ANALISIS DESAIN PRIMER GEN SIKLOOKSIGENASE-2

(COX-2) PADA Oncorhynchus mykiss

LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI SEL MOLEKULER

Oleh:
ZAHRA PUTRI AULIA B2A019004

PROGRAM STUDI BIOLOGI PROGRAM MAGISTER

FAKULTAS BIOLOGI
UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN
PURWOKERTO
2019
 I. PENDAHULUAN

Perlukaan merupakan hal yang umum dirasakan oleh mahluk hidup. Proses
terjadinya luka akan diikuti dengan proses penyembuhan yang kompleks dan terdiri
dari beberapa tahap bekersinambungan. Proses penyembuhan diawali dengan fase
inflamasi, proliferasi, dan remodelling (Kusumastuti, et al., 2014). Inflamasi
merupakan bentuk respon yang dihasilkan setelah terjadi kerusakan pada jaringan
yang disebabkan oleh trauma fisik, zat kimia atau mikrobiologik yang merusak.
Tanda terjadinya inflamasi adalah pembengkakakn, kemerahan, panas, nyeri, dan
perubahan fungsi (Ramadhani & Sumiwi, 2016).
Salah satu langkah yang dapat dilakukan untuk meredakan inflamasi adalah
dengan cara memberikan obat antiinflamasi kepada penderita luka, seperti obat
antiinflasi non steroid (AINS). Ibuprofen merupakan salah satu AINS yang bekerja
sebagai antiinflamasi dengan cara menghambat kerja enzim siklooksigenase
(Kusumastuti, et al., 2014). Siklooksigenase atau seringkali dikenal dengan istilah
COX merupakan enzim yang berperan dalam mengubah asam arakidonat menjadi
prostaglandin pada proses inflamasi (Triwani & Saleh, 2015).
COX termasuk ke dalam famili mieloperoksidase yang terletak pada sisi
luminal dari RE dan membran nukleus (Sobolewski, et al., 2009). Keberadaan
enzim ini diekspresikan oleh gen penyandi siklooksigenasi (COX). Menurut Fajrin
(2013), hingga saat ini telah teridentifikasi sebanyak 3 jenis isoform gen COX yaitu
COX-1, COX-2, dan COX-3. COX-2 merupakan gen yang bersifat indusibel dan
proses regulasinya dipengauhi oleh faktor perumbuhan dan sitokin yang berbeda
seperti IL1β, IL6 atau TNFα dan akan mengalami peningkatan ekspresi selama
inflamasi. Gen COX-2 terletak pada kromosom 1 dan gen COX2 memperlihatkan
60% kemiripan dengan COX-1.
Gen COX-2 pada suatu organisme dapat dilihat kehadirannya dengan
menggunakan teknik PCR (Polymerase Chain Reaction). PCR merupakan suatu
metode enzimatis yang melakukan amplifikasi DNA secara in vitro. Keberadaan
PCR ini sangat memungkinkan peneliti untuk melipatgandakan suatu fragmen
DNA dalam waktu yang cukup singkat (Yusuf, 2010). Beberapa komponen yang
harus tersedia selama proses PCR berlangsung adalah potongan DNA yang akan
digunakan, primer, enzim DNA polimerase, dan deoksiribonukleotida trifosdat
(dNTP) yang terdiri atas dATP, dCTP, dGTP, dan dTTP.
Proses yang terjadi dalam teknik PCR terdiri atas banyak siklus yang terjadi
secara berulang-ulang. Terdapat 3 tahapan penting dalam proses PCR yang terulang
sebanyak 30-40 siklus dan berlangsung dalam waktu yang sangat cepat. Tahap
denaturasi merupakan tahap pertama yang terjadi dalam proses PCR. Denaturasi
adalah proses pembukaan untai ganda DNA menjadi untai tunggal DNA dan
biasanya berlangsung sekitar 3 menit. Menurut Yusuf (2010) proses denaturasi
yang tidak lengkap akan menyebabkan DNA mengalami renaturasi atau
pembentukan kembali DNA menjadi undai ganda dan akan mengakibatkan
gagalnya proses PCR. Tahapan ini biasanya terjadi pada suhu 90-95℃ selama 1-3
menit (Joko, et al., 2011).
Tahap selanjutnya adalah annealing atau penempelan primer. Melalui
tahapan ini primer bersama dengan cetakan akan membentuk ikatan hidrogen pada
sekuen yang komplementer (Joko, et al., 2011). Waktu yang biasa dibutuhkan
annealing dalam PCR adalah sekitar 30-40 detik dan untuk temperaturnya adalah
40-60℃. Suhu yang akan digunakan berkaitan dengan panjang ukuran primernya,
semakin panjang primer yang digunakan maka akan semakin tinggi pula dengan
suhu yang digunakan, begitu juga sebaliknya (Yusuf, 2010). Tahap terakhir adalah
extention atau pemanjangan untai DNA dari ujung 3’. Suhu yang dibutuhkan pada
tahap ini adalah 70-75℃ selama 1 menit. Ketiga tahap ini kemudian diulangi
selama 25-35 siklus dan diakhir proses PCR hasil akan disimpan pada suhu
penyimpanan sebesar 4℃ (Joko, et al., 2011).
Joko, et al. (2011) menyatakan bahwa primer merupakan salah satu faktor
penting yang akan mempengaruhi kualitas hasil identifikasi dengan menggunakan
teknik PCR. Primer merupakan oligonukleotida yang berperan dalam mengawali
proses amplifikasi DNA dan keberadaannya yang akan membua gen target
teramplifikasi sepanjang reaksi berlangsung. Primer juga berperan sebagai
pembatas DNA yang akan diamplifikasi dan menyediakan gugus hidroksi (-OH)
pada ujung 3’ yang diperlukan untuk proses eksistensi DNA. Selama perancangan
dan penentuan primer yang baik diperlukan beberapa kriteria yang harus terpenuhi
seperti panjang primer, persentase jumlah basa G dan C, nilai melting temperature
(Tm), selisih melting temperature (ΔTm), dan interaksi primer (dimer dan hairpins)
(Sasmitha, et al., 2018). Berdasarkan uraian tersebut, maka tujuan praktikum ini
adalah untuk mengetahui desain primer yang sesiai dengan kriteria optimal primer
dari gen COX-2 pada Oncorhynchus mykiss untuk digunakan pada teknik PCR.
 II. METODE PENELITIAN

