BAB 1

PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Mikroorganisme adalah jasad renik yang mempunyai kemampuan sangat baik untuk
bertahan hidup. Jasad renik tersebut dapat hidup hampir di semua tempat di permukaan bumi.
Mikroba mampu beradaptasi dengan lingkungan yang sangat dingin hingga lingkungan yang
relatif panas, dari lingkungan yang asam hingga lingkungan yang relatif panas, serta dari
lingkungan yang asam hingga basa. Mikroorganisme tidak dapat dilihat secara kasat mata.
Oleh karena itu, untuk melihat mikroorganisme diperlukan alat bantu berupa mikroskop.
Pertumbuhan mikroorganisme yang membentuk koloni dianggap bahwa setiap koloni yang
tumbuh berasal dari satu sel, maka dengan menghitung jumlah koloni bakteri, maka dapat
diketahui penyebaran koloni bakteri yang ada pada media biakan bakteri
Penentuan jumlah angka mikroorganisme sangat penting dilakukan untuk menetapkan
keamanan suatu sediaan farmasi dan makanan. Berbagai metode telah dikembangkan untuk
menghitung jumlah mikroorganisme. Metode yang digunakan adalah metode counting
chamber dan turbidimtri. Adapaun metode dengan menghitung jumlah sel, massa sel, atau
isi sel yang sesuai dengan jumlah sel. Terdapat macam-macam cara umum untuk
memperkirakan besar populasi mikroorganisme, yaitu perhitungan langsung, pengukuran
langsung, perhitungan tidak langsung, dan perkiraan tidak langsung.
Ada empat cara dalam penentuan jumlah sel. Perhitungan secara langsung dapat
mengetahui beberapa jumlah bakteri pada suatu bahan pada saat tertentu tanpa memberikan
perlakuan terlebih dahulu. Perhitungan secara tidak langsung dapat mengetahui jumlah
bakteri pada suatu bahan tanpa memberikan perlakuan tertentu. Perkiraan langdung
digunakan untuk menghitung biomassa mikroorganisme dengan cara massa sel dapat
ditentukan dengan menimbang atau mengukur berat seluruh sel. Perkiraan tidak langsung
digunakan untuk biomassa mikroorganisme. Biomassa mikroorganisme
diperkirakan dengan cara mengukur komponen biokimia sel mikroorganisme yang relatif
konstan, seperti protein, adenosin trifosfat (ATP), lipopolisakarida (LPS), murein, dan
klorofil.

1
1.2 Rumusan Masalah
Rumusan masalah pada percobaan penentuan jumlah sel mikroorganisme adalah
sebagai berikut:
1. Bagaimana cara mempelajari menghitung jumlah sel mikroorganisme menggunakan
metode turbidimetri?
2. Bagaimana cara mempelajari menghitung jumlah sel mikroorganisme menggunakan
metode counting chamber ?

1.3 Tujuan Percobaan

Tujuan dalam percobaan penentuan jumlah sel mikroorganisme adalah sebagai
berikut:
1. Untuk mempelajari menghitung jumlah sel mikroorganisme menggunakan metode
turbidimetri.
2. Untuk mempelajari mengitung jumlah sel mikroorganisme menggunakan metode
counting chamber.

2
 BAB 11

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Mikroorganisme

Mikroorganisme meliputi semua organisme yang tidak dapat dilihat dengan mata
telajang. Yang termasuk kedalam kelompok mikroorganisme,antara lain yaitu
bakteri,jamur,ragi,virus. Mikroorganisme merupakan semua makhluk yang berukuran
beberapa mikron atau lebih kecil lagi. Walaupun mikroorganisme tidak terlihat, kehadiran
mikroorganisme dapat dirasakan. Yang termasuk golongan ini adalah bakteri, endawan atau
jamur tingkat rendah, ragi yang menurut sistematik masuk golongan jamur, ganggang, hewan
bersel satu atau protozoa dan virus hanya nampak dengan mikroskop elektron.
Mikroorganisme umumnya terdapat di mana-mana, seperti di dalam tanah, di lingkungan
akuatik, berkisar dari aliran air sampai lautan, dan atmosfer (James, 2002).

