JURNAL ILMU KESEHATAN KELAUTAN

AKTIVASI NRF2 PADA ASTROCYTES BERKONTRIBUSI PADA

TOLERANSI ISKEMIK SPINAL CORD YANG DIPICU OLEH
PRAKONDISI OKSIGEN HIPERBARIK

Pembimbing :
dr. Ni Komang Sri Dewi Untari, Sp. S., M.Kes

Penyusun :
Cindy Ramadhani 201704200216

LEMBAGA KESEHATAN ANGKATAN LAUT

DRS. MED. R. RIJADISASTROPANOELAR., PHYS.
FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS HANG TUAH
SURABAYA
2020
 LEMBAR PENGESAHAN
JURNAL
AKTIVASI NRF2 PADA ASTROCYTES BERKONTRIBUSI PADA
TOLERANSI ISKEMIK SPINAL CORD YANG DIPICU OLEH
PRAKONDISI OKSIGEN HIPERBARIK

Jurnal yang berjudul “AKTIVASI NRF2 PADA ASTROCYTES

BERKONTRIBUSI PADA TOLERANSI ISKEMIK SPINAL CORD YANG
DIPICU OLEH PRAKONDISI OKSIGEN HIPERBARIK”telah diperiksa
dan disetujui sebagai salah satu tugas dalam menyelesaikan studi
kepaniteraan klinik Dokter Muda di bagian ilmu Kesehatan Kelautan

Surabaya, 11 Februari 2020

Pembimbing

dr. Ni Komang Sri Dewi Untari, Sp. S., M. Kes

i
 KATA PENGANTAR

Puji syukur kami panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa karena
atas berkah dan rahmatNya, kami bisa menyelesaikan laporan kasus dan
journal reading dengan judul “AKTIVASI NRF2 PADA ASTROCYTES
BERKONTRIBUSI PADA TOLERANSI ISKEMIK SPINAL CORD YANG
DIPICU OLEH PRAKONDISI OKSIGEN HIPERBARIK” dengan lancar.
Case report dan journal reading ini disusun sebagai salah satu tugas wajib
untuk menyelesaikan kepaniteraan klinik di bagian LAKESLA Drs Med
R.Rijadi S., Phys. Surabaya dengan harapan dapat dijadikan sebagai
tambahan ilmu yang bermanfaat bagi pengetahuan penulis maupun
pembaca.
Dalam penulisan dan penyusunan tugas ini tidak lepas dari bantuan
dan dukungan berbagai pihak, untuk itu kami mengucapkan terima kasih
kepada:
a. Ni Komang Sri Dewi Untari, dr., Sp. S., M. Kes
b. Para dokter di bagian LAKESLA Drs. Med. R. Rijadi
Sastropanoelar., Phys. Surabaya.
c. Para perawat dan pegawai di LAKESLA Drs. Med. R. Rijadi
Sastropanoelar., Phys.Surabaya.
Kami menyadari bahwa tugas yang kami susun ini masih jauh dari
kesempurnaan, maka saran dan kritik yang membangun dari semua pihak
sangat diharapkan. Semoga referat ini dapat memberi manfaat.

Surabaya, 11 Februari 2020

Penyusun

ii
 DAFTAR ISI

LEMBAR PENGESAHAN ........................................................................... i

KATA PENGANTAR ...................................................................................ii
DAFTAR ISI ............................................................................................... iii
Abstrak ....................................................................................................... 5
Pengantar .................................................................................................. 6
Metode ....................................................................................................... 7
Hewan dan kelompok ............................................................................. 7
HBO-PC in vivo ...................................................................................... 8
Prosedur operasi .................................................................................... 8
Skor lacomotor fungsional ...................................................................... 9
Kadar air spinal cord .............................................................................. 9
Elektrofisiologi ........................................................................................ 9
Imunohistokimia ................................................................................... 10
Uji aktivitas caspase ............................................................................. 11
Reaksi rantai polimerase waktu nyata kuantitatif (RT-PCR) ................. 11
Analisis western blot............................................................................. 12
Uji ikatan DNA Nrf2 .............................................................................. 12
Cell culture ........................................................................................... 13
HBO-PC secara in vitro ........................................................................ 14
Perawatan kekurangan oksigen dan glukosa (OGD) ........................... 14
Uji viabilitas sel ..................................................................................... 14
Pengukuran glutathione (GSH) ............................................................ 15
Analisis statistik .................................................................................... 15
Hasil ......................................................................................................... 15
HBO-PC meningkatkan hasil neurologis dan edema sumsum tulang
belakang dalam model SCIR tikus ....................................................... 15
HBO-PC meningkatkan kelainan elektrofisiologis pada model SCIR tikus
............................................................................................................. 16
HBO-PC memperlambat proses apoptosis pada sumsum tulang
belakang tikus dengan cedera SCIR .................................................... 17
HBO-PC menginduksi aktivasi Nrf2 dan pengaturan atas ekspresi
downstram gene Nrf2 pada spinal cord tikus........................................ 17
HBO-PC meningkatkan konten GSH dari SpinalCcord dengan cedera
SCIR ..................................................................................................... 18

iii
 Nrf2 berlebih yang disebabkan oleh HBO-PC terutama terlokalisasi
dalam astrocytes spinal cord tikus........................................................ 19
HBO-PC meningkatkan viabilitas sel neuron dalam kultur yang diobati
dengan OGD ........................................................................................ 21
HBO-PC menginduksi aktivasi Nrf2 dalam astrocytes co-cultur ........... 23
HBO-PC menginduksi pengaturan ekspresi gen hilir Nrf2 dalam astrosit
kultur bersama...................................................................................... 25
HBO-PC meningkatkan konten GSH media kultur dengan astrocyets
setelah pengobatan OGD ..................................................................... 25
Diskusi ..................................................................................................... 26
Pengakuan ............................................................................................... 32
Pernyataan Pengungkapan Penulis ......................................................... 32
DAFTAR PUSTAKA ................................................................................. 33

iv
Abstrak
Dalam penelitian ini, kami menyelidiki apakah aktivasi nuclear factor
erythroid 2 berhubungan dengan factor 2 (Nrf2) dalam astrocytes
berkontribusi terhadap perlindungan saraf yang disebabkan oleh single
hyperbaric oxygen preconditioning (HBO-PC) terhadap cedera spinal cord
iskemia / reperfusi (SCIR). In vivo: Pada 24 jam setelah HBO-PC tunggal
pada 2,5 atmosfer absolut selama 90 menit, tikus ICR jantan mengalami
cedera SCIR oleh operasi cross-clamping aorta dan diamati selama 48
jam. HBO-PC secara signifikan meningkatkan fungsi motor hindlimb,
mengurangi edema spinal cord sekunder, memperbaiki reaktivitas spinal
motor-evoked potentials, dan memperlambat proses apoptosis untuk
mengerahkan efek neuroprotektif terhadap cedera SCIR. Pada 12 jam
atau 24 jam setelah HBO-PC tanpa operasi cross-clamping aorta, Western
blot, enzyme-like immunosorbent assay, reaksi rantai polimerase dan
perwarnaan double-immunoflurescence digunakan untuk mendeteksi
aktivitas Nrf2 dari jaringan spinal cord, seperti Level mRNA, kandungan
protein, aktivitas pengikatan DNA, dan ekspresi downstream gene, seperti
glutamate-cysteine ligase, 𝛾-glutamyltransferase, multidrug resistence
protein 1, yang merupakan protein utama untuk sintesis dan transit
glutathione intraseluler. Aktivitas Nrf2 dan ekspresi downstream gene
semuanya meningkat pada spinal cord normal dengan HBO-PC.
Kandungan glutathione jaringan spinal cord dengan HBO-PC meningkat
secara signifikan pada semua titik waktu setelah cedera SCIR. Selain itu,
ekspresi berlebih Nrf2 terutama terjadi pada astrocytes. In vitro: Pada 24
jam setelah HBO-PC, spinal primer astrocytes-neuron co-cultur dari anak
tikus ICR menjadi sasaran oxygen-glucose deprivation (OGD) selama 90
menit untuk mensimulasikan cedera iskemia-reperfusi. HBO-PC secara
signifikan meningkatkan tingkat kelangsungan hidup neuron dan
kandunagn glutathione dalam media kultur, yang terutama dilepaskan dari
asctrocytes. Selain itu, aktivitas Nrf2 dan downstream genes yang
diinduksi oleh HBO-PC terutama menambah pada asctrocytes, tetapi tidak
pada neuron. Sebagai kesimpulan, temuan kami menunjukkan bahwa