Desain primer gen COX-2 pada Oncorhynchus mykiss dianalisis dengan

menggunakan beberapa program open source dari website dan software sebagai
berikut:
A. Genebank database NCBI (National Centre for Biotechnology Information)
a. Membuka situs web Genebank database NCBI pada laman
www.ncbi.mlh.nih.gov.
b. Memilih opsi “nucleotide” pada kolom pencarian.
c. Mengetik kata pencarian berupa “NC_035084.1 (Oncorhynchus mykiss
isolate Swanson chromosome 8, Omyk_1.0, whole genome shotgun
sequence)” pada kolom pencarian.
d. Menyunting daerah situs penyandi COX-2 dengan urutan nukleotida
50818311-50822994.
e. Menggunakan urutan nukleotida 50818311-50822994 (FASTA) sebagai
input untuk desain primer pada program Primer3 Input.
B. Desain primer: Primer3 Input ver. 0.4.0
a. Membuka situs web Primer3 Input pada laman http://bioinfo.ut.ee/primer3-
0.4.0/.
b. Menyalin urutan nukleotida 50818311-50822994 (FASTA) pada kolom
mispriming library.
c. Mengisi kolom new product dengan size range: 501-600.
d. Memilih pilihan pick primer pada kolom pilihan.
e. Hasil desain primer: Primer3 output.
C. Analisis dimerisasi primer: PerlPrimer
a. Membuka aplikasi PerlPrimer yang telah terinstal di laptop.
b. Memilih menu “primers” ketika aplikasi sudah terbuka.
c. Menyalin hasil primer3 output pada kolom sequence forward primer untuk
urutan left primer dan sequence reverse primer untuk urutan right primer.
d. Memilih pilihan calculate primer pada bagian bawah.
e. Hasil analisis dimerisasi primer terdapat pada kolom dimers
 III. HASIL DAN PEMBAHASAN

Gambar 1. Lokasi Gen COX-2 pada Kromosom 8

Berdasarkan hasil analisis melalui NCBI mengenai gen COX-2 diketahui

lokasi gen COX-2 pada kromosom ikan trout pelangi (Gambar 1). Setelah diketahui
posisi gen yang akan digunakan kemudian dilakukan desain primer DNA ikan trout
pelangi pada gen COX-2 yang berasal dari data genebank pada NCBI dengan
karakteristik sebagai berikut:

