membentuk rantai panjang. Bacillus Megaterium merupakan bakteri gram-
positif yang berbentuk batang,dan secara alami sering ditemukan di tanah dan
vegetasi. Bacillus Megaterium juga telah berevolusi sehingga dapat hidup
walaupun di bawah kondisi keras dan lebih cepat mendapatkan perlindungan
terhadap stres situasi seperti kondisi pH rendah (asam), bersifat alkali,
osmosa, atau oxidative kondisi, dan panas atau etanol.
3. Pewarnaan Spora
Pewarnaan Spora pada Bacillus Megaterium tidak mudah diwarnai dengan
zat pewarna pada umumnya, akan tetapi apabila sekali diwarnai, zat warna
tersebut akan sulit hilang. Hal inilah yang menjadi dasar dari metode
pengecatan spora secara umum. Pada metode Schaeffer-Fulton yang banyak
dipakai dalam pengecatan endospora, endospora diwarnai pertama dengan
 malachite green dengan proses pemanasan. Larutan ini merupakan pewarna
yang kuat yang dapat berpenetrasi ke dalam endospora. Setelah perlakuan
malachite green, biakan sel dicuci dengan air lalu ditutup dengan cat safranin.
Teknik ini akan menghasilkan warna hijau pada endospora dan warna merah
muda pada sel vegetatifnya. Bacillus Megaterium memiliki endospora,
endospora lebih tahan lama meski dalam keadaan lingkungan ekstrim seperti
kering, panas, atau bahan kimia yang beracun. Selain itu, endospora juga
lebih tahan terhadap pewarnaan. Sekali berhasil diwarnai, spora sangat sukar
untuk melepaskan zat warna sehingga saat diberi warna dari saftranin tetap
berwarna hijau karena spora sudah mengkiat malachit green dan sulit
mengikat warna yang diberikan kemudian.
Karakterisasi dan klasifikasi sebagian besar mikroba seperti bakteri
berdasarkan pada reaksi enzimatik ataupun biokimia. Mikroba dapat tumbuh pada
beberapa tipe media, memproduksi tipe metabolit tertentu yang dideteksi dengan
interaksi mikrobia dengan reagen test yang menghasilkan warna reagen. Reaksi-
reaksi dalam sel akan teridentifikasi dengan melakukan pengujian-pengujian tertentu.
Sel akan memberikan respon sesuai dengan kemampuan yang dimilikinya, misalnya
menghasilkan enzim katalase, enzim gelatinase atau kemampuan untuk
menghidrolisis lemak (Pelczar dan Chan, 1986).
Secara morfologis, biakan maupun sel bakteri yang berbeda dapat tampak
serupa. Karena itu ciri fisiologis atau biokimiawi merupakan kriteria yang amat
penting di dalam identifikasi spesimen yang tidak dikenal. Tanpa hasil pengamatan
fisiologis yang memadai mengenai organisme yang diperiksa maka penentuan
spesiesnya tidaklah mungkin dilakukan. Oleh karena itu percobaan ini penting
dilakukan, karena dengan melakukan uji biokimia kita dapat mengidentifikasi
organisme tak dikenal (Hadieotomo, 1993). Uji fisiologi biasanya identik dengan uji
biokimia. Uji-uji biokimia yang biasanya dipakai dalam kegiatan identifikasi bakteri
atau mikroorganisme yang antara lain uji katalase, koagulase, uji nitrit, hidrolisis
gelatin, uji hidrolisis kanji, uji hidrogen sulfit dan lain-lain. Pengujian biokimia
merupakan salah satu hal yang sangat penting dalam dunia mikrobiologi (Lim, 1998).
Uji-uji biokimia yang biasanya dipakai dalam kegiatan identifikasi bakteri
atau mikroorganisme yaitu antara lain adalah uji koagulase, uji katalase, uji MRVP,
uji nitrit, hidrolisis gelatin, uji H2S dan lain-lain. Salah satu uji yaitu adalah uji
hidrolisis urea. Uji ini sangat penting dalam identifikasi bakteri-bakteri patogen
penghuni usus, begitu pula uji yang lain sebenarnya digunakan untuk
mengidentifikasi bakteri dengan karakter tertentu, yang mana dengan karakter
tersebut ia dapat dibedakan dengan jelas dari bakteri-bakteri yang lain yang hidup
disekitarnya (Dwidjoseputro, 1994). Kebanyakan bakteri aerobik dan anaerobik
fakultatif akan memproduksi hidrogen peroksida yang bersifat toksik terhadap
bakteri yang masih hidup. Untuk menjaga kelangsungan hidupnya, sejumlah bakteri
mampu menghasilkan enzim katalase yang memecah H 2O2 menjadi air dan oksigen
sehingga sifat toksiknya hilang (Pelczar dan Chan, 1986). Matinya bakteri-bakteri
anaerobik obligat bila ada oksigen disebabkan karena tidak adanya pembentukan
enzim katalase sehingga H2O2 meracuni bakteri itu sendiri. Ada tidaknya
pembentukan enzim katalase dapat membantu pembedaan kelompok-kelompok
bakteri tertentu. Pada uji katalase, kebanyakan bakteri aerob dan anaerob
menggunakan oksigen H2O2 yang sesungguhnya bersifat racun bagi sistem-sistem
enzim sendiri. Namun, mereka tetap dapat hidup dengan adanya racun tersebut
karena akan meghasilkan enzim katalase (Hadieotomo, 1993).
Uji katalase merupakan suatu pengujian terhadap bakteri tertentu untuk
mengetahui apakah bakteri tersebut merupakan bakteri aerob, anaerob fakultatif, atau
anaerob obligat. Bakteri yang memerlukan oksigen manghasilkan hidrogen peroksida
(H2O2) yang sebenarnya beracun bagi bakteri sendiri. Namun mereka dapat tetap
hidup dengan adanya antimetabolit tersebut karena mereka menghasilkan enzim
katalase yang dapat mengubah hidrogen peroksida menjadi air dan oksigen. Letak
endospora yang berbeda diantara spesies bakteri dapat digunakan untuk identifikasi.
Tipe utama diantara terminal, subterminal dan sentral. Tipe sentral atau tengah
merupakan lokasi dari sel vegetatif yang letaknya tepat di tengah. Tipe terminal
memiliki pengertian letak el vegetatif diantara ujung dan pinggir dari sel vegetatif.
Tipe subterminal berarti lokasi endosporanya diantara tengah dan pinggir dari sel
vegetatif. Endospora dapat berukuran lebih besar ataupun kecil dari sel vegetatif
yang terdiri dari lapisan protein yang terbuat dari keratin. Spora ini memiliki
resistensi yang tinggi terhadap pewarnaan, prosedur pewarnaan dengan malachite
green adalah dengan pemanasan. Endospora merupakan metode pertahanan hidup
yang bukan bertujuan untuk reproduksi. Contohnya Bacillus Megaterium memiliki
endospora yang terletak di sentral (Ncbi, 2008).