5
toleransi iskemik spinal cord yang disebabkan oleh HBO-PC mungkin
terutama terkait dengan aktivasi Nrf2 pada asctrocytes.
Pengantar
Trauma iskemia-reperfusi spinal cord(SCIR) tetap menjadi komplikasi
yang parah akibat intervensi aorta thorax, baik terbuka maupun
endovaskular. Meskipun peningkatan dalam fungsi tambahan, seperti
perfusi aorta distal, drainase cairan serebrospinal, durasi drainase cairan
yang lebih kecil, hipotermia terlokalisasi, dan pemantauan potensial yang
muncul tampaknya secara sederhana mengurangi risiko cedera spinal
cord, kemajuan ini dalam operasi tambahan masih kontroversial dan
terbatas. Sayangnya, sekali cedera telah termanifestasi secara klinis, tidak
ada tambahan farmakologis yang terbukti manjur secara klinis mengurangi
cedera ini. Tambahan farmakologis untuk mengurangi komplikasi ini telah
lama dicari, dengan beberapa strategi terbukti menyaring hingga
penggunaan klinis.
Hyperbaric oxygen preconditioning (HBO-PC) telah ditemukan untuk
melindungi sistem saraf pusat (CNS) dari iskemik / reperfusi, yang
menunjukkan bahwa HBO-PC adalah metode yang aman dan layak dan
mungkin berpotensi menjanjikan untuk menyediakan pelindung saraf
manfaat untuk stroke iskemik di klinik. Ada bukti bahwa produksi reactive
oxygen species (ROS) pada tingkat yang tidak mematikan atau aktivitas
enzim antioksidan yang diregulasi memainkan peran penting dalam
toleransi iskemik yang diinduksi oleh HBO-PC. Mekanisme tepat yang
mendasari HBO-PC, bagaimanapun, belum sepenuhnya dijelaskan, dan
lebih banyak bukti diperlukan untuk HBO-PC untuk digunakan secara
klinis.
Selama evolusi, sel-sel telah mengembangkan mekanisme pertahanan
seluler yang kompleks dan strategi untuk mengatasi dan bertahan
melawan stres oksidatif. Nuclear factor erythroid 2 berhubungan dengan
factor 2 (Nrf2) adalah kunci faktor transkripsi untuk gen yang diatur unsur
respon antioksidan. Ekspresi detoksifikasi fase-II dan enzim antioksidan
diatur oleh elemen pengatur cis-acting yang bertindak yang dinamakan

6
antioxidant respone element (ARE). Gen yang mengandung ARE diatur
oleh Nrf2 yang merupakan member dari famili faktor transkripsi Cap n
Collar basic-leucine-zipper. Gen yang diregulasi oleh ARE diaktivasi oleh
astrosit dan memiliki efek detoksifikasi dan antioksidan yang lebih efisien
dibandingkan neuron. Astrocytes berinteraksi dengan neuron untuk
memberikan dukungan struktural, metabolik, dan trophic, serta
berpartisipasi aktif dalam modulasi neuron rangsangan dan transmisi
saraf. Oleh karena itu, perubahan fungsional pada astrosit dapat
membentuk interaksi dengan sel-sel di sekitarnya, seperti neuron dan
mikroglia. Aktivasi Nrf2 dalam astrocytes melindungi neuron dari beragam
ancaman baik in vitro maupun in vivo, hal ini meyakinkan peran astrocytes
terhadap kerentanan neuron terhadap stimuli berbahaya.
Dalam penelitian ini, kami menggunakan model tikus cedera SCIR yang
telah mapan dengan operasi cross-clamping aortic untuk menguji
hipotesis bahwa toleransi iskemik spinal cord yang disebabkan oleh HBO-
PC dikaitkan dengan peningkatan aktivitas transkripsi Nrf2. Selain itu,
kami menggunakan co-cultur astrocytes-neuron spinal untuk menyelidiki
apakah aktivasi Nrf2 dalam astrocyets memainkan peran penting dalam
efek neuroprotektif yang diinduksi HBO-PC terhadap cedera SCIR.
Metode
Hewan dan kelompok
Komite Perawatan dan Penggunaan Hewan dari Universitas
Kedokteran Militer Kedua menyetujui semua percobaan, dan investigasi
ini sesuai dengan Panduan untuk Perawatan dan Penggunaan Hewan
Laboratorium yang diterbitkan oleh National Institutes of Health. Tikus ICR
jantan dewasa (12-16 minggu; 25-30 g) digunakan untuk semua
percobaan dan ditempatkan pada suhu 22-24 °C dan 12:12 jam
lingkungan yang dikendalikan siklus cahaya / gelap dengan akses
langunsung ke makanan dan air. Dalam percobaan dengan perawatan
operasi, tikus secara acak ditugaskan untuk kelompok-kelompok berikut:
kelompok tiruan (n = 21); kelompok HBO-PC plus SCIR (n = 36);
kelompok SCIR (n = 36). Dalam percobaan hanya dengan HBO-PC, tikus

7
secara acak ditugaskan ke grup berikut: kelompok CON (n = 24);
kelompok post-HBO 12 jam (n = 36); kelompok post-HBO 24 jam (n = 39).
HBO-PC in vivo
Tikus terpapar oksigen 100% pada 2,5 atmosfer absolut (ATA) selama
90 menit dalam ruang tikus hiperbarik transparan (Tipe RDC 150-300-6,
Universitas Kedokteran Militer Kedua, Shanghai, Cina). Kompresi dan
dekompresi HBO dilakukan pada tingkat 0,2 ATA / menit. Gas dalam bilik
berventilasi terus menerus untuk mencegah retensi CO2, dan suhu
dipertahankan dalam kisaran 22-25°C. Setelah paparan HBO, tikus
dipelihara dalam lingkungan normoksik selama 24 jam sampai operasi
cross-clamping aorta.
Prosedur operasi
Untuk semua prosedur bedah, tikus dipelihara pada suhu yang
ditentukan sebelumnya (35-36 ° C) menggunakan platform bedah yang
suhunya dikontrol. Tikus di anestesi dengan isofluorane inhalasi 3% untuk
induksi, kemudian dipertahankan pada isofluorane 2% melalui masker
yang aliran O2 100%. Heparin (400 IU / kg) diberikan secara subkutan
untuk semua hewan sebelum prosedur. Menjelang cervicothoracic dengan
teknik aseptik digunakan untuk mengekspos lengkung aorta, seperti yang
dijelaskan sebelumnya. Di bawah visualisasi langsung, lengkungan aorta
cross-clamp antara arteri karotis kiri dan arteri subklavia kiri, kemudian klip
aneurisma tambahan adalah ditempatkan pada arteri subklavia untuk
meminimalkan aliran kolateral. Oklusi vaskular dikonfirmasi dengan laser
Doppler blood flow monitor (Moor Instruments, UK) untuk mencapai
penurunan lebih besar dari 90% dalam aliran aorta distal yang diukur pada
arteri femoralis, dan dipertahankan selama 4 menit. Kemudian klip
diangkat, dan dada ditutup berlapis-lapis.
Tikus tiruan memiliki lengkungan aorta yang terbuka melalui prosedur
yang sama tetapi tidak ada cross-clamping aorta. Dengan
mempertahankan suhu tubuhnya, tikus secara spontan pulih dari anestesi
pada platform bedah. Kandung kemih diekspresikan secara manual dua
kali per hari selama durasi percobaan. Tikus juga diberi Ringer laktasi