LOCUS NC_035084 4684 bp DNA linear CON

27-JUN-2017
DEFINITION Oncorhynchus mykiss isolate Swanson chromosome 8,
Omyk_1.0, whole
genome shotgun sequence.
ACCESSION NC_035084 REGION: 50818311..50822994
VERSION NC_035084.1
DBLINK BioProject: PRJNA390662
BioSample: SAMN05449231
Assembly: GCF_002163495.1
KEYWORDS WGS; RefSeq.
SOURCE Oncorhynchus mykiss (rainbow trout)
ORGANISM Oncorhynchus mykiss
Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata;
Euteleostomi; Actinopterygii; Neopterygii; Teleostei;
Protacanthopterygii; Salmoniformes; Salmonidae;
Salmoninae; Oncorhynchus.
FEATURES Location/Qualifiers
source 1..4684
/organism="Oncorhynchus mykiss"
/mol_type="genomic DNA"
/isolate="Swanson"
/db_xref="taxon:8022"
/chromosome="8"
/sex="male"
/tissue_type="fin clip"
 /dev_stage="adult"
/country="USA: Swanson River, Alaska"
gene 1..4684
/gene="cox-2"
/note="cyclooxygenase-2; Derived by automated
computational analysis using gene prediction
method:BestRefSeq,Gnomon."/db_xref="GeneID:10
0136025"
ORIGIN
1 caggagtcga ctggaatttg acattttata ccggattgcg attcaataga atctttcggg
61 gatgaataga gtaatctgta taattttgct cttgactgtg gggctctact tctgcgaagg
121 aggtgagcat atttattttg attctcatgt gaatattttt ttcatcttta gttattctat
181 tgtgaataac taaattatac ctttactgta cagcaggtgt tttcgattta tctgaattgt
241 ttgttaaaga ttataatgct tgtaatgaaa aaaaaattgt cattaataat acttttgtat
301 agccttctaa acttttgccg tatcttttca gttgatcctt gctgtgcaca gccttgtgaa
361 aatagggggt tatgtaattc aaaaggcttt gacaactatg agtgcgactg cacaaggact
421 ggatattatg gaaagaactg cacaactcgt aagtaaaaca tttttcagta atacagatta
481 ttccaacgat ataatggggc attcttatta ccgcgattta ttcgttattg ttgtcataca
541 tatttcccac ttctatccac tctgcagctg aattcctaac atggataaaa atatcattga
601 aaccagctcc gaacactatt cactacatcc ttactcacta caaagggttg tggaacgtca
661 tcaacaagat cacctttgtg agaaacgcta taatgagcta tgtcctgaca tgtaagttga
721 aatagtaaaa ccttttcgtt agcgcattat agaagtttgc attaagattt gttaatgaat
781 gaaagaaagt tgactcaatt aattatgtgg atatatggta tttactgaca tgggaagtat
841 ggagataaag taagaatata ataaataaat aaataacaca ttgaaaatat tttttttatt
901 tttacattca atttaaaaga ttaggtcctt gctcagcttc ctaacaaaat aaatatttct
961 gcctttgcct ctatagcccg ctcacatttg gtggacagcc caccgactta caatgctgat
1021 tatggctaca agagctggga ggcctactcc aatctgtctt actacacacg gacgctcccc
1081 ccattgccaa aggactgccc tacacctatg ggaaccgcag gtaatgagtt cacgcctaac
1141 cagtcttttg ggattcctta cagtttacct gagattatgg aaaccttaaa aattcccctc
1201 cgatgggtta ctcaatcatt cccaccagtc gaaagtcaca gacttcccaa gagtccaaaa
1261 ggagacggaa caataacgca gtcatatgaa cattatttta actgtcttta ttaaccaaat
1321 acattttttt gttgagatag aaccccaatt atgttcctaa catctttttt tgtctcttga
1381 taggaagagc agtgctcccg gatgtcaagc tcgtggtgga gaaggttttg ttgaggaagc
1441 ggttcattcc ggatcctcag ggttccaatc tcatgttcgc cttcttcgcc cagcacttca
1501 cccaccagtt cttcaaatca gacttcatga aaggaccagc tttcaccaaa gccttgggcc
1561 atggcgtaag tctaatttac aatacatgac aaatagtgcg tctgtcacat gaaaatatgt
1621 ttccattttg tttcatggtt gactttaact tagagtgtat gtttggactc actttctacc
1681 tctgtgtttc aggtggactt aaaccatgtt tacggagaca ctctggagag acagcacaag
1741 ctgaggctgt tcaaggatgg caaactgaag tatcgggttt tgaacggcga ggtctacccc
1801 ccattggtaa gggaggttgg ggccgagatg cactacccac cccaagtgcc cgaggagcac
1861 cgcttcgctg tgggccacga gcattttggc ttggtccccg ggctcatgat gtatgccacc
