3375 PDF
3375 PDF
REVIEW ARTIKEL Majalah Ilmu Kefarmasian, Vol. I, No.3, Desember 2004, 117 - 135
ABSTRACT
Each analysis method by some reason, must be validated. The parameters are
selectivity, accuracy, precision, linearity, LOD, LOQ, ruggedness, and robustness.
The parameters need to be calculated by assay methods.
This paper try to give some information above these methods base on some
literatures (USP 23rd, WHO, journal, etc).
Key words : Validation method, Parameter, Assay and calculation methods.
pembanding kimia CRM atau SRM) analit yang ditambahkan tadi dapat
ditambahkan ke dalam campuran ditemukan.
bahan pembawa sediaan farmasi Kriteria kecermatan sangat
(plasebo) lalu campuran tersebut tergantung kepada konsentrasi analit
dianalisis dan hasilnya dibandingkan dalam matriks sampel dan pada
dengan kadar analit yang ditam- keseksamaan metode (RSD). Vander-
bahkan (kadar yang sebenarnya). wielen, dkk menyatakan bahwa se-
Dalam metode penambahan baku, lisih kadar pada berbagai penentuan
sampel dianalisis lalu sejumlah ter- (X d) harus 5% atau kurang pada
tentu analit yang diperiksa ditam- setiap konsentrasi analit pada mana
bahkan ke dalam sampel dicampur prosedur dilakukan. Harga rata-rata
dan dianalisis lagi. Selisih kedua hasil selisih secara statistik harus 1,5% atau
dibandingkan dengan kadar yang kurang. Kriteria tersebut dinyatakan
sebenarnya (hasil yang diharapkan). secara matematik sebagai berikut:
Dalam kedua metode tersebut, per-
sen peroleh kembali dinyatakan seba- Xd
gai rasio antara hasil yang diperoleh . 100 < 5%
dengan hasil yang sebenarnya. % X0
Perolehan kembali dapat ditentukan
dengan cara membuat sampel pla- Xd (S(0,95 n – I ))
sebo (eksepien obat, cairan biologis) . 100 -- < 1,5%
kemudian ditambah analit dengan X0 n
konsentrasi tertentu (biasanya 80%
sampai 120% dari kadar analit yang
diperkirakan), kemudian dianalisis Xd = Xi – X0
dengan metode yang akan divalidasi.
Tetapi bila tidak memungkinkan Xi = hasil analisis
membuat sampel plasebo karena X0 = hasil yang sebenarnya
matriksnya tidak diketahui seperti I = nilai t pada tabel t’ student pada
obat-obatan paten, atau karena ana- atas 95%
litnya berupa suatu senyawa endo- S = simpangan baku relatif dari
gen misalnya metabolit sekunder semua pengujian
pada kultur kalus, maka dapat di- n = jumlah sampel yang dianalisis
pakai metode adisi.
Metode adisi dapat dilakukan Kadar analit dalam metode
dengan menambahkan sejumlah penambahan baku dapat dihitung
analit dengan konsentrasi tertentu sebagai berikut:
pada sampel yang diperiksa, lalu
dianalisis dengan metode tersebut. C R1
Persen perolehan kembali ditentukan =
dengan menentukan berapa persen C+S R2
3,853 x 100%
Larutan baku dalam : % Perolehan Kembali =
3,929
81,212 mg ! labu tentukur 100 ml
= 98,06%
dilarutkan dalam metanol.
2. Keseksamaan (precision)
(lihat tabel 1 di bawah ini)
Definisi:
Keseksamaan adalah ukuran
Keterangan :
yang menunjukkan derajat kese-
Persamaan regresi : y = 0,0173 x +
suaian antara hasil uji individual,
0,01700; r = 0,9999
diukur melalui penyebaran hasil in-
dividual dari rata-rata jika prosedur
Contoh perhitungan :
diterapkan secara berulang pada
Rata rata luas puncak meloksikam :
sampel-sampel yang diambil dari
2081430,5
campuran yang homogen.
2. Simpangan baku relatif atau ml. Tambahkan air sampai 50,0 ml,
koefisien variasi (KV) adalah: kocok (lakukan triplo).
SD
KV = x 100% - Pipet 2,0 ml larutan diatas. Ma-
x
sukan ke dalam labu ukur 10,0 ml.