Motilitas dapat diamati dengan baik pada biakan yang masih baru. Pada
biakan yang sudah lama, bakteri sudah mati, sehingga sangat sukar untuk
mendapatkan sel yang motil, selain itu produksi asam dan produk yang bersifat racun
dapat menyebabkan hilangnya motalitas sel bakteri pada biakan (Volk, 1988).
Menurut Taringan (1988) beberapa bakteri dapat melakukan gerakan meluncur yang
sangat mulus yang hanya terjadi kalau persentuhan dengan benda padat. Kebanyakan
bakteri yang motil dapat mendekati atau menjauhi berbagai senyawa kimia yang
disebut kemotaksis. Menurut Volk (1988) kemampuan suatu organisme untuk
bergerak sendiri disebut motilitas. Hampir semua sel bakteri spiral dan sebagian dari
sel bakteri basil bersifat motil, sedangkan bakteri yang berbentuk kokus bersifat
immotil.

Uji fermentasi karbohidrat bertujuan untuk mengetahui kemampuan isolat bakteri

dalam menghidrolisis karbohidrat dengan menggunakan tiga jenis gula, yaitu
glukosa, laktosa dan sukrosa. (Lay, 1994). Uji hidrolisis pati untuk melihat
kemampuan bakteri dalam menghidrolisis pati dengan cara menghasilkan enzim
amilase. Pati merupakan polisakarida yang memiliki berat molekul yang tinggi,
karena ukurannya yang besar, polisakarida tidak mampu diserap oleh membran sel.