1921 atctggctgc gcgagcacaa ccgtgtctgt gacgtcctga ggcaggagca tcccgaatgg
1981 gacgacgaac gcatcttcca gaccacacgc ctcatcctaa ttggtgagtc accagtacca
2041 aaagtggaca cgcatactgt acctactggt cataaacact tcaggtcctt ataatgggaa
2101 tcgtatatga tcaaagtatg gcaatattca agtatgttct agaaactgta caatgcatac
2161 agatgaaaac agctctgtat aaaacagatc aaaactctat atttgggtgt caggtgttta
2221 ttgagaaatg tctcaccaac ctcaaggagt gttgtcatgc attctcttac tcccgccctc
2281 ccttctttcc tggctcgcag gcgagaccat taagatcgtg attgaggact atgtccagca
2341 cctgagtggc taccacttcc agctcaagtt cgacccggag ctcctcttca accagcgttt
2401 ccagtaccag aaccgtatcg cagctgagtt caataccctc taccactggc acccgctgat
2461 gcctgaaacc ttcagcattg aggaccgcgc ctacacctac ccccagtttg tcttcaacaa
2521 ctccctggtc acagagcacg gcatcaacaa cctggtggag tccttcacca agcagatcgc
2581 tggaagggtg agttgtcttg tggggtggac accgtggggt ccaatgagga atagcggaaa
2641 tgagtggaca ctaagatcct aacagcaata gtcttacatt ggggcctaag tgacaattct
2701 tatatcaact ttatatgcta aataatgaat aaatgagtgg agctgtataa gggcactgga
2761 gtttggtagg tgttcacttc gtagggcaac aacacctata tctaatggtg gaaatatatt
2821 aacgagaatg acaacagaca ccatacccca acaagatatt tttacagaga aaaaaaggtg
2881 tcaaaagttg atattgaccg aggatcttga ttccctttgg ttcccaggtg gctggtggac
2941 ggaacctgcc tcctgcacta gtgggcgtgg cagctaaggc cctggagcac agcagagaca
3001 tgcgttacca gtccctcaac gcctacagga aacgcttcaa catgagggcc tacacctcct
3061 ttgaggacct cacaggtgag aactgaaatt gtacacaccc tattatgata tgtgtatatc
3121 ctcaatcgaa tagttactta gttactaggt gaaaggtaac atttagtaag cacaggtcca
3181 tggcaactga agtagtccct ggataaagtg acaggattgg ttcagctctt ttgttattgg
3241 catcgttacc accttcatga cagctgctga tagagagtgg gcagggagtg agtgggcagg
3301 gagggagtga tccaagtgta tggtgtctgt acttgtgtta ttgagttccc ataaagacca
3361 aaacacagac ttgtcatagc atgcactttg tttgtcaact tattttttgg ggggaggtga
3421 ggatgtattg catgcctttc ttttgctgca ttgtggtata gacatttgtg agtagcaggc
3481 tagatttatt aaccctttgt ttgttgttct gttggtgttg caggagagac agagctggct
3541 gcggaactag agagtctata tggggatgta gatgctgtgg agctgtaccc aggccttctg
3601 gtggagcgcc ccagacctaa cgctgttttc ggggagacta tggtcgagat gggtgcaccc
3661 tactccctga aaggtctcct gggaaacccc atttgctcgc cggaatactg gatgcccagc
3721 acgttcggcg ggagtgtggg ctttgacatc gtcaacactg cttcattgga gaggctggtg
3781 tgcagcaatg tcaagggttc ttgtccgatg gtgtcctttc aagtgcctga ttttttgaga
3841 gcatttgagt cggcgtcagt caacacaagt gaggcccacc tgagtgacat gaacccaggt
3901 gttctgttca aagaaaggac ttcagagctt taaataactt aaacactagg ttctattcaa
3961 gtacacaaat acacagtttc tcagtgttct aaagatggtc tcgttttagc ttaatttgct
4021 ttatttagtt atttattatt gattaattta tgtatttaat atttattttg tactgttgaa
4081 tattgagttg ttattaagtt attaagtcat tattatgttt ttaaatatgg atacctatta
4141 caaatgtctt acatgaacaa aagcaagtta gtttactctg tatacaatgt ggaacttgaa
4201 ggagttgcat ttacttgaag aaaataacta ttagcaatac ttgtatgttg ttcagctact
4261 gaatggatac agctgggctg tatttgtcaa tacttttttt gttactttaa agacaaagac
4321 tttattattg taaatggatg aagtgtataa tggatgtaga aatatacagt tttttcagaa
4381 agtatgaaga caccgtattt ttctccagcc ccatccctca gctgtttacc aaagacagtg
4441 gcgggctgtc tgttttttgt tgttgtttca actgcggatt gccccttaaa tgttatgaaa
4501 gtcataattt acattccaac taaaatggtt aggcacttga gaaaacatta aaagacaatc
4561 gatctgtcaa gattataatt ttattagtct gattcaattg cgtatattca tgtcactatg
4621 tcaccccttg accttttcca cattttgttg tgttactgcc tgaataaaaa aatgattaca
4681 ttga
//