Mikroorganisme seringkali dianggap “jahat” tetapi beberapa mikroorganisme justru

penting bagi kesehatan manusia. Sebagai contoh, didalam usus terdapat bakteri komensial
(bakteri yang hidup didalam atau diatas tubuh tanpa menyerap dan menyebabkan efek bagi
manusia), dan yang menjaga lingkungan berada didalam keadaan bebas oksigen (anaerob)
sehingga memungkinkan proses pencernaan dan juga sintesis vitamin K. Populasi campuran
yang baik bakteri-bakteri (flora) usus memungkinkan untuk melawan mikroorganisme jahat
yang memasuki tubuh yang berkompetensi berebut zat gizi. Mikroorganisme memiliki
beberapa peran salah satunya yaitu mikroorganisme yang hidup dalam tanah dapat membantu
pembentukan struktur tanah yang baik, karena mikroorganisme tanah dapat mengelarkan zat
perekat (sekresi) yang tidak mudah larut dalam air (Novizan,2002).

Mikroorganisme memiliki beberapa tipe antara lain adalah mikroorganisme

heterotrof dan autotrof. Mikroorganisme heterotrof membutuhkan sumber karbon organic
untuk pertumbuhannya. Sedangkan mikroorgaisme autotrof menggunakan karbon anorganik
seperti karbon monoksida untuk pertumbuhannya. Adapun tipe microorganisme berdasarkan

3
sumber energinya yaitu fototrof dan kemotrof. Fototrof memanfaatkan cahaya matahari.
Kemotrof menggunakan senyawa organic ataupun anorganik untuk melakukan aktivitasnya

(Lestari,2017).

2.2 Cara Menghitung Jumlah Mikroorganisme

Penentuan jumlah angka mikroorganisme dilakukan untuk menetapkan keamanan
suatu kesediaan farmasi dan makanan. Berbagai metode telah dikembangkan untuk
menghitung jumlah mikroorganisme. Metode ini mnghitung jumlah sel,massa sel,atau isi sel
yang sesuai dengan jumlah sel. Berikut macam-macam cara yang digunakan untuk
memperkirakan besar populasi mikroorganisme yaitu.

1. Perhitungan langsung (direct count)

Perhitungan secara langsung dapat mengetahui beberapa jumlah bakteri pada suatu bahan
pada saat tertentu tanpa memberikan perlakuan terlebih dahulu. Perhitungan secara langsung
dapat dilakukan dengan membuat preparat dari suatu bahan dan penggunaan ruang hitung.
Penentuan sel secara langsung dapa dihitung langsung di bawah mikroskop

2. Perhitungan tidak langsung (indirect count)

Perhitungan secara tidak langsung dapat mengetahui jumlah bakteri pada suatu bahan
tanpa memberikan perlakuan tertentu .Mikroba didalam sel dikonsentrasikan dan ditanam
pada media yang sesuai. Pertumbuhan mikroba, contohnya pembentukan koloni dalam pelat
agar, digunakan untuk memperkirakan jumlah mikroba yang terdapat di dalam sampel.
Perhitungan secara tidak langsung hanya dapat mengetahui jumlah mikroba yang hidup saja

3. Pengukuran langsung (direct measurement)

Pengukuran ini digunakan untuk menghitung biomassa mikroorganisme dengan cara

massa sel dapat ditentukan dengan menimbang atau mengukur berat seluruh sel serta
biomassa dapat dikorelasikan dengan jumlah sel dan membandingkannya pada kurva standar.

4
4. Perkiraan tidak langsung (indirect estimate)
Digunakan untuk biomassa mikroorganisme. Biomassa mikroorganisme
diperkirakan dengan cara mengukur komponen biokimia sel mikroorganisme yang relatif
konstan, seperti protein, adenosin trifosfat (ATP), lipopolisakarida (LPS), murein, dan
klorofil. Biomassa juga dapat diperkirakan secara tidak langsung dengan mengukur
kekeruhan. Perkiraan tidak langsung biomassa mikroorganisme dapat dikorelasikan dengan
jumlah sel dengan membandingkannya pada kurva standar (Harmita 2006).