8
laktasi 1 mL secara subkutan dua kali per hari dan antibiotik profilaksis
sekali sehari selama 7 hari setelah operasi.
Skor lacomotor fungsional
Setelah reperfusi, fungsi hindlimb dikuantifikasi pada 0, 12, 24, 36, dan
48 jam menggunakan Basso Mouse Scale untuk Locomotion. Skala Basso
Mouse adalah skala 10-point (0-9) yang menggunakan definisi
operasional untuk mengukur besarnya dan tingkat pemulihan gerakan kaki
belakang, koordinasi kaki depan-belakang, dan stabilitas spinal pada tikus
yang cedera.
Kadar air spinal cord
Pada 48 jam setelah SCIR, bagian spinal cord T-10 sampai L-3
dipanen, ditimbang, dan dipanaskan pada 98°C selama 48 jam dan
ditimbang kembali. Persentase kadar air dihitung sebagai ([berat basah -
berat kering]/ berat basahx100).
Elektrofisiologi
Pada 1 minggu setelah sham atau SCIR, fungsi spinal cord dievaluasi
oleh motor-evoked potensial (MEPs) seperti dijelaskan
sebelumnya.Secara singkat, tikus dianestesi menggunakan
tribromoethanol, dan suhu dubur dipertahankan pada 37°C. Untuk tujuan
ini, tiga elektroda emas dimasukkan ke dalam kulit kepala dan satu ke soft
plate untuk menerapkan impuls listrik (MultiPulse Stimulator D185-Mark,
Digi- timer LTD) ke korteks motor untuk mengukur MEPs. Elektroda
ditempatkan di otot-otot ekstremitas untuk mengukur gerakan otot yang
disebabkan oleh impuls listrik. Setelah stimulasi listrik korteks motorik
otak, jawaban otot dari ekstremitas atas dan bawah dicatat. Intensitas
rangsangan adalah 1-3 mA, dan setiap respons yang direkam rata-rata 5
hingga 10 sapuan. Amplitudo diukur sebagai jarak dari garis dasar ke
puncak respons. Setiap titik data adalah rata-rata dua rekaman dari satu
sisi setiap mouse. Elektrofisiologi dilakukan secara buta. Kami
menganalisis amplitudo dan latensi MEP untuk menemukan perbedaan
setelah SCRI.

9
Uji Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling
(TUNEL)

Kolom vertebral telah dihilangkan dari blok T-10 hingga L-3, dan spinal
cord dipanen dengan menyuntikkan saline dengan buffer fosfat (PBS, pH
7.4) ke dalam kolom spinal. Spinal cord dipertahankan dalam formalin
10% selama setidaknya 24 jam sebelum penanaman dan pemotongan
parafin. Uji TUNEL dilakukan pada bagian yang tertanam parafin
menggunakan in-situ cell death detection kit (Roche Diagnostics Corp,
Indianapolis, IN). Menurut protokol standar, slide diinkubasi dengan 3%
H2O2 selama 5 menit, dibilas, dan kemudian diinkubasi dalam terminal
transferase (TdT) buffer for 15 min at 22°C. Campuran reaksi TdT
ditambahkan dan diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37°C. Setelah
memblokir dengan albumin serum sapi dan inkubasi dengan avidin-biotin
kompleks, reaksi TUNEL divisualisasikan dengan pewarnaan kromogenik
dengan 3,3 ¢ diami-nobenzidine. Jumlah sel TUNEL-positif dihitung oleh
ahli patologi pada perbesaran 200x, 30 bidang per bagian dibutakan oleh
kelompok studi.

Imunohistokimia
Bagian spinal cord diblokir oleh 10% serum kambing normal dengan
0,1% Triton x 100 selama 1 jam pada suhu kamar. Setelah dibilas dengan
PBS, bagian yang diambil diinkubasi dengan anti-Nrf2 (Sigma-Aldrich)
semalam pada suhu 4°C, dua kali diwarnai dengan anti-glial fibrillary
acidic protein (GFAP) atau anti-neuronal nuclei (NeuN) (Millipore) untuk
melabeli astrocytes atau neuron. Bagian tersebut kemudian dibilas dan
diinkubasi dengan alexa fluor (Alexa) atau fluorescein isothiocyanate
(FITC) konjugasi antibodi sekunder (Invitrogen) selama 1 jam pada suhu
kamar. Semua bagian dipasang dengan media Vectashield (Laboratorium
Vektor) dengan 4’, 6-diamidino-2- phenylindole (DAPI) dan slip penutup
diterapkan. Bagian jaringan dilihat dengan mikroskop, dan gambar
ditangkap menggunakan kamera.

10
Uji aktivitas caspase
Aktivitas caspase-3 dan caspase-9 diukur dengan capase-3/CPPD32
Fluorometric assay kit, dan capase-9/cpp32 Fluorometric assay kit
(Produk Penelitian Biovision, Mountain View, CA). Secara singkat, hewan
di-eutanasia pada 1 minggu setelah SCIR, dan spinal cord dipanen untuk
dianalisis. Sampel spinal cord dihomogenisasi dalam ice-cold cell lysis
buffer dan disimpan pada suhu 4°C selama 1 jam, dan homogen
disentrifugasi pada 12.000 g selama 15 menit pada suhu 4°C. Kandungan
protein diukur dengan protein assay kit BCA yang disempurnakan. Jumlah
sampel protein yang sama diinkubasi dalam plat 96-sumur dengan 50 mL
2x buffer reaksi. Tindakan dimulai dengan menambahkan 5mL dari
substrat 1mM DEVD-AFC. Setelah inkubasi dalam kegelapan pada suhu
37 ° C, plat tersebut dibaca dalam fluorometer yang dilengkapi dengan
filter eksitasi 400 nm dan filter emisi 505 nm.
Reaksi rantai polimerase waktu nyata kuantitatif (RT-PCR)
Untuk evaluasi Nrf2, glutamat-sistein ligase (GCL), 𝛾-
glutamiltransferase (𝛾GT), multidrug resistensi protein 1 (MRP1), dan 𝛽-
actin gene expression, dilakukan TaqMan RT-PCR. RNA diisolasi pada 12
jam dan 24 jam setelah HBO-PC menggunakan Trizol (Invitrogen,
Carlsbad, CA) sesuai dengan instruksi pabrik. Frist-strand cDNA disintesis
menggunakan Superscript II. cDNA dikuantifikasi dalam rangkap dua pada
Rotor-Gene RG3000 (Corbett Research, Sydney, Australia) menggunakan
SYBRgreen core rewagen kit (Probe Molekul) sesuai dengan instruksi
pabrik. Ekspresi setiap sampel dinormalisasi berdasarkan konten 𝛽-actin
mRNA.
Reaksi PCR dilakukan dalam volume 25 𝜇L dengan 2,5 𝜇L campuran
reaksi RT yang sesuai. Primer spesifik urutan berikut digunakan dalam
RT-PCR. Untuk Nrf2, maju, 5-TCAGCGACGGAAAGAGTA-3; mundur,
5TGGGCAACCTGGGAGTAG-3.Untuk GCL, maju,
5CGTGGTGGATGGGTGTAGC-3; sebaliknya,
5TAAAGCCTGATCCAAGTAACTCTG-3. Untuk cGT, maju,
5AAAGTGGCACAGGAGCGAGAT-3; mundur,5-