Berdasarkan data sekuen DNA gen COX-2 di atas dapat diketahui bahwa
sekuen DNA gen penandanya memiliki panjang 4684 bp dengan accession number
NC_035084. Berdasarkan data sekuens gen COX-2 yang disalin ke dalam program
Primer3 Input (versi 0.4.0) di dapatkan hasil sebagai berikut:
Primer3 Output
No mispriming library specified
Using 1-based sequence positions
OLIGO start len tm gc% any 3' seq
LEFT PRIMER 2545 20 60.00 55.00 5.00 3.00 CAACAACCTGGTGGAGTCCT
RIGHT PRIMER 3061 20 59.96 55.00 5.00 3.00 AAGGAGGTGTAGGCCCTCAT
SEQUENCE SIZE: 4684
INCLUDED REGION SIZE: 4684

PRODUCT SIZE: 517, PAIR ANY COMPL: 4.00, PAIR 3' COMPL: 2.00

1 CAGGAGTCGACTGGAATTTGACATTTTATACCGGATTGCGATTCAATAGAATCTTTCGGG

61 GATGAATAGAGTAATCTGTATAATTTTGCTCTTGACTGTGGGGCTCTACTTCTGCGAAGG

121 AGGTGAGCATATTTATTTTGATTCTCATGTGAATATTTTTTTCATCTTTAGTTATTCTAT

181 TGTGAATAACTAAATTATACCTTTACTGTACAGCAGGTGTTTTCGATTTATCTGAATTGT

241 TTGTTAAAGATTATAATGCTTGTAATGAAAAAAAAATTGTCATTAATAATACTTTTGTAT

301 AGCCTTCTAAACTTTTGCCGTATCTTTTCAGTTGATCCTTGCTGTGCACAGCCTTGTGAA

361 AATAGGGGGTTATGTAATTCAAAAGGCTTTGACAACTATGAGTGCGACTGCACAAGGACT

421 GGATATTATGGAAAGAACTGCACAACTCGTAAGTAAAACATTTTTCAGTAATACAGATTA

481 TTCCAACGATATAATGGGGCATTCTTATTACCGCGATTTATTCGTTATTGTTGTCATACA

541 TATTTCCCACTTCTATCCACTCTGCAGCTGAATTCCTAACATGGATAAAAATATCATTGA

601 AACCAGCTCCGAACACTATTCACTACATCCTTACTCACTACAAAGGGTTGTGGAACGTCA

661 TCAACAAGATCACCTTTGTGAGAAACGCTATAATGAGCTATGTCCTGACATGTAAGTTGA

721 AATAGTAAAACCTTTTCGTTAGCGCATTATAGAAGTTTGCATTAAGATTTGTTAATGAAT

781 GAAAGAAAGTTGACTCAATTAATTATGTGGATATATGGTATTTACTGACATGGGAAGTAT

841 GGAGATAAAGTAAGAATATAATAAATAAATAAATAACACATTGAAAATATTTTTTTTATT

901 TTTACATTCAATTTAAAAGATTAGGTCCTTGCTCAGCTTCCTAACAAAATAAATATTTCT

961 GCCTTTGCCTCTATAGCCCGCTCACATTTGGTGGACAGCCCACCGACTTACAATGCTGAT
1021 TATGGCTACAAGAGCTGGGAGGCCTACTCCAATCTGTCTTACTACACACGGACGCTCCCC