2.3 Metode Turbidimetri

Penentuan jumlah total sel dapat dilakukan dengan metode turbidimetri yang menentukan
volume sel mampat,berat sel,besarnya sel atau koloni, dan satu atau lebih produk metatolit.
Turbidimetri merupakan metode untuk menduga pertumbuhan atau populasi bakteri melalui
pengukuran derajat keseluruhan suspense bakteri yang bersangkutan. Disisi lain,turbidimetri
merupakan analisis kuantitatif yang didasarkan pada pengukuran turbidan dari suatu larutan
akibat adanya partikel padat dalam larutan setelah sinar melewati suatu larutan yang
mengandung partikel tersupsensi. Hamburan cahaya terjadi akibat adanya partikel yang
terdapat dalam larutan. Partikel ini menghambur cahaya kesegala arah yang mengenainya.
Dalam turbidimetri digunakan larutan yang berupa koloid. Larutan jernih dapat diukur
dengan metode ini dengan jalan memberikan emulgator untuk mengemulsi larutan. Larutan
tersuspensi atau koloid mengandung partikel yang berukuran 10−10 cm. ukuran partikel ini
biasanya dapat dilihat dengan mata. Hamburan yang terukur pada alat turbidimetri yang
teratur adalah hamburan yang diteruskan atau yang membentuk sudut 180℃. Sedangkan
hamburan yang membentuk sudut 90℃ hamburannya terdeteksi oleh alat hefelometer. Sinar
yang dihamburkan oleh partikel terlarut dalam suatu larutan ada berbagai macam,yaitu :

1. Hamburan Reylegh

Hamburan sinar oleh molekul-molekul yang diameternya jauh lebih kecil dari sinar yang
dihamburkan. Pada hamburan reylegh intensitas sinar yang terpancar sebanding dengan satu
perpanjang gelombang berpangkat empat.

5
2. Hamburan Tyndall

Hamburan sinar yang diameter molekul-molekulnya lebih besar dari sinar yang
dihamburkan. Pada hamburan reylegh dan hamburan tyndall tidak terjadi perubahan frekuensi
sinar dating dengan sinar yang dihamburkan

3. Hamburan Raman

Perubahan  dari sebagaian sinar yang dihamburkan bergantung pada molekul yang
menghamburkan dan dapat mengubah frekuensi antara sinar yang dating dan sinar yang
dihamburkan

Berikut adalah rumus untuk perhitungan metode turbidimetri.

A=2-log%T
…………………………………………(1)

Dimana, A adalah nilai serapan dan T adalah transmitan. Cara ini merupakan perhitungan
kerapatan suatu materi (sel) didalam larutan yang diberi cahaya. Kualitas bias cahaya yang
dihasilkan identik dengan kerapatan materi sel yang berada didalam larutan (Harmita,2006).

2.4 Turbiditas

Turbiditas merupakan tingkat kekeruhan suatu larutan. Kekeruhan menggambarkan

sifat optik sel didalam air yang ditentukan berdasarkan banyaknya cahaya yang diserap dan
dipancarkan oleh bahan-bahan yang terdapat didalam air. Kekeruhan disebabkan adanya
bahan organik dan anorganik yang tersuspensi dan terlarut.Partikel tersuspensi menyebabkan
turbiditas dalam bahan organik dan anorganik dan plankton. Kekeruhan dinyatakan dalam
satuan unit turbiditas yang setara dengan 1 mg/liter SiO2. Peralatan yang digunakan untuk
mengukur turbiditas adalah Jackson Canate turbidimeter yang dikalibrasi dengan
menggunakan silika,yang kemudian dijadikan sebagai alat baku atau standar bagi

6
pengukuran kekeruhan. Turbiditas mengungkapkan berapa banyak cahaya yang tersebar oleh
sampel. Satuan kekeruhan yang diperoleh berupa NTU (Nephelometric Turbidy Unit).
Berdasarkan ketentuan dari bada kesehatan dunia World Health Organization (WHO), batas
maksimum kekeruhan air minum memenuhi syarat adalah 5 NTU (Cowen,2000).

2.5 Metode Counting Chamber

Cara perhitungan mikroorganisme secara langsung menggunakan ruang penghitung

relative mudah, tetapi tidak dapat membedakan antara sel yang hidup dengan sel yang telah
mati. Sampel yang disebabkan atau diteteskan pada alat berupa lempengan kaca kecil berisi
kassa-kassa. Alat yang dipakai adalah kamar hitung model Petroff-Hauser dan Levy. Cara
langsung digunakan dibidang mikrobiologi pangan untuk mengetahui adanya pencemaran
mikroorganisme dan menghitung jumlah sel darah dalam hematologi. Berikut adalah
perhitungan menggunakan metode counting chamber.

