EUGR pada Bayi Preterm : Pola Pertumbuhan, Nutrisi dan Penanda

Epigenetik. Sebuah Studi Pilot.

Maria Giulia Tozzi1, Francesca Moscuzza1, Angela Michelucci2, Francesca

Lorenzoni1, Cinzia Cosini2, Massimiliano Ciantelli1, dan Paolo Ghirri1*

1
Divisi Neonatologi dan NICU, Bagian Kedokteran Klinis dan Eksperimental, Pisa,
Italy

2
Laboratorium Genetika Molekular, Universitas Rumah Sakit Pisa, Pisa, Italy

Latar Belakang / Tujuan : Pembatasan Pertumbuhan IntraUterine (IUGR) dan

ExtraUterine (EUGR) dapat menyebabkan mekanisme pemrograman ulang, dengan
tujuan untuk bertahan hidup sebelum dan sesudah kelahiran. Faktor gizi dan faktor
lingkungan lainnya dapat mengatur ekspresi gen melalui modifikasi epigenetik, tetapi
mekanisme molekuler yang terlibat belum dimengerti. Mekanisme epigenetik dapat
dianggap sebagai jembatan antara rangsangan lingkungan dan fenotipe yang
diperoleh selama kehidupan intrauterin dan minggu-minggu pertama kehidupan.
Tujuan kami adalah untuk menyelidiki hubungan antara pola pertumbuhan,
determinan gizi, dan jalur epigenetik.

Metode: Kami mendaftarkan 38 bayi baru lahir yang dirawat di Neonatal Intensive
Care Unit (NICU) di Rumah Sakit Universitas Pisa. Usia kehamilan saat lahir adalah
<34 minggu dan usia pasca-menstruasi (PMA) adalah 36-42 minggu pada saat
dipulangkan. Kami mengecualikan bayi dengan malformasi atau sindrom klinis.
EUGR didefinisikan sebagai pengurangan skor z berat badan >1SD antara kelahiran
dan pemulangan. Kami juga mengevaluasi metilasi DNA dari Imprinting Center 1
(IC1) saat lahir dan saat pemulangan.
Hasil: Kami mengamati penurunan berat badan dan lingkar kepala dalam SD selama
minggu-minggu pertama kehidupan. Kami menemukan korelasi antara EUGR untuk
berat dan lingkar kepala dan peningkatan metilasi IC1 (p = 0,018 dan p = 0,0028,
masing-masing). Kami mengamati hubungan antara pengurangan protein dan asupan
lipid dan IC1 hypermethylation (p = 0,009 dan p = 0,043, masing-masing).

Kesimpulan: Hipermetilasi IC1 dapat merupakan mekanisme pemrograman ulang

untuk mengejar ketinggalan pertumbuhan, melalui peningkatan ekspresi Insulin-like
growth factor 2 (IGF2) yang mungkin memiliki efek potensial pada homeostasis
metabolik di kemudian hari.

Kata kunci: pembatasan pertumbuhan ekstrauterin, pola pertumbuhan, nutrisi,

metilasi IC1, epigenetik

PENDAHULUAN

Pembatasan pertumbuhan ekstrauterin masih merupakan masalah serius pada

bayi prematur dengan berat lahir sangat rendah(VLBW), karena peningkatan bertahap
dalam perawatan intensif neonatal telah memungkinkan kelangsungan hidup bayi
baru lahir dengan semakin banyaknya bayi prematur berat badan rendah dan
kebutuhan nutrisi yang optimal (1,2). Pada bayi VLBW telah diusulkan nutrisi
"agresif", untuk mencapai pertumbuhan semirip mungkin dengan janin dengan usia
kehamilan yang sama. Nutrisi adekuat selama hari-hari pertama sangat penting untuk
memastikan pertumbuhan janin yang sesuai, dalam hal pencapaian paramete
pertumbuhan dan perkembangan, dikoreksi sesuai usia kehamilan dan perkembangan
saraf (4,5). Walau banyak usaha dalam memperbaiki nutrisi neonatal pada bayi
VLBW, banyak dari mereka tidak mendapat nutrisi adekuat sesuai peningkatan
kebutuhannya, menyebabkan adanya hambatan pertumbuhan (2).
 Dalam beberapa studi, EUGR didefinisikan sebagai parameter pertumbuhan
(berat badan, panjang badan, dan lingkar kepala) ≤persentil 10 (z score <-1.28) untuk
usia post menstruasi (PMA) saat pemulangan (6). Namun lebih tepat untuk
mempertimbangkan EUGR sebagai pengurangan skor z berat > 1 SD antara lahir dan
pulang (7, 8). EUGR dapat terjadi baik pada bayi kecil untuk usia kehamilan (SGA),
dan bayi sesuai usia kehamilan (AGA). Namun, EUGR dari bayi baru lahir prematur
VLBW terjadi di "jendela" yang sama dengan IUGR bayi baru lahir aterm (10). Bayi
yang sangat prematur terpapar lingkungan ekstrauterin dalam suatu periode yang
biasanya ditandai dengan pertumbuhan intrauterin yang cepat. Pergeseran nyata
dalam pengeluaran energi diperlukan untuk bertahan hidup bayi prematur di dalam
kehidupan tidak terduga postnatal(11).