1081 CCATTGCCAAAGGACTGCCCTACACCTATGGGAACCGCAGGTAATGAGTTCACGCCTAAC

1141 CAGTCTTTTGGGATTCCTTACAGTTTACCTGAGATTATGGAAACCTTAAAAATTCCCCTC

1201 CGATGGGTTACTCAATCATTCCCACCAGTCGAAAGTCACAGACTTCCCAAGAGTCCAAAA

1261 GGAGACGGAACAATAACGCAGTCATATGAACATTATTTTAACTGTCTTTATTAACCAAAT

1321 ACATTTTTTTGTTGAGATAGAACCCCAATTATGTTCCTAACATCTTTTTTTGTCTCTTGA

1381 TAGGAAGAGCAGTGCTCCCGGATGTCAAGCTCGTGGTGGAGAAGGTTTTGTTGAGGAAGC

1441 GGTTCATTCCGGATCCTCAGGGTTCCAATCTCATGTTCGCCTTCTTCGCCCAGCACTTCA

1501 CCCACCAGTTCTTCAAATCAGACTTCATGAAAGGACCAGCTTTCACCAAAGCCTTGGGCC

1561 ATGGCGTAAGTCTAATTTACAATACATGACAAATAGTGCGTCTGTCACATGAAAATATGT

1621 TTCCATTTTGTTTCATGGTTGACTTTAACTTAGAGTGTATGTTTGGACTCACTTTCTACC

1681 TCTGTGTTTCAGGTGGACTTAAACCATGTTTACGGAGACACTCTGGAGAGACAGCACAAG

1741 CTGAGGCTGTTCAAGGATGGCAAACTGAAGTATCGGGTTTTGAACGGCGAGGTCTACCCC

1801 CCATTGGTAAGGGAGGTTGGGGCCGAGATGCACTACCCACCCCAAGTGCCCGAGGAGCAC

1861 CGCTTCGCTGTGGGCCACGAGCATTTTGGCTTGGTCCCCGGGCTCATGATGTATGCCACC

1921 ATCTGGCTGCGCGAGCACAACCGTGTCTGTGACGTCCTGAGGCAGGAGCATCCCGAATGG

1981 GACGACGAACGCATCTTCCAGACCACACGCCTCATCCTAATTGGTGAGTCACCAGTACCA

2041 AAAGTGGACACGCATACTGTACCTACTGGTCATAAACACTTCAGGTCCTTATAATGGGAA

2101 TCGTATATGATCAAAGTATGGCAATATTCAAGTATGTTCTAGAAACTGTACAATGCATAC

2161 AGATGAAAACAGCTCTGTATAAAACAGATCAAAACTCTATATTTGGGTGTCAGGTGTTTA

2221 TTGAGAAATGTCTCACCAACCTCAAGGAGTGTTGTCATGCATTCTCTTACTCCCGCCCTC

2281 CCTTCTTTCCTGGCTCGCAGGCGAGACCATTAAGATCGTGATTGAGGACTATGTCCAGCA

2341 CCTGAGTGGCTACCACTTCCAGCTCAAGTTCGACCCGGAGCTCCTCTTCAACCAGCGTTT

2401 CCAGTACCAGAACCGTATCGCAGCTGAGTTCAATACCCTCTACCACTGGCACCCGCTGAT

2461 GCCTGAAACCTTCAGCATTGAGGACCGCGCCTACACCTACCCCCAGTTTGTCTTCAACAA

2521 CTCCCTGGTCACAGAGCACGGCATCAACAACCTGGTGGAGTCCTTCACCAAGCAGATCGC
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
2581 TGGAAGGGTGAGTTGTCTTGTGGGGTGGACACCGTGGGGTCCAATGAGGAATAGCGGAAA

2641 TGAGTGGACACTAAGATCCTAACAGCAATAGTCTTACATTGGGGCCTAAGTGACAATTCT

2701 TATATCAACTTTATATGCTAAATAATGAATAAATGAGTGGAGCTGTATAAGGGCACTGGA
2761 GTTTGGTAGGTGTTCACTTCGTAGGGCAACAACACCTATATCTAATGGTGGAAATATATT

2821 AACGAGAATGACAACAGACACCATACCCCAACAAGATATTTTTACAGAGAAAAAAAGGTG

2881 TCAAAAGTTGATATTGACCGAGGATCTTGATTCCCTTTGGTTCCCAGGTGGCTGGTGGAC

2941 GGAACCTGCCTCCTGCACTAGTGGGCGTGGCAGCTAAGGCCCTGGAGCACAGCAGAGACA

3001 TGCGTTACCAGTCCCTCAACGCCTACAGGAAACGCTTCAACATGAGGGCCTACACCTCCT
<<<<<<<<<<<<<<<<<<<
3061 TTGAGGACCTCACAGGTGAGAACTGAAATTGTACACACCCTATTATGATATGTGTATATC
<
3121 CTCAATCGAATAGTTACTTAGTTACTAGGTGAAAGGTAACATTTAGTAAGCACAGGTCCA