Uji hidrolisis karbohidrat dengan medium Mannosa, Raffinosa, dan Laktosa

yaitu untuk mengetahui bakteri mampu menggunakan substrat berupa oligosakarida
dan monosakarida pada medium untuk dipecah menjadi asam-asam anorganik yang
lebih sederhana. Bakteri uji ditumbuhkan pada medium Mannosa, Rafinosa, dan
Laktosa diberi BCP (Brom Cresol Purple) sebagai indikator. Bakteri uji kemudian
diinkubasi selama 2x24 jam pada suhu 370C. Uji positif jika mampu tumbuh pada
medium berubah menjadi warna kuning dan terbentuk gas pada tabung durham
(Tortora et al.,1998). Hasil praktikum bakteri uji gula menunjukkan hasil negatif
karena media tidak berubah warna.

Menurut Irianto (2007), pengujian Voges-Proskauer bertujuan untuk

mengetahui apakah dalam proses pertumbuhan organisme terbentuk asetil-metil
karbitol sebagai produk-antara (intermediate product) dari proses metabolisme
karbohidrat. Bakteri yang diuji ditumbuhkan pada medium cair MR-VP, diinkubasi
pada suhu 370C selama 2x24 jam. Pengamatan dilakukan setelah penambahan KOH
sebanyak 3 tetes dan alfanaftol sebanyak 2 tetes. Setelah penambahan KOH sebanyak
3 tetes akan terbentuk Asetoin (Asetil, metal karbinol) + KOH + CH3 . Alfanaftol
digunakan untuk memulai proses oksidasi yang kemudian tabung reaksi dibuka dan
dimiringkan untuk memperluas permukaan saat proses oksidasi. Media VP
mengandung 2,3 butanadiol yang apabila ditambahkan alfanaftol dan KOH akan
menghasilkan warna pink yang mengandung asetil metil karbinol. Hasil uji positif
apabila pada media tersebut terbentuk warna pink (Helmich et al., 2001).
Berdasarkan hasil praktikum, isolat bakteri yang diuji menunjukkan hasil negatif
karena warnanya tetap.
Katalase merupakan enzim yang mengandung besi yang dapat menguraikan
hidrogen peroksida (H202) menjadi air dan oksigen. Hidrogen peroksida dibentuk
bakteri aerobik selama metabolisme aerobik. Uji katalase bertujuan untuk
mengetahui perbedaan kuantitas oksigen yang dilepaskan, diduga berkaitan dengan
tebal tipisnya selaput lendir yang menyelimuti permukaan sel. Tebal tipisnya selaput
lendir akan mempengaruhi penetrasi H202 ke dalam sel. Isolat yang diperoleh
berdasarkan praktikum menunjukkan sifat katalase positif yaitu ditandai dengan
terbentuknya gelembung gas. Uji positif ditandai dengan terbentuknya gelembung
oksigen di sekitar koloni bakteri, yang menunjukkan bakteri mampu menghasilkan
enzim katalase yang dapat mengkatalisis reaksi penguraian H 2O2 menjadi H2O dan
O2. Sedangkan uji negatif memberikan hasil uji yang sebaliknya yakni tidak
terbentuk gelembung gas di sekitar koloni bakteri.

H2O2 katalase
→
H2O + ½ O2 (g)

Dalam Uji penggunaan Sitrat, Uji positif ditandai dengan perubahan warna indikator
BTB (Bromthymol blue) dalam media biakan dari hijau menjadi biru, yang
menunjukkan terbentuknya senyawa yang bersifat basa yaitu amonium (NH4+)
 O O
H2C CH 2
ONa O-
O O
HO C s itra t s in ta s e +
ONa HO C
O- + 3 Na
H 2C O O
ONa CH 2
O-
trinatrium sitrat sitrat ion natrium
+
NH 4H2PO 4 NH 4
+ H2PO 4-
amonium
amonium dihidrogen
dihidrogen posfat
fosfat