Percobaan keseksamaan dilaku-
Tambahkan air sampai 10,0 ml.
kan terhadap paling sedikit enam
Kocok (dibuat 10 labu).
replika sampel yang diambil dari
campuran sampel dengan matriks
Standar 1000 ppm
yang homogen. Sebaiknya kesek-
samaan ditentukan terhadap sampel
- Timbang 50,0 mg tetrasiklin HCl.
sebenarnya yaitu berupa campuran
Masukan ke dalam labu ukur 25,0
dengan bahan pembawa sediaan
ml. Tambahkan air sampai 10,0 ml,
farmasi (plasebo) untuk melihat
kocok (lakukan triplo)
pengaruh matriks pembawa terhadap
keseksamaan ini. Demikian juga
- Pipet 5,0 ml larutan diatas. Ma-
harus disiapkan sampel untuk meng-
sukan ke dalam labu ukur 10,0 ml.
analisis pengaruh pengotor dan hasil
Tambahkan air sampai 10,0 ml.
degradasi terhadap keseksamaan ini.
Kocok (dibuat 10 labu)
Contoh uji homogenitas
Cara kerja : Suntikan 20 µl standar 100 ppm dan
Standar 100 ppm standar 1000 ppm pada HPLC
- Timbang 25,0 mg tetrasiklin HCl. dengan kecepatan alir 1,0 ml/menit
Masukan kedalam labu ukur 50,0 dan panjang gelombang 360 nm.
Konsentrasi Konsentrasi
Tetrasiklin HCl Area Tetrasiklin Area
(ppm) (ppm)
100 1782560 1000 17824940
100 1784392 1000 17830710
100 1784506 1000 17831960
100 1784857 1000 17851970
100 1785275 1000 17853480
100 1807112 1000 17895130
100 1808175 1000 17899070
100 1809577 1000 17921150
100 1823930 1000 17933210
100 1853383 1000 17959770
Nilai F 4,31
dibuat larutan baku, larutan uji dan matik yang baik, proporsional ter-
larutan blanko. hadap konsentrasi analit dalam
a. Pembuatan larutan baku tetra- sampel. Rentang metode adalah
siklin HCl pernyataan batas terendah dan
- Timbang 25,0 mg baku Tetrasiklin tertinggi analit yang sudah ditun-
HCl, masukan kedalam labu ukur jukkan dapat ditetapkan dengan
50,0 ml. kecermatan, keseksamaan, dan
- Larutkan dengan air sampai 50,0 linearitas yang dapat diterima.
ml, kocok.
- Suntikkan 20 µl larutan uji pada Cara penentuan:
HPLC. Amati puncaknya pada Linearitas biasanya dinyatakan
kromatogram HPLC. dalam istilah variansi sekitar arah
garis regresi yang dihitung berda-
b. Pembuatan larutan uji tetrasiklin sarkan persamaan matematik data
HCl yang diperoleh dari hasil uji analit
- Timbang 100,0 mg serbuk obat dalam sampel dengan berbagai kon-
tetrasiklin HCl, masukan kedalam sentrasi analit. Perlakuan matematik
labu ukur 100,0 ml. dalam pengujian linearitas adalah
- Larutkan dengan air sampai 100,0 melalui persamaan garis lurus
ml, kocok. dengan metode kuadrat terkecil an-
- Saring dengan kertas saring tara hasil analisis terhadap konsen-
Durapore membrane filter 0,45 trasi analit. Dalam beberapa kasus,
µm HV untuk memperoleh hubungan pro-
- Suntikan 20 µl larutan uji pada porsional antara hasil pengukuran
HPLC. Amati puncaknya pada dengan konsentrasi analit, data yang
kromatogram HPLC. diperoleh diolah melalui transfor-
masi matematik dulu sebelum dibuat
Hasil kromatogram Tetrasiklin HCl analisis regresinya.
standar dan sampel harus menun- Dalam praktek, digunakan satu
jukkan waktu retensi yang sama dan seri larutan yang berbeda konsen-
pada daerah sekitar waktu retensi trasinya antara 50 – 150% kadar analit
tetrasiklin tersebut tidak boleh ada dalam sampel. Di dalam pustaka,
gangguan yang dapat dilihat dari sering ditemukan rentang konsen-
kromatogram larutam blanko. trasi yang digunakan antara 0 –
200%. Jumlah sampel yang dianalisis
4. Linearitas dan Rentang sekurang-kurangnya delapan buah
Definisi: sampel blanko.