𝒋𝒖𝒎𝒍𝒂𝒉 𝒔𝒆𝒍 𝒔𝒆𝒍 𝟏𝟎𝟎𝟎 𝒎𝒎𝟑

= 𝒎𝒎𝟑 x
𝒎𝒍 𝒔𝒂𝒎𝒑𝒆𝒍 𝒄𝒎𝟑
………………………….(2)

Atau menggunakan rumus berikut ini :

𝐽𝑢𝑚𝑙𝑎ℎ 𝑠𝑒𝑙 𝑎𝑥𝑛
= …………………………………..(3)
𝑚𝑙 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 𝑏𝑥4

Dimana a merupakan larutan sampel uji, n merupakan jumlah total sel didalam suatu sampel
a dengan volume sebesar b (Delfini,2010).

2.6 Spektrofotometer UV-Vis

Spektrum absorpsi suatu senyawa yang ditetapkan dengan spektrofotometer dapat

dianggap sebagai indikasi yang lebih elegan,objektif,dan juga handal. Spektrum absorpsi
bergantung tidak hanya pada sifat dasar kimia dari suatu senyawa tersebut. Perubahan pelarut
sering menghasilkan suatu generasi pada bagian pita absorpsinya. Bentuk suatu pita dan
terutama munculnya struktur halus dapat bergantung pada karateristik alat, seperti resolusi
dari bagian monokromator. Prinsip dari spektrofotometer UV-Vis yaitu pengukuran serapan

7
cahaya di daerah UVadalah 200-350 nm dan juga sinar tampak 350-800 nm oleh adanya
suatu senyawa tertentu.

Gambar 2.1 Spektorofotometer UV-Vis (Gandjar,2018)

Serapan cahaya UV atau cahaya tampak mengakibatkan terjadinya peristiwa transisi

elektronik yaitu merupakan terjadinya promosi-promosi elektron dan orbital keadaan dasar
yang berenergi lebih tinggi, dengan adanya proses interaksi antara energi yang berupa sinar
monokromatis dan juga sumber sinar dengan adanya suatu materi yang berupa molekul.
Serapan tidak akan terjadi seketika pada daerah UV dan sinar tampak untuk semua struktur
elektron,tetapi hanya pada suatu system terkonjugasi. Struktur elektron dengan adanya
ikatan phi dan juga adanya ikatan non bonding elektron. Prinsip kerja dari alat
spektrofotometer menggunakan hukum Lambert Beer dengan ketentuan bila cahaya
monokromatik melalui suatu media (larutan) maka sebagian cahaya akan diserap dan
sebagaian dipantulkan,sebagian lagi dipancarkan (Day,1998)

2.7 Mikroskop

Mikroskop adalah instrumentasi yang paling banyak digunakan dan dan paling
bermanfaat di laboratorium yang memiliki perbesaran dalam kisaran luas sekitar seratus kali
sampai ratusan ribu kali. Prinsip kerja pada mikroskop yaitu objek ditempatkan diruang dua
lensa objektif sehingga terbentuk bayangan nyata,terbalik,dan diperbesar. Berikut adalah
penjelasan dari mikroskop pada bagian optik dan fungsinya.

8
1. Lensa okuler,

Lensa okuler terdapat pada bagian ujung atas tabung dimana lensa okuler memiliki
kegunaan untuk memperbesar kembali bayangan dari lensa objektif, sehingga pengamat
mampu melihat yang akan diamati. Untuk perbesarannya pada umumnya sekitar 6, 10, atau
12 kali.

2. Lensa objektif,
Lensa objektif mempunyai fungsi untuk memperbesar bayangan benda. Untuk
perbesarannya biasanya 10, 40, atau 100 kali dan biasanya ada 3 lensa. Sebelum
mengggunakan lensa objektif, perlu diketahui untuk mengoleskan minyak emersi ke benda
terlebih dahulu agar nantinya bayangan yang terlihat nanti lebih jelas.

3. Diafragma

Diafragma merupakan bagian yang dipergunakan untuk mensetting intensitas cahaya

yang masuk. Fungsinya mirip dengan pupil yang ada pada mata manusia.

4. Kondensor

Digunakan untuk mengumpulkan cahaya yang dipantulkan dari cermin dan

memusatkannya dibenda.

5. Cermin, fungsinya untuk memantulkan cahaya luar menuju ke bagian kondensor dan
diafragma.

(Tribe,et al,1975).