11
GGGATGAGTCCAGGAAACACG-3. Untuk MRP1, maju, 5-CAAT
GCTGTCATGGCGATG-3; sebaliknya, 5-
GATCCGATTGTCTTTGCTCTTCA-3. Untuk 𝛽-actin, maju, 5-
CCAGCCGAGCCACATCGCTC-3; mundur,
5ATGAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3. Reaksi dijalankan dalam rangkap
dua, dan data real-time dianalisis dengan Rotor-Gene Real-Time Analysis
Software 6.0.
Analisis western blot
Jaringan spinal cord yang terisolasi atau kultur sel primer ditempatkan
ke lysis buffer yang mengandung 10 mmol/L Tris-HCl (pH 7,6), 100
mmol/L NaCl, 1 mmol / L ethylenediaminetetraacetic acid, 1% (w/vol),
Triton X-100, dan protease inhibitor cocktail. Lysates kemudian disonikasi
dan disentrifugasi selama 15 menit pada 10.000 g pada 4°C. Supernatan
dikumpulkan dan konsentrasi protein ditentukan menggunakan metode
Bradford. Setiap sampel dipisahkan oleh SDS-PAGE dan dielektrolisis
menjadi polyvinylidene fluoride membrane. Setelah pemblokiran,
membran dihancurkan semalaman pada suhu 4°C dengan anti-Nrf2 (1:
2500), anti-GCL (1: 2500), anti-𝛾GT (1: 2500), anti-MRP1 (1: 2500), dan
anti 𝛽-actin (1: 2500) antibodi (Sigma-Aldrich). Setelah dicuci, bercak
diinkubasi selama 1 jam pada suhu kamar dengan horseradish peroxidase
(HRP) konjugasi antibodi sekunder (1:2000) (Santa Cruz Bio-technology).
Membran diperiksa kembali dengan 𝛽-actin untuk mengkonfirmasi
pemuatan yang sama. Antibodi primer divisualisasikan dengan
peningkatan kemurnian kimia. Berkas semi-kuantitatif menggunakan
densitometri.
Uji ikatan DNA Nrf2
Untuk mengukur aktivitas pengikatan Nrf2 DNA, ekstrak nuclear diperoleh
12 jam dan 24 jam setelah HBO-PC menggunakan nuclear extraction kit
(Motif Aktif). Aktifitas pengikatan Nrf2 DNA dari fraksi nuclear ditentukan
dengan menggunakan enzyme-liked immunosorbent assay-based kit
(Motif Aktif). Pengujian menggunakan pelat 96-sumur yang oligonukleotida
yang mengandung elemen respons antioksidan telah diimobilisasi. Nrf2

12
yang terkandung dalam ekstrak nuclear kemudian mengikat secara
khusus untuk oligonukleotida ini dan dideteksi melalui penggunaan
antibodi yang diarahkan terhadap Nrf2. Penambahan antibodi sekunder
yang terkonjugasi ke HRP memberikan pembacaan kolorimetri sensitif
yang mudah diukur dengan spektrofotometri. Spesifisitas uji dikonfirmasi
dengan menambahkan wild-type oligonucleotide (20 pmol) ke positive-
control nuclear extract. Penilaian pengujian ditentukan dengan analisis
statistik dari hasil kuantifikasi untuk oligonukleotida pesaing wild-type yang
masing-masing diukur tiga kali lipat dalam kenaikan tiga kali lipat.
Cell culture
Kultur astrocytes primer dan kultur neuron dibuat dari spinal cord anak
tikus ICR. Kultur astrocytes diunggulkan dengan kepadatan rendah
(15.000 / mL) pada Primaria plate (BD Falcon) dan tumbuh selama 2
minggu hingga pertemuan di MEM (Invitrogen) ditambah dengan 10%
serum kuda dan 25 U/mL penisilin ditambah 25 g / mL streptomisin. Pada
mencapai pertemuan, astrocytes diobati dengan 8 𝜇M cytosine-D-
arabinofuranoside, sebuah inhibitor mitosis selama 3 hari untuk
membunuh sel yang terkontaminasi. astrocytes digunakan untuk
percobaan pada 2 sampai 3 minggu dalam kultur. Pewarnaan GFAP
dikonfirmasi kemurnian lebih besar dari 95% dari culture astrocytes.
Neuron dimurnikan dengan sentrifugasi pada Optiprep cushion, diikuti
oleh isolasi p75NTR yang mengekspresikan neuron motorik dengan
seleksi immunoaffinity dengan antibodi monoklonal IgG, kemudian dilapisi
dalam MEM yang dilengkapi dengan 10% serum kuda, 2,5%, serum sapi
janin, dan 25 U / mL penisilin ditambah 25 g / mL streptomisin. Untuk
percobaan kultur bersama, kami mengembangkan sistem kultur 'sandwich'
di mana neuron spinal tumbuh di atas lapisan pengumpan astrocytes
spinal tikus, seperti yang dijelaskan sebelumnya oleh Banker dan Goslin.
Monolayer astrocytes dicuci dua kali dengan PBS, dan neuron disepuh di
atas dengan kepadatan 350 sel / cm2. Co-cultur dipertahankan selama 48
jam dalam medium L15 yang dilengkapi dengan 0,63mg / mL natrium
bikarbonat, 5𝜇g / mL insulin, 0,1mg / mL conalbumin, 0,1mM putrescine,

13
30nM sodium selenite, 20nM progesteron, 20mM glukosa, 100IU / mL
penisilin, streptomisin 100 𝜇g / mL, dan serum kuda 2%.
HBO-PC secara in vitro
Sel-sel biakan primer yang dikultur dalam OxyCure 3000 hiperbarik
inkubator (OxyHeal Health Group) pada 100% O2 di 2.4 ATA, pada 37°C
selama 90 menit. Untuk mempertahankan pH fisiologis, media kultur
diganti dengan media yang bebas CO2 (Gibco). Segera setelah
pengobatan, sel-sel dikembalikan ke media lengkap dan kondisi kultur
untuk pemulihan atau dipanen pada 12 dan 24 jam untuk analisis lebih
lanjut.
Perawatan kekurangan oksigen dan glukosa (OGD)
OGD dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya. Secara singkat,
iskemia diperkenalkan oleh pertukaran buffer ke larutan Hanks, yang
merupakan ischemic-mimetic solution (dalam mmol / L: 140 NaCl, 3,5 KCl,
0,43 KH2PO4, 1,25 MgSO4, 1,7 CaCl2, 5 NaHCO3, 20 HEPES, pH 7,3).
Larutan Hank yang disangga sebelumnya diberi gas dengan 95% N2/5%
CO2 selama 30 menit. Selanjutnya, media kultur ditempatkan di ruang
inkubator hipoksia (Billups-Robergberg) diseimbangkan dengan 95% N2 /
5% CO2 pada 37°C selama 1 jam. Kemudian media kultur sel digantikan
oleh media MEM dengan glukosa dan serum, di mana sel diinkubasi
selama 24 jam.
Uji viabilitas sel
Secara singkat, media kultur diubah menjadi media yang mengandung
0,5 g / L MTT dan diinkubasi selama 4 jam pada 37 ° C. Kemudian
supernantant dibuang, dan sel-sel dicampur secara menyeluruh dengan
dimethylsulfoxide (100lL / well). Ketika kristal dipecahkan, nilai absorbansi
kepadatan optik 10 di masing-masing kelompok diukur dengan pembaca
plat Elx800 pada 570 nm. Viabilitas sel berbanding lurus dengan nilai
absorbansi.