Linearitas adalah kemampuan Sebagai parameter adanya hu-
metode analisis yang memberikan bungan linier digunakan koefisien
respon yang secara langsung atau korelasi r pada analisis regresi linier
dengan bantuan transformasi mate- Y = a + bX. Hubungan linier yang
Slop b 17937,62
Aksis Intersep a 45047,55
Koefisien Korelasi (r) 0.999
Proses Relatif Standar Deviasi (VxO) 1,504 %
ANOVA Lineariti testing 12063,95172
5. Batas Deteksi dan Batas Kuan- kan instrumen atau tidak. Pada
titasi analisis yang tidak menggunakan
Definisi: instrumen batas tersebut ditentukan
Batas deteksi adalah jumlah ter- dengan mendeteksi analit dalam
kecil analit dalam sampel yang dapat sampel pada pengenceran bertingkat.
dideteksi yang masih memberikan Pada analisis instrumen batas deteksi
respon signifikan dibandingkan dapat dihitung dengan mengukur
dengan blangko. Batas deteksi me- respon blangko beberapa kali lalu
rupakan parameter uji batas. Batas dihitung simpangan baku respon
kuantitasi merupakan parameter blangko dan formula di bawah ini
pada analisis renik dan diartikan dapat digunakan untuk perhitungan
sebagai kuantitas terkecil analit da-
lam sampel yang masih dapat meme- k x Sb
Q=
nuhi kriteria cermat dan seksama. Sl
15,818 423452,5
31,636 832117
47,454 1252741
79,090 2101372,5
118,634 3149102
No Kons.analit
Area (Yi) Yi (Yi – Yi)2
(µg/ml)
Σ = 101671411,6
metodologi yang kecil dan terus bergantung pada tipe prosedur ana-
menerus dan mengevaluasi respon litik. Metode yang digunakan untuk
analitik dan efek presisi dan akurasi. pemeriksaan produk farmasetika
Sebagai contoh, perubahan yang di- dapat diklasifikasikan seperti di
butuhkan untuk menunjukkan keku- bawah ini :
atan prosedur HPLC dapat mencakup ! Kategori I : metode analitikal un-
(tapi tidak dibatasi) perubahan tuk kuantitasi komponen maupun
komposisi organik fase gerak (1%), substansi bahan baku obat atau
pH fase gerak (± 0,2 unit), dan peru- bahan aktif (termasuk pengawet)
bahan temperatur kolom (± 2 - 3° C). pada hasil akhir farmasetika ter-
Perubahan lainnya dapat dilakukan masuk dalam kategori I.
bila sesuai dengan laboratorium.
Identifikasi sekurang-kurangnya ! Kategori II : Metode analitik untuk
3 faktor analisis yang dapat mem- menentukan campuran dalam
pengaruhi hasil bila diganti atau substansi bahan baku atau kompo-
diubah. Faktor orisinal ini dapat nen sisa pada produk akhir farma-
diidentifikasi sebagai A, B, dan C. setika dimasukkan dalam kategori
Perubahan nilai faktor-faktor ini II. Metode ini termasuk perhi-
dapat diidentifikasi dengan a, b, dan tungan kembali secara kuantitatif
c. Lakukan analisis pada kondisi dan batas tes.
yang telah disebutkan pada peme- ! Kategori III : Metode analitik ini
riksaan ketangguhan. untuk menentukan performa ka-
rakteristik (contoh: disolusi, pe-
Nilai
Penetapan lepasan obat) termasuk dalam
eksperimental kategori III.
faktor
#1 #2 #3 #4
A atau a A A a a Untuk masing-masing kategori
B atau b B b B b diperlukan informasi analitik yang
berbeda. Tabel 13 berikut mem-
C atau c C c c C
berikan langkah-langkah mengenai
Untuk menentukan efek peru- parameter analitik yang biasanya
bahan A, banding rata-rata hasil (#1 diperlukan untuk masing-masing
+ #2)/2 dengan (#3 + #4)/2, Untuk kategori.
efek perubahan B, bandingkan (#1 +
#3)/2 dengan (#2 +#4)/2 dan sete- Tes SST (system suitability tests)
rusnya. Dari validasi metode yang
dilakukan dapat diketahui apakah
SELEKSI PARAMETER suatu metode analisis (dalam hal ini
ANALITIK kromatografi) dapat dipakai pada
Parameter analitik yang diper- suatu kondisi tertentu. Untuk
lukan untuk validasi dapat bervariasi mengetahui apakah metode tadi
Tabel 13. Parameter analitik yang harus dipertimbangkan untuk tipe prosedur analitik
yang berbeda