2.8 Mikroorganisme Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae merupakan kelompok mikroba yang tergolong kedalam

khamir. Bentuk umumnya secara morfologis memiliki bentuk ellipsodral dengan diameter
yang tidak besar, hanya sekitar 1-3 µm sampai 1-7µ𝑚3. Khamir ini mudah

9
dikuturkan,pertumbuhannya cepat,peta genomnya sudah dapat dipetakkan dengan jelas serta
mudah menerima transferegen. Hal ini dapat tercapai dengan menumbuhkannya pada media
tertentu baik media padat maupun media cair. Secara makroskopis, bakteri ini berbentuk
koloni bulat berwarna kuning muda-keputihan dan memiliki permukaan yang berkilau,
tekstur lunak,dan memiliki sel bulat (Dr Clanson,1998).

Mikroba ini bersifat anaerobic fakultatif, mengandung 68-83 % air, nitrogen, karbohidrat,
lipid, vitamin,dan mineral. Saccharomyces cerevisiae adalah jenis mikroorganisme yang
paling sering digunakan dalam produksi bioetanol. Cara hidup Saccharomyces cerevisiae
cosmopolitan pada permukaan buah,nektar bunga dan cairan yang mengandung gula, serta
mampu hidup secara saprofit dan bersimbiosis. Saccharomyces cerevisiae diketahui sebagai
khamir penghasil enzim ekstraseluler. Saccharomyces cerevisiae merupakan khamir yang
sangat penting dalam boindustri. Toleransinya terhadap etanol merupakan karakter yang
menentukan sehingga mikroorganisme ini dapat digunakan sebagai sumber biofermentasi

(Hidayat,dkk,2018).

10
 BAB III
METODOLOGI PERCOBAAN
3.1 Alat dan Bahan
3.1.1 Alat
Alat-alat yang digunakan percobaan penentuan jumlah sel mikroorganisme adalah
sebagai berikut:

1. Tabung reaksi 5 buah

2. Spektrofotometer 1 buah
3. Kuvet 2 buah
4. Mikroskop 1 buah
5. Neraca analitik 1 buah
6. Beaker glass 150 ml 1 buah
7. Beaker glass 250 ml 1 buah
8. Hemasitometer 1 buah
9. Gelas ukur 10 ml 1 buah
10. Kaca arloji 1 buah
11. Spatula 1 buah
12. Deck glass 1 buah
13. Pipet ukur 10 ml 1 buah
14. Pipet ukur 1 ml 1 buah
15. Propipet 1 buah

3.1.2 Bahan

Bahan-bahan yang digunakan percobaan penentuan jumlah sel mikroorganisme

adalah sebagai berikut:

1. Ragi (Fermipan)
0,5 gram
2. Aquadest

11
3.2 Cara Kerja
3.2.1 Metode Turbidimetri
1. Menkalibrasi alat spektrofotometer.
2. Menimbang 0,5 gram ragi kemudian mengencerkan degan aquadest 10 ml.
3. Mengencerkan lagi sampel tersebut menjadi 1000x.
4. Menyiapkan 5 tabung reaksi 1:1, 1:2, 1:8, 1:16.
5. Mengisikan 8 ml aquadest ke dalam semua tabung reaksi, kecuali tabung reaksi 1:1.
6. Menambahkan 8 ml larutan pengenceran 1000x yang sudah berisi ragi ke dalam
tabung 1:4, 1:8. Dan 1:16.
7. Melakukan pengukuran pada alat spektrofotometer yang telah dikalibrasi.

3.2.2 Metode Counting Chamber

1. Mengambil ragi sebanyak n gram, lalu melarutkan ke dalam 10 ml.
2. Menimbang 0,5 gram ragi kemudian mengencerkan dengan aquadest 10 ml.
3. Mengencerkan lagi sampel tersebut menjadi 1000x.
4. Menyiapkan 3 tabung reaksi lalu mengisi 9 ml aquadet untuk proses pengenceran.
5. Melakukan pengencera 10.000x, 100.000x, dan 1.000.000x.
6. Pengenceran pada tabung reaksi masing-masing diberi nama 10.000x, 100.000x, dan
1.000.000x.
7. Mengaduk suspensi supaya homogen dengan cara memutar-mutarkan tabung reaksi
diantara telapak tangan.
8. Meneteskan suspensi pada pengenceran 10.000x pada Hemasitometer, kemudian
menutup dengan deck glass, lalu menghitung jumlah selnya dengan mikroskop
dengan perbesaran 40x.

Sebelum menghitung, tentukan letak kotak A, B, C, D, dan E pada Hemasitometer tersebut.

12