Uji negatif ditandai dengan warna indikator dalam medium biakan yang tetap
berwarna hijau yang menunjukkan tidak terbentuknya senyawa yang bersifat basa
dan masih terdapat senyawa yang bersifat asam dalam media biakan yaitu sitrat. Pada
uji oksidase Uji positif ditandai dengan terbentuknya warna hitam pada koloni
bakteri setelah penambahan reagen uji oksidase. Hal ini menunjukkan bakteri
memiliki enzim sitokrom oksidase yang dapat mengoksidasi reagen uji. Sedangkan
uji negatif memberikan hasil uji yang sebaliknya yakni tidak terbentuk warna hitam
pada koloni bakteri.
Anggota dari genus Bacillus umumnya ditemukan di
tanah dan sebagian besar dari bakteri ini memiliki kemampuan untuk
menghidrolisis protein, atau proteolitik. Enzim protease mikroorganisme ini memiliki
peran penting dalam siklus nitrogen, yang memberikan kontribusi
untuk kesuburan tanah (Aslim, 2002).

IV. KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan
 Berdasarkan percobaan yang dilakukan, maka dapat disimpulkan bahwa
bakteri yang diisolasi dari tanah tempat pembuangan akhir (TPA) adalah Bacillus
megaterium.

B. Saran

Saran untuk praktikum selanjutnya adalah agar praktikan diberitahu langkah

awal dari isolasi, dari pengambilan sampel. Pembuatan media uji, dsb.

DAFTAR PUSTAKA

Aksoy, H.M. 2002. Isolation Of Bacillus megaterium From Aphis pomi (Homoptera:
Aphidididae) And Assesment Of Its Pathogenity. Ondokuz Mayis University.
Turkey.
Aslim, Belma, Necdet Saúlam, Yavuz Beyatli. 2002. Determination Of Some
Properties Of Bacillus Isolated From Soil. Gazi University, Faculty Of Arts
And Science, Department Of Biology, Ankara - Turkey

Cowan, S.T. 1974. Manual for the Identification of Medical Bacteria. Great
Britain : Cambridge University Press.

Dinata, Madigan, M.T.,Martinko,J.M.,Parker, P. 2003. Biology of Microorganism.

10th Edition. Prentice Hall.USA.Dwidjoseputro, D., 1994. Dasar-Dasar
Mikrobiologi. Malang : Djambatan.

Dwidjoseputro, 1994. Dasar-dasar Mikrobiologi. Jakarta: PT. Gramedia Jakarta.

Dwipayana, 2008. Identifikasi Keberagaman Bakteri Pada Lumpur Hasil

Penggolongan Limbah Cat Dengan Teknik Konvensional. ITB, Bandung.

Hadioetomo, R.S., 1993, Teknik dan Prosedur Dasar Laboratorium

Mikrobiologi,Gramedia,

Helmich, 2001. Hvitved-Jacobsen.,2002. Sewer processes, CRC Press, USA.

Irianto, K. 2007.Mikrobiologi. Yrama Widya, BandungPelczar. M.J., and

Reid.R.D.,1958.Microbiology. Mc-Graw Hill-book Company,Japan.

Lay, B.W. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. PT Raja Grafindo Persada.

Jakarta: 168 hlm.

Lim, D., 1998, Microbiology, WCB.Mc graw Hill, New York.

Pelczar, M.J. Dan Chan, E.C.S., 1986, Dasar-Dasar Mikrobiologi, UI Press, Jakarta.

Soetarto, E.S., Suharni. T.T, Nastiti. S.Y dan Sembiring, L. 2008. Petunjuk
PraktikumMikrobiologi Untuk Mahasiswa Fakultas Biologi.
Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Biologi Universitas Gadjah Mada,
Yogyakarta

Taringan, Madigan, M.T.,Martinko,J.M.,Parker, P. 2003. Biology of Microorganism.

10th Edition. Prentice Hall.USA.Fessenden, R. J. dan Fessenden, J. S., 1998,
Kimia Organik Jilid 2 , Erlangga, Jakarta.

Tortora, 1998. A review on the progresses of controlling stored product insects with
Bacillus thuringiensis. Chinese Journal of Biological Control 11: 178182.
Volk dan Wheeler. 1998. Mikrobiologi Dasar, Jilid 1, Edisi kelima. Erlangga.
Jakarta.

Yulneriwarni. 2008. Mikroba, Dari Habitat Ke Industri. Fakultas Biologi Universitas

Nasional. VIS VITALIS, Vol. 01 No. 2