14
Pengukuran glutathione (GSH)
GSH jaringan spinal cord dan media kultur sel diukur dengan
spektrofotometri. GSH diukur dengan menambahkan standar atau sampel
ke 100 𝜇L campuran 1:1 dari tiga unit / mL GSH reduktase dengan
0,67mg/mL 5,5’ -dithiobs (2-nitrobenzoic acid). Reaksi dimulai dengan
penambahan 20𝜇L 0,67 mg/mL nicotinamide adenine dinucleotide
phosphate (NADP) berkurang dan peningkatan absorbansi pada 450 nm
dipantau. Nilai GSH dalam jaringan dinormalisasi untuk kandungan
protein. Semua pengukuran dilakukan dalam rangkap tiga.
Analisis statistik
Untuk semua analisis, individu yang melakukan analisis dibutakan oleh
kelompok studi. Semua data kuantitatif dinyatakan sebagai mean-standar
deviasi. Analisis statistik dilakukan dengan menggunakan SPSS Statistics
17.0 (SPSS, Chicago, IL). Signifikansi perbedaan antara sarana
diverifikasi oleh analisis varians (ANOVA) diikuti oleh uji Tukey. Untuk
analisis hasil jumlah sel, menggunakan ANOVA Kruskal-Wallis
nonparametrik, diikuti oleh uji Dunn. Signifikansi statistik ditempatkan
pada p <0,05.
Hasil
HBO-PC meningkatkan hasil neurologis dan edema sumsum tulang
belakang dalam model SCIR tikus
Semua tikus dengan 4 menit cedera SCIR menunjukkan defisit
neurologis fungsional setelah pemulihan dari anestesi. Selama periode
pengamatan 48 jam berikut, setelah fungsi hilang dengan cara progresif
ini, tidak ada hewan yang diamati untuk mendapatkan kembali fungsi
setelah 24 jam reperfusi. Pada 24 jam, 36 jam, 48 jam setelah cedera
SCIR, tikus yang diobati dengan HBO-PC secara signifikan
mempertahankan fungsi neurologis dibandingkan dengan kelompok SCIR
(Gambar 1A). Selain itu, kadar air spinal cord meningkat secara signifikan
pada 48 jam setelah cedera SCIR, tetapi HBO-PC sebelum oklusi aorta
meredakan edema spinal cord yang disebabkan oleh cedera SCIR
(Gambar 1B).

15
Gambar 1. Efek menguntungkan prekondisi oksigen hiperbarik (HBO-PC)
pada fungsi hindlimb dan kadar air spinal cord setelah cedera iskemia /
reperfusi spinal cord (SCIR). (A) Tidak ada defisit neurologis pada
kelompok Sham. Skor Basso secara signifikan lebih tinggi pada kelompok
HBO-PC + SCIR dibandingkan dengan kelompok SCIR tanpa HBO-PC
pada 24 jam, 36 jam, dan 48 jam setelah cross-clamping aorta (rata-rata
standar deviasi [SD], n = 6, * p <0,05 vs kelompok SCIR). (B) Kadar air
spinal cord secara signifikan lebih tinggi pada kelompok HBO + SCIR dan
kelompok SCIR pada 48 jam setelah cedera SCIR, tetapi itu jauh lebih
rendah pada kelompok HBO + SCIR dibandingkan dengan kelompok
SCIR (mean - SD, n = 6, ## p <0,01 vs grup Sham, ** p <0,01 vs grup
SCIR).
HBO-PC meningkatkan kelainan elektrofisiologis pada model SCIR
tikus
Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2, ada penelusuran
representatif MEP yang dilaporkan pada 1 minggu setelah perawatan
sham atau SCIR. Latensi MEP secara signifikan diperpanjang, dan
amplitudo MEP berkurang secara signifikan pada semua tikus dengan
cedera SCIR. HBO-PC, bagaimanapun, dapat menyebabkan peningkatan
yang signifikan pada kelainan elektrofisiologis.

16
HBO-PC memperlambat proses apoptosis pada sumsum tulang
belakang tikus dengan cedera SCIR
Pewarnaan TUNEL mengungkapkan bahwa proses apoptosis pada
spinal cord (dibuktikan dengan peningkatan sel TUNEL-positif) secara
signifikan berkurang oleh HBO-PC pada 24 jam sebelum oklusi aorta
(Gambar 3A). Selain itu, tingkat aktivitas caspase-9 dan caspase-3 di
spinal cord semua meningkat pada 1 minggu setelah cedera SCIR.
Setelah normalisasi dengan aktivitas pada tikus yang dioperasikan secara
palsu, aktivitas caspase-9 pada kelompok HBO-PC + SCIR lebih rendah
daripada aktivitas pada kelompok SCIR (Gbr. 3B). Demikian pula, aktivitas
caspase-3 darikelompok HBO-PC + SCIR lebih rendah dibandingkan
dengan kelompok SCIR (Gambar 3C).
HBO-PC menginduksi aktivasi Nrf2 dan pengaturan atas ekspresi
downstram gene Nrf2 pada spinal cord tikus
Untuk menentukan apakah HBO-PC menginduksi aktivasi Nrf2 sebelum
pemodelan eksperimental cedera SCIR, kami menganalisis tingkat mRNA
(Gambar 4A) dan protein (Gambar 4B) Nrf2 di sumsum tulang belakang.
Di 12 jam dan 24 jam setelah HBO-PC, mRNA Nrf2 dan kadar protein
sumsum tulang belakang tanpa cedera SCIR meningkat secara signifikan
dibandingkan dengan kelompok CON. Selain itu, aktivitas pengikatan DNA
Nrf2 nuklir meningkat secara signifikan pada 12 jam (8,22±1,1 kali lipat)
dan 24 jam (5,03±1,09 kali lipat) setelah HBO-PC (Gambar 4C).
downstream gene Nrf2, seperti GCL, 𝛾GT, dan MRP1, semuanya
merupakan kunci protein untuk sintesis dan transit GSH intraseluler, yang
tingkat ekspresi mRNA (Gambar 5A) dan protein (Gambar 5B) semuanya
meningkat secara signifikan pada jaringan sumsum tulang belakang. pada
12 jam dan 24 jam setelah satu HBO-PC.

17
Gambar 2. Peningkatan kondisi hiperbarik oksigen prekondisi (HBO-PC)
pada potensi motor-evoked (MEPs) setelah spinal cord
ischemia/reperfusion (SCIR). (A) Penelusuran representatif dari MEP yang
direkam dari tikus pada 1 minggu setelah palsu atau SCIR. (B) Latensi
MEP secara signifikan diperpanjang pada 1 minggu setelah cedera SCIR
dan lebih lama pada kelompok SCIR daripada kelompok HBO-PC + SCIR.
(C) Amplitudo MEP berkurang pada 1 minggu setelah cedera SCIR dan
lebih kecil pada kelompok SCIR daripada kelompok HBO-PC + SCIR
(rata-rata - standar deviasi, n = 4, ## p <0,01 vs kelompok Sham, ** p
<0,01 vs grup SCIR)
HBO-PC meningkatkan konten GSH dari SpinalCcord dengan cedera
SCIR
Selain perannya dalam detoksifikasi peroksida, GSH adalah
penyimpanan sistein utama dalam sel, fungsi utamanya adalah untuk
mempertahankan homeostasis redoks seluler. Dibandingkan dengan
kelompok Sham, konten GSH dari spinal cord menurun secara signifikan
pada semua titik waktu (12, 24, 36, 48 jam) setelah cedera SCIR
(Gambar. 6). Namun, konten GSH dari kelompok HBO-PC + SCIR jauh
lebih tinggi daripada kelompok SCIR. Hasil ini menunjukkan bahwa

18
kandungan GSH yang lebih tinggi yang diinduksi oleh HBO-PC memberi
lebih banyak kapasitas antioksidan pada spinal cord.
Nrf2 berlebih yang disebabkan oleh HBO-PC terutama terlokalisasi
dalam astrocytes spinal cord tikus
Untuk mengeksplorasi lokasi utama ekspresi Nrf2 yang diinduksi oleh
HBO-PC, pewarnaan imunofluoresensi ganda dilakukan. Bagian dari tikus
yang diobati dengan post-HBO 24 jam atau kontrol diwarnai untuk anti-
Nrf2 (hijau), penanda neuronal anti-NeuN (merah), dan penanda astrosit
anti-GFAP (merah). Seperti yang ditunjukkan Gambar 7, intensitas
fluoresensi hijau dari imunoreaktivitas Nrf2 adalah meningkat secara
signifikan pada astrocytes positif GFAP, dan hanya ada sedikit
peningkatan imunoreaktivitas Nrf2 di NeuN positive neuron. Oleh karena
itu, hasil ini menunjukkan bahwa Nrf2 berlebih yang diinduksi oleh HBO-
PC di spinal cord terutama terjadi pada astrocytes.