3181 TGGCAACTGAAGTAGTCCCTGGATAAAGTGACAGGATTGGTTCAGCTCTTTTGTTATTGG

3241 CATCGTTACCACCTTCATGACAGCTGCTGATAGAGAGTGGGCAGGGAGTGAGTGGGCAGG

3301 GAGGGAGTGATCCAAGTGTATGGTGTCTGTACTTGTGTTATTGAGTTCCCATAAAGACCA

3361 AAACACAGACTTGTCATAGCATGCACTTTGTTTGTCAACTTATTTTTTGGGGGGAGGTGA

3421 GGATGTATTGCATGCCTTTCTTTTGCTGCATTGTGGTATAGACATTTGTGAGTAGCAGGC

3481 TAGATTTATTAACCCTTTGTTTGTTGTTCTGTTGGTGTTGCAGGAGAGACAGAGCTGGCT

3541 GCGGAACTAGAGAGTCTATATGGGGATGTAGATGCTGTGGAGCTGTACCCAGGCCTTCTG

3601 GTGGAGCGCCCCAGACCTAACGCTGTTTTCGGGGAGACTATGGTCGAGATGGGTGCACCC

3661 TACTCCCTGAAAGGTCTCCTGGGAAACCCCATTTGCTCGCCGGAATACTGGATGCCCAGC

3721 ACGTTCGGCGGGAGTGTGGGCTTTGACATCGTCAACACTGCTTCATTGGAGAGGCTGGTG

3781 TGCAGCAATGTCAAGGGTTCTTGTCCGATGGTGTCCTTTCAAGTGCCTGATTTTTTGAGA

3841 GCATTTGAGTCGGCGTCAGTCAACACAAGTGAGGCCCACCTGAGTGACATGAACCCAGGT

3901 GTTCTGTTCAAAGAAAGGACTTCAGAGCTTTAAATAACTTAAACACTAGGTTCTATTCAA

3961 GTACACAAATACACAGTTTCTCAGTGTTCTAAAGATGGTCTCGTTTTAGCTTAATTTGCT

4021 TTATTTAGTTATTTATTATTGATTAATTTATGTATTTAATATTTATTTTGTACTGTTGAA

4081 TATTGAGTTGTTATTAAGTTATTAAGTCATTATTATGTTTTTAAATATGGATACCTATTA

4141 CAAATGTCTTACATGAACAAAAGCAAGTTAGTTTACTCTGTATACAATGTGGAACTTGAA

4201 GGAGTTGCATTTACTTGAAGAAAATAACTATTAGCAATACTTGTATGTTGTTCAGCTACT

4261 GAATGGATACAGCTGGGCTGTATTTGTCAATACTTTTTTTGTTACTTTAAAGACAAAGAC

4321 TTTATTATTGTAAATGGATGAAGTGTATAATGGATGTAGAAATATACAGTTTTTTCAGAA

4381 AGTATGAAGACACCGTATTTTTCTCCAGCCCCATCCCTCAGCTGTTTACCAAAGACAGTG

4441 GCGGGCTGTCTGTTTTTTGTTGTTGTTTCAACTGCGGATTGCCCCTTAAATGTTATGAAA

4501 GTCATAATTTACATTCCAACTAAAATGGTTAGGCACTTGAGAAAACATTAAAAGACAATC
 4561 GATCTGTCAAGATTATAATTTTATTAGTCTGATTCAATTGCGTATATTCATGTCACTATG

4621 TCACCCCTTGACCTTTTCCACATTTTGTTGTGTTACTGCCTGAATAAAAAAATGATTACA

4681 TTGA

Selanjutnya hasil dari Primer3 Input dianalisis dengan menggunakan aplikasi

PerlPrimer dan didapatkan hasil sebagai berikut:

Gambar 2. Hasil Analsis Desain Primer dengan Aplikasi PerlPrimer

 Berdasarkan hasil desain primer didapatkan persentase GC sebesar 55%.
Persentase ini merupakan persentase antara guanan dan sitosin dalam suatu primer.
Persentase GC yang optimal untuk suatu primer adalah sebesar 40-60% (Pahlevi,
2016). Hal ini menandakan bahwa primer yang memiliki persentase GC sebesar
55% masih berada pada rentang kriteria GC yang baik. Keberadaan GC yang
rendah pada suatu primer dapat berakibat pada menurunnya efesiensi proses PCR,
hal ini dikarenakan primer tidak dapat melakukan penempelan secara efektif pada
template (Pradnyaniti, et al., 2013). Sedangkan jika kandungan GC yang
didapatkan tinggi maka akan mempersulit proses pemisahan rantai untai ganda
pada primer dan template (Sasmitha, et al., 2018).
Selanjutnya adalah panjang primer, pada praktikum ini didapatkan panjang
primer 20 basa. Hasil panjang primer yang di dapatkan ini juga masih tergolong
dalam kondisi primer yang baik karena menurut Pahlevi (2016) panjang primer
sebesar 18-30 basa merupakan kriteria yang baik untuk mendesain suatu primer.
Kriteria panjang primer didasarkan pada pertimbangan kombinasi acak yang
mungkin ditemukan pada suatu urutan genom. Jika suatu primer memiliki panjang
kurang dari 18 basa maka akan mudah terjadinya mispriming yang merupakan
proses penempelan primer pada lokasi yang salah. Sedangkan jika panjang yang
dimiliki lebih dari 30 basa maka akan terjadi proses hibridisasi dengan primer lain
dan dapat menghambat terbentunya polimerasi DNA (Sasmitha, et al., 2018).
Kemudian kriteria lainnya yang menjadi pertimbangan adalah nilai Tm
(melting temperature) dan ΔTm. Tm merupakan suhu dimana 50% untai ganda
DNA telah terpisah dan ΔTm merupakan selisih dari primer forward dan reserve
(Sasmitha, et al., 2018). Suhu leleh atau Tm merupakan suhu yang dibutuhkan oleh
suatu primer untuk melakukan disosiasi atau pelepasan ikatan. Terdapat berbagai
macam model perhitungan yang dapat digunakan untuk menentukan Tm seperti
Wallace’s Formula, Bolton and McCarthy’s Formula dan Thermodynamic Basis
Sets for Nearest Neighbor Interactions (Sasmito, et al., 2014). Tm yang akan
digunakan oleh primer sebaiknya harus sama untuk memastikan kinerja yang
konsisten pada pasangan primer, oleh sebab itu nilai ΔTm yang baik adalah tidak
lebih dari 5, karena jika lebih tinggi dari 5 maka akan dapat menurunkan proses
amplifikasi DNA. Sedangkan untuk nilai Tm yang sesuai dengan rekomendasi
adalah antara 50-65°C (Sasmitha, et al., 2018). Tm forward dan reverse yang
didapatkan secara berturut-turut adalah 62,21℃ dan 62,71℃. Sedangkan untuk
ΔTm sebesar 0,5. Berdasarkan kriteria yang sudah disebutkan sebelumnya maka
nilai Tm dan ΔTm yang didapatkan pada praktikum kali ini tergolong dalam
kondisi primer yang baik. Nilai Tm yang terlalu tinggi dapat menghasilkan produk
PCR yang rendah, sedangkan jika terlalu rendah dapat menyebabkan primer
memiliki kecenderungan menempel pada tempat lain dan mengahasilkan produk
akhir yang tidak spesifik. Melalui nilai Tm yang didapatkan pada desain primer
dapat digunakan untuk menetapkan suhu annealing dalam PCR (Pradnyaniti, et al.,
2013).
Kriteria terakhir yang diamati adalah nilai dG. Berdasarkan hasil praktikum
kali ini didapatkan nilai dG berurutan adalah -0,89 kcal/mol, -2,42 kcal/mol, -3,55
kcal/mol, -1,40 kcal/mol, dan -2,64 kcal/mol. Menurut Sasmito, et al. (2014)
kriteria dimer yang baik pada ujung 3’ adalah tidak lebih dari -5 kcal/mol dan pada
bagian internal dengan nilai -6 kcal/mol masih dapat ditoleransi. Kriteria ini
berlaku baik untuk self-dimer ataupun cross-dimer. Berdasarkan kriteria tersebut,
maka hasil yang didapatkan pada praktikum tergolong ke dalam kategori primer
yang baik. Setelah dilakukan penelitian desain primer pada 4 parameter yang
diamati, diketahui bahwa desain primer untuk gen COX-2 pada Oncorhynchus
mykiss dinilai baik dan sesuati dengan kriteria primer yang optimal.
 IV. KESIMPULAN