19
Gambar 3. Hyperbaric oxygen preconditioning (HBO-PC) memperlambat
proses apoptosis pada spinal cord ischemia/reperfusion (SCIR). (A)
Jumlah sel TUNEL-positif secara signifikan meningkat di spinal cord pada
1 minggu setelah cedera SCIR, dan HBO-PC secara signifikan
mengurangi peningkatan yang diinduksi SCIR dalam sel TUNEL-positif
(rata-rata standar deviasi [SD], n = 6, ## p <0,01 vs Grup sham, ** p <0,01
vs SCIR group). (B, C) Aktivitas enzimatik caspase-9 dan caspase-3 pada
1 minggu meningkat pada spinal cord tikus dengan cedera SCIR. Aktivitas
enzimatik caspase-9 atau caspase-3 pada 1 minggu setelah cedera SCIR,
bagaimanapun, secara signifikan berkurang pada kelompok HBO-PC +
SCIR dibandingkan dengan kelompok SCIR (mean-SD, n = 6, ## p <0,01
vs. grup Sham, ** p <0,01 vs grup SCIR).

Gambar 4. Prasyarat oksigen hiperbarik (HBO-PC) aktivasi nuclear factor

erythroid 2 berhubungan dengan factor 2 (Nrf2) pada spinal cord tikus
(rerata - standar deviasi, n = 6, ** p <0,01 vs kelompok CON). (A) Tingkat
mRNA Nrf2 dari spinal cord yang diukur dengan reaksi rantai polimerase
waktu nyata secara signifikan ditingkatkan pada 12 jam dan 24 jam
setelah HBO-PC tunggal. (B) Dengan menggunakan gen housekeeping 𝛽-
actin sebagai standar internal, ekspresi protein Nrf2 dari spinal cord juga
meningkat secara signifikan diukur dengan Western blot pada 12 jam dan
24 jam setelah HBO-PC tunggal. (C) Tambahkan 10 𝜇g ekstrak nuclear /
dari masing-masing kelompok tikus, aktivitas pengikatan DNA relatif dari
Nrf2 ditentukan menggunakan enzyme-liked immunosobenrt assay-based

20
kit. Aktivitas pengikatan DNA Nrf2 nuclear meningkat secara signifikan
pada 12 jam dan 24 jam setelah HBO-PC tunggal.
HBO-PC meningkatkan viabilitas sel neuron dalam kultur yang
diobati dengan OGD
Uji MTT digunakan untuk mengevaluasi viabilitas sel astrocyets primer
dan neuron yang diinduksi OGD dari spinal cord tikus. Seperti yang
ditunjukkan pada Gambar 8A, viabilitas sel astrocytes yang diinduksi OGD
dalam kultur bersama atau hanya kultur astrocytes tidak memiliki
perubahan signifikan dibandingkan dengan kelompok CON tanpa
pengobatan OGD. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 8B, viabilitas
sel neuron yang diinduksi OGD dalam kultur bersama atau hanya kultur
neuron menurun secara signifikan, tetapi viabilitas neuron kelompok HBO-
PC + OGD lebih tinggi dari pada kelompok OGD dalam kultur bersama.
Dengan demikian, HBO-PC secara signifikan meningkatkan viabilitas
neuronal dengan adanya astrocyets. Hasil ini menunjukkan bahwa HBO-
PC memberikan efek neuroprotektif yang signifikan pada kultur neuron
yang mengalami gangguan OGD. Selain itu, astrocyets dapat memainkan
peran penting dalam perlindungan saraf yang diinduksi HBO-PC.

21
Gambar 5. Hyperbaric oxygen preconditioning (HBO-PC) aktivasi nuclear
factor erythroid 2 berhubungan dengan factor 2 (Nrf2) ekspresi
downstream gene. (A) Tingkat ekspresi mRNA glutamate-cysteine ligase
(GCL), 𝛾-glutamiltransferase (𝛾GT), dan multidrug resistance protein 1
(MRP1) yang diukur dengan reaksi rantai polimerase secara signifikan
ditingkatkan pada 12 jam dan 24 jam setelah HBO-PC tunggal (** p <0,01
vs grup CON). (B) Dengan menggunakan gen housekeeping 𝛽-actin
sebagai standar internal, tingkat ekspresi protein dari GCL, 𝛾GT, dan
MRP1 dalam jaringan spinal cord yang diukur dengan Western blot juga
meningkat secara signifikan pada 12 jam dan 24 jam setelah HBO-PC
tunggal. (** p <0,01 vs grup CON).

22
Gambar 6. Hyperbaric oxygen preconditioning (HBO-PC) meningkatkan
kadar glutathione (GSH) dari spinal cord dengan spinal cord
ischemic/reperfusi (SCIR). Kandungan GSH spinal cord menurun secara
signifikan pada kelompok HBO-PC + SCIR dan SCIR pada 12, 24, 36, dan
48 jam setelah cedera SCIR. Dibandingkan dengan kelompok SCIR,
konten GSH dari sumsum tulang belakang dalam kelompok HBO-PC +
SCIR jauh lebih tinggi (rata-rata deviasi, n = 6, * p <0,05 atau ** p <0,01 vs
SCIR kelompok).
HBO-PC menginduksi aktivasi Nrf2 dalam astrocytes co-cultur
Untuk menentukan apakah HBO-PC menginduksi aktivasi Nrf2 dalam
kultur, kami mendeteksi tingkat mRNA, kandungan protein, dan aktivitas
pengikatan DNA Nrf2 dalam astrocyets dan neuron, masing-masing, pada
24 jam dan 24 jam setelah HBO-PC. Seperti yang ditunjukkan pada
Gambar 9, semua indikator yang terkait dengan aktivasi Nrf2 secara
signifikan meningkat dalam astrocyets kultur, tetapi tidak ada perubahan
signifikan dalam neuron sistem kultur bersama. Hasil ini menunjukkan
bahwa aktivasi Nrf2 yang diinduksi oleh HBO-PC dalam spinal cord
terutama terjadi pada astrocyets.

23
Gambar 7. Gambar representatif dari bagian spinal cords yang diwarnai
dengan aktivasi nuclear factor erythroid 2 berhubungan dengan factor 2
(Nrf2) dan astrocyte marker glial fibrillary acidic protein (GFAP) atau
neuronal marker anti-neuronal (NeuN) dengan pelabelan double-
immunofluotescence \. Skala bar = 20 𝜇m. Pada 24 jam setelah hyperbaric
oxygen preconditioning (HBO-PC), intensitas fluoresensi imunoreaktivitas
Nrf2 meningkat secara signifikan pada astrocyets positif GFAP, dan hanya
ada sedikit peningkatan imunoreaktivitas Nrf2 di neuron positif NeuN.

24
Gambar 8. Viabilitas sel astrosit primer dan neuron dari spinal cord
dievaluasi dengan uji MTT pada 24 jam setelah 60 menit pengobatan
oxygen-glucose deprivation (OGD). (A) Dalam co-cultur bersama atau
hanya kultur astrocyets, tidak ada pengurangan signifikan dalam
kelayakan astrocyets dari hyperbaric oxygen preconditioning (HBO-PC) +
kelompok OGD dan kelompok OGD dibandingkan dengan kelompok
CON. (B) Dalam kultur bersama atau hanya kultur neuron, viabilitas
neuron dari kelompok HBO-PC + OGD, secara signifikan lebih tinggi
daripada kelompok OGD dalam kultur bersama (## p <0,01 vs kelompok
OGD) .
HBO-PC menginduksi pengaturan ekspresi gen hilir Nrf2 dalam
astrosit kultur bersama
Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 10, HBO-PC juga secara
signifikan meningkatkan level mRNA dan ekspresi protein downrtream
gene Nrf2 (GCL, 𝛾GT, dan MRP1) dalam astrocyets, tetapi tidak dalam
neuron sistem kultur bersama. Hasil ini menunjukkan bahwa aktivasi Nrf2
dalam astrocyets dapat berkontribusi pada efek perlindungan saraf yang
disebabkan oleh HBO-PC.
HBO-PC meningkatkan konten GSH media kultur dengan astrocyets
setelah pengobatan OGD
Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 11, kadar GSH dalam medium
semua sistem kultur diukur dengan metode spektrofotometri pada 24 jam
setelah pengobatan OGD. Hanya dalam kultur neuron, level GSH sedang
dari HBO + OGD dan kelompok OGD menurun secara signifikan
dibandingkan dengan kelompok CON (## p <0,01 vs kelompok CON), dan
tidak ada perbedaan yang signifikan antara kelompok HBO + OGD dan

25
grup OGD. Hanya dalam kultur astrocyets atau kultur bersama, level GSH
sedang dari kelompok HBO + OGD jauh lebih tinggi daripada kelompok
OGD (** p <0,01 vs kelompok OGD). Dengan demikian, ketika dikultur di
hadapan astrocyets, HBO-PC meningkatkan konten GSH dari media
kultur setelah pengobatan OGD. Hasil ini lebih jauh menggambarkan
kemungkinan bahwa aktivasi Nrf2 dalam astrocyets dapat memainkan
peran penting dalam perlindungan saraf yang disebabkan oleh HBO-PC.
Diskusi
Pada bagian in vivo dari penelitian ini, kami menunjukkan bahwa HBO-
PC tunggal (2,5 ATA, 90 menit) memainkan peran neuroprotektif yang
signifikan terhadap cedera SCIR. HBO-PC secara signifikan
meningkatkan fungsi motor hindlimb yang hilang dan edema spinal cord
sekunder pada tahap akut setelah cedera SCIR. HBO-PC secara
signifikan memperbaiki reaktivitas MEP spinal cord dan menghambat atau
memperlambat proses apoptosis setelah cedera SCIR pada tahap
pemulihan setelah cedera SCIR.

Gambar 9. Hyperbaric oxygen preconditioning (HBO-PC) menginduksi

aktivasi faktor anti-nuklir erythroid 2 terkait faktor 2 (Nrf2) di astrocytes dari
kultur bersama. (A) Tingkat mRNA Nrf2 astrocytes yang diukur dengan
reaksi rantai polimerase waktu nyata secara signifikan ditingkatkan pada
24 jam setelah HBO-PC (** p <0,01 vs kelompok CON), tetapi tidak ada
perubahan neuron. (B) Menggunakan housekeeping gene 𝛽-actin sebagai
standar internal, ekspresi protein Nrf2 dari astrocytes yang diukur dengan
Western blot juga meningkat secara signifikan pada 24 jam setelah HBO-

26
PC (** p <0,01 vs kelompok CON), tetapi ada tidak ada perubahan
neuron. (C) Dengan menggunakan enzyme-liked immunosorbent assay-
based kit, aktivitas pengikatan DNA relatif dari Nrf2 nuklir secara signifikan
meningkat dalam astrocytes pada 24 jam setelah HBO-PC (** p <0,01 vs
grup CON), tetapi tidak ada perubahan dalam neuron.
Untuk mengeksplorasi mekanisme perlindungan saraf yang disebabkan
oleh HBO-PC, kami mengukur tingkat ekspresi mRNA dan protein Nrf2
dan gen-gen targetnya, seperti GCL, 𝛾GT, MRP1 (protein utama untuk
sintesis dan transit GSH intraseluler), yang semuanya ditingkatkan
padaspinal cord tikus normal setelah pemberian HBO-PC tunggal. Aktivasi
Nrf2 menganugerahkan perlindungan saraf dalam berbagai model
penyakit neurologis dengan regulasi beberapa downstream gene dengan
detoksifikasi, antioksidan, dan kapasitas antiinflamasi. Sudah pasti bahwa
ekspresi terkoordinasi gen-gen ini memainkan peran penting dalam
perlindungan sitoproteksi, tetapi satu kelompok enzim yang terlibat dalam
sintesis dan pemanfaatan GSH, seperti GCL, 𝛾GT, dan MRP1, sangat
penting untuk pencegahan kerusakan yang dimediasi oksidatif di CNS.

Gambar 10. Hyperbaric oxygen preconditioning (HBO-PC) menginduksi

aktivasi nuclear factor erythroid 2 berhubungan dengan factor 2 (Nrf2)
ekspresi downstream gene dalam astrocytes kultur bersama. (A) Tingkat
mRNA glutamate-cysteine ligase (GCL), 𝛾-glutamyltransferase (𝛾GT), dan
multidrug resistance protein 1 (MRP1) dalam astrocytes yang diukur
dengan reaksi rantai polimerase waktu nyata semuanya ditingkatkan
secara signifikan pada 24 jam setelah HBO -PC (** p <0,01 vs grup CON),
tetapi tidak ada perubahan neuron. (B) Menggunakan housekeeping gene

27
𝛽-actin sebagai standar internal, kadar protein GCL, 𝛾GT, dan MRP1 yang
diukur oleh Western blot secara signifikan meningkat dalam astrocyets
pada 24 jam setelah HBO-PC (** p <0,01 vs CON kelompok), tetapi tidak
ada perubahan pada neuron.
GSH adalah antioxidan paling banyak pada mamalia yang mengandung
thiol dan disintesis oleh dua langkah berturut-turut. Pada langkah
pertama, sintesis GSH adalah pembatas laju dan dikatalisis oleh GCL; di
yang kedua langkah, GSH dibentuk oleh ikatan 𝛾GC dengan glisin. Nrf2
juga mengatur ekspresi transporter pertukaran cysteine-glutamate, seperti
MRP1, yang mempertahankan kadar GSH intraseluler dengan mengatur
masuknya kista. 27-29 Dalam penelitian ini, seperti yang kami harapkan,
HBO-PC secara signifikan meningkatkan konten GSH dari spinal
cordjaringan pada semua titik waktu setelah cedera SCIR, yang
meningkatkan kapasitas antioksidan total.

Gamabar 11. Hyperbaric oxygen preconditioning (HBO-PC) meningkatkan

kadar glutathione (GSH) dari media kultur dengan astrocytes setelah
perawatan oxygen-glucose deprivation (OGD). Hanya dalam kultur
neuron, level GSH sedang dari HBO-PC + OGD dan kelompok OGD
menurun secara signifikan dibandingkan dengan kelompok CON ( ## p
<0,01 vs kelompok CON), dan tidak ada perbedaan yang signifikan antara
HBO-PC + Grup OGD dan grup OGD. Hanya dalam kultur astrocytes atau
kultur bersama, level GSH sedang dari kelompok HBO-PC + OGD jauh
lebih tinggi daripada kelompok OGD (** p <0,01 vs kelompok OGD).