Berdasarkan hasil praktikum dapat disimpulkan bahwa didapatkan hasil

desain primer yang baik dan optimal dari gen COX-2 pada Oncorhynchus mykiss.
Hal ini ditandai dengan melakukan pengamatan pada beberapa kriteria seperti
persentase GC sebesar 55%, panjang primer sebesar 20 basa, Tm secara berturut-
turut pada forward dan reverse adalah 62,21℃ dan 62,71℃ dengan nilai ΔTm
sebesar 0,5, dan kriteria terakhir adalah nilai dG adalah -0,89 kcal/mol, -2,42
kcal/mol, -3,55 kcal/mol, -1,40 kcal/mol, dan -2,64 kcal/mol.
 DAFTAR REFERENSI

Fajrin, F. A., 2013. Keterkaitan Cyclooxygenase (COX)-2 Terhadap Perkembangan

Terapi Kanker. Stomatognatic (J. K. G Unej), 10(1), pp. 6-11.
Joko, T., Kusumandari, N. & Hartono, S., 2011. Optimasi Metode PCR untuk
Deteksi Pectobacterium carotovorum, Penyebab Penyakit Busuk Lunak
Anggrek. Jurnal Perlindungan Tanaman Indonesia, 17(2), p. 54–59.
Kusumastuti, E., Handajani, J. & Susilowati, H., 2014. Ekspresi COX-2 dan Jumlah
Neutrofil Fase Inflamasi pada Proses Penyembuhan Luka Setelah Pemberian
Sistemik Ekstrak Etanolik Rosela (Hibiscus sabdariffa) (studi in vivo pada
Tikus Wistar). Maj Ked Gi, 21(1), pp. 13-19.
Pahlevi, M. R., 2016. Desain Primer untuk Identifikasi Gen GmDREB2 pada
Kedelai. Jurnal Agrinis, 1(1), pp. 1-8.
Pradnyaniti, D. G., Wirajana, I. N. & Yowani, S. C., 2013. Desain Primer secara in
silico untuk Amplifikasi Fragmen Gen rpoB Mycobacterium tuberculosis
dengan Polymerase Chain Reaction (PCR). Jurnal Farmasi Udayana, 2(3),
pp. 124-130.
Ramadhani, N. & Sumiwi, S. A., 2016. Aktivitas Antiinflamasi Berbagai Tanaman
diduga Berasal dari Flavonoid. Farmaka, 14(2), pp. 111-123.
Sasmitha, L. V., Yustiantara, P. S. & Yowani, S. C., 2018. Desain DNA Primer
Secara In Silico Sebagai Pendeteksi Mutasi Gen Gyra Mycrobacterium
tuberculosis untuk Metode Polymerase Chain Reaction. Cakra Kimia
(Indonesian E-Journal of Applied Chemistry), 6(1), pp. 63-69.
Sasmito, D. E. K., Kurniawan, R. & Muhimmah, I., 2014. Karakteristik Primer
pada Polymerase Chain Reaction (PCR) untuk Sekuensing DNA: Mini
Review. Yogyakarta, Seminar Nasional Informatika Medis (SNIMed) V.
Sobolewski, C. et al., 2009. The Role of Cyclooxygenase-2 in Cell Proliferation
and Cell Death in Human Malignancies. International Journal of Cell Biology,
2010(215158), pp. 1-21.
Triwani & Saleh, I., 2015. Single Nucleotide Polymorphism Promoter -765g/C Gen
COX-2 Sebagai Faktor Risiko Terjadinya Karsinoma Kolorektal. Biomedical
Journal of Indonesia, 1(1), pp. 2-10.
Yusuf, Z. K., 2010. Polymerase Chain Reaction (PCR). Saintek, 5(6), pp. 1-6.