28
 Temuan menunjukkan bahwa peningkatan aktivasi Nrf2 yang diinduksi
oleh HBO-PC di spinal cord memainkan peran penting dalam melindungi
tcedera SCIR. Selain itu, hasil pewarnaan double-immunoflurosence juga
menunjukkan bahwa Nrf2 berlebih yang disebabkan oleh HBO-PC
terutama terjadi pada astrocytes, yang dapat memberikan efek
menguntungkan terhadap cedera SCI berikutnya. Selain itu, kami
menemukan bahwa HBO-PC menginduksi peningkatan signifikan ekspresi
Nrf2 dalam astrocyets spinal cord dengan cara pewarnaan double-
immunoflurosence dengan mikroskop fluoresensi bidang lebar
konvensional daripada mikroskop fluoresensi confocal. Dibandingkan
dengan penelitian sebelumnya, kami tidak memberikan posisi Nrf2. Jadi
kami menyelidiki lebih lanjut aktivitas pengikatan DNA Nrf2 dan ekspresi
downstream gene di spinal cord belakang dengan HBO-PC, yang secara
tidak langsung memverifikasi peningkatan signifikan aktivitas transkripsi
Nrf2.
Dalam bagian in vitro dari penelitian ini, kami menunjukkan bahwa
HBO-PC tunggal (2,5 ATA, 90 menit) memainkan peran neuroprotektif
yang signifikan dalam sistem kultur (campuran neuron spinal neuron /
astrocyte) terhadap cedera OGD. Ekspresi mRNA dan protein Nrf2 dan
gen targetnya (GCL, 𝛾GT, MRP1), semuanya meningkat secara signifikan
dalam astrocyet, tetapi tidak pada neuron. CNS biasanya dilengkapi
dengan aktivitas antioksidan untuk mencegah kerusakan akibat mediasi
ROS yang tinggi, tetapi neuron mengekspresikannya pada aktivitas yang
sangat rendah. Oleh karena itu, sangat penting bahwa neuron bekerja
sama dengan astrocytes yang lain untuk siklus lengkap detoksifikasi ROS
dan perlindungan saraf.
Dalam penelitian kami, HBO-PC menginduksi sedikit peningkatan
mRNA Nrf2 dan kadar protein dalam neuron, tetapi tidak ada perbedaan
yang signifikan secara statistik. Jadi efek HBO-PC yang diinduksi dalam
pensinyalan Nrf2 terutama terjadi pada astrocytes, yang memberikan
perlindungan saraf terhadap ischemia-reperfusion injury. Karena cedera
spinal cord menginduksi stres oksidatif yang berkontribusi terhadap

29
perkembangan pathomechanisms cedera sekunder, aktivasi jalur Nrf2 /
ARE dapat mengurangi stres oksidatif yang mengarah pada perlindungan
saraf.
Banyak penelitian yang secara elegan menyoroti pentingnya astrocytic
Nrf2 untuk perlindungan saraf terhadap bioenergetik dan oksidatif
kerusakan akibat stres. Namun, masih belum jelas, apakah neuron
memerlukan perlindungan antioksidan astrocytes, meskipun sebagian
besar aktivasi Nrf2 tampaknya terjadi pada insulin. Selain itu, konsentrasi
GSH dari ko-kultur medium meningkat, yang terutama dilepaskan dari
astrocyets. Data ini konsisten dengan hasil percobaan in vivo, dengan
demikian lebih lanjut mendukung deduksi kami bahwa aktivasi Nrf2 dalam
astrosit dapat memediasi toleransi iskemik spinal cord yang disebabkan
oleh HBO-PC tunggal.
Sebagai sel-sel housekeeping utama dari sistem saraf, protein
memainkan peran integral dalam CNS dengan menyediakan intermediet
metabolik ke neuron, memodulasi aktivitas sinaptik, dan mengatur aliran
darah sebagai respons terhadap aktivitas neuronal. Selain itu, astrocyets
adalah sangat penting untuk fungsi saraf normal karena kemampuan
mereka untuk melepaskan faktor pelindung saraf. Faktor transkrip
mewakili aspek penting dari peristiwa seluler adaptif yang memungkinkan
adaptasi sel terhadap perubahan lingkungan dan memfasilitasi berbagai
ekspresi downstream gene spesifik. Nrf2 adalah faktor transkripsi integral
yang memfasilitasi proteksi saraf astrocytic dengan mempromosikan
ekspresi gen yang terlibat dalam sintesis GSH dan pelepasan dalam
astrocytes
Karena kami menggunakan protokol HBO-PC, protokol oksigen klinis
hiperbarik relatif singkat, dan pertahanan antioksidan internal cukup
sehingga tekanan biokimia bersifat reversibel. Dengan peningkatan ROS
yang diinduksi oleh HBO-PC, residu sistein kritis dalam Keap1 adalah
teroksidasi, Nrf2 dilepaskan, yang mempromosikan transkripsi nuklir dari
baterai enzim antioksidan. Gen target Nrf2 secara istimewa diaktifkan
dalam astrocyte, yang akibatnya memiliki detoksifikasi dan pertahanan

30
antioksidan yang lebih efisien daripada neuron. Ekspresi terkoordinasi dari
enzim-enzim ini, seperti GCL, MRP1, dan 𝛾GT, memungkinkan tingkat
biosintesis GSH yang lebih tinggi, melepaskan, dan pembelahan
ekstraseluler ke Cys-Gly. Kemudian neuron mengambil Cys-Gly dalam
bentuk sistein dan glisin. Lebih penting lagi, astrocyte memasok glutamin
ke neuron, di mana ia diubah menjadi glutamat.
Dengan demikian, biosintesis neuronal de novo dari GSH tergantung
pada pasokan prekursor GSH dari astrocyte. Memahami respons adaptif
yang dialami astrocyte sebagai respons terhadap stres akut atau kondisi
neurodegeneratif akan berkontribusi pada pengembangan terapi baru.
Temuan kami menunjukkan bahwa HBO-PC adalah protokol yang efektif
untuk mencegah cedera ischemia/reperfusi pada CNS.
Jelas bahwa aktivasi Nrf2 mewakili mekanisme pertahanan yang luar
biasa untuk banyak tipe sel. Khususnya di CNS, aktivasi Nrf2 astrocytic
memiliki peran utama dalam melindungi neuron dari rangsangan
berbahaya. Dalam penelitian kami, kami mencoba memverifikasi
kemungkinan bahwa aktivasi Nrf2 dalam astrocyte dapat memediasi
toleransi iskemik spinal cord yang disebabkan oleh satu episode HBO-PC.
Oleh karena itu, HBO-PC memiliki potensi sebagai metode yang aman
dan layak untuk memberikan manfaat perlindungan saraf dalam operasi
aorta. Di masa depan, kami akan mengembangkan alat eksperimental
untuk memanipulasi dan memantau perubahan dinamis dalam fungsi
pendukung astrosit untuk menentukan peran mereka dalam perlindungan
saraf yang disebabkan oleh HBO-PC.
Penelitian ini memang memiliki keterbatasan. Kami tidak dapat
menentukan bahwa efek neuroprotektif HBO-PC in vivo sepenuhnya
disebabkan oleh aktivasi Nrf2 pada astrocyte, sampai batas tertentu, yang
mungkin berasal dari populasi sel glial lainnya. Studi selanjutnya akan
lebih menjelaskan hubungan yang tepat antara aktivasi Nrf2 dan
perlindungan yang diinduksi HBO-PC. Kami tidak dapat menemukan
metode untuk secara spesifik menghambat aktivasi Nrf2 astrocytic, tetapi
kami dapat meningkatkan desain eksperimental kultur sel. Sebagai

31
contoh, jenis sel co-culture harus ditambahkan, seperti populasi sel glial
lainnya, dan sumber sel harus dipertimbangkan untuk menggunakan
knockout tikus Nrf2. Melalui kombinasi kultur bersama yang berbeda, akan
lebih dekat dengan mekanisme yang tepat yang mendasari perlindungan
yang diinduksi HBO-PC dalam model SCIR.
Pengakuan
Pekerjaan ini didukung oleh dana dari National Natural Science Science
China (No. 81171873) dan Yayasan Pemuda Universitas Kedokteran
Militer Kedua (No. 2010QN08).
Pernyataan Pengungkapan Penulis
Tidak ada kepentingan finansial yang bersaing.

32
 DAFTAR PUSTAKA
Xu, J., Huang, G., Zhang, K., Sun, J., Xu, T., Li, R., ... & Xu, W. (2014).
Nrf2 activation in astrocytes contributes to spinal cord ischemic
tolerance induced by hyperbaric oxygen preconditioning. Journal of
neurotrauma, 31(15), 1343-13

33
1