Faktor gizi dan faktor lingkungan lainnya bisa mengatur ekspresi gen melalui
modifikasi epigenetik (12–14), tetapi mekanisme molekuler yang terlibat belum
dimengerti. Mekanisme epigenetik dapat dipertimbangkan sebagai jembatan antara
rangsangan lingkungan dan fenotip diperoleh selama kehidupan intrauterin dan
minggu pertama kehidupan (15). Metilasi DNA adalah komponen kunci dari
terbentuknya epigenetik. Nnutrisi mungkin memodifikasi pola metilasi DNA (16, 17).
Satu dari mekanisme terpenting dengan kontrol epigenetik adalah pencetakan genom.
Wilayah utama, yang terlibat dalam kontrol pertumbuhan dan perkembangan, terletak
di kromosom 11 pada p15.Di situ terdapat IC1, regio kontrol pencetakan atau
imprinting center (IC), yang mengatur ekspresi gen IGF2, gen stimulator
pertumbuhan yang penting, dan H19, gen dengan fungsi yang tidak diketahui (18).
Perubahan dari mekanisme pencetakan pada titik ini dapat menyebabkan fenotipe
pertumbuhan berubah(19, 20) seperti yang diamati dalam Sindrom Beckwith-
Wiedemann, di mana hipermetilasi IC1 menentukan pertumbuhan berlebih (21), dan
di Sindrom Silver Russell, di mana hipermetilasi IC1 menyebabkan pembatasan
pertumbuhan (22, 23).
 Obesitas dan penyakit metabolik selanjutnya pada remaja dan dewasa telah
dikaitkan dengan kejadian intrauterin yang merugikan yang disebut "Asal
Perkembangan Kesehatan dan Penyakit(DOHaD) ”(24), bahkan jika mekanisme yang
mendasarinya tidak dipahami dengan baik (23). Studi tentang Dutch Hunger
Winter(25) telah menunjukkan bahwa janin yang mengalami malnutrisi selama
trimester pertama kehamilan, memiliki risiko komplikasi kardiovaskular lebih tinggi,
termasuk profil lipid pro-aterogenik dan berkurangnya fungsi kognitif. Sedangkan
janin yang kelaparan pada akhir kehamilan memiliki risiko lebih tinggi intoleransi
glukosa pada usia dewasa (15). Heijmans et al. (26) baru-baru ini telah menunjukkan
kemungkinan hubungan antara Kohort Belanda dan dan penanda epigenetik. Mereka
telah menemukan individu yang secara prenatally terkena kelaparan selama
Kelaparan Musim Dingin Belanda tahun 1944-1945, 6 dekade kemudian terjadi
pengurangan metilasi gen yang dicetak IGF2, mengarah ke ekspresi berlebih dari
IGF2, dibandingkan dengan saudara kandung sesama jenis kelamin, namun tidak
terpapar kelaparan(15, 26).

Ekspresi berlebihan IGF2 juga disebabkan oleh hipermetilasi regio kontrol

pencetakan IC1. Sebuah studi penting mengenai metilasi DNA IGF2 / H19 IC1 dalam
model manusia dilakukan oleh Huang et al. (23). Mereka menunjukkan bahwa
metilasi DNA IGF2 / H19 IC1 yang lebih besar, menyebabkan overekspresi IGF2,
dikaitkan dengan lemak subkutan yang lebih tebal pada remaja berusia 17 tahun (23).

Metilasi DNA IGF2 / H19 IC1 tidak terkait dengan berat badan, panjang atau lingkar
kepala saat lahir, tetapi secara negatif terkait dengan HC antara 1 dan 10 tahun (23).
Menariknya, pasien dengan sindrom Silver Russell dan penurunan ekspresi IGF2
memiliki kekurangan lemak subkutan yang mencolok sebagai bagian dari fenotip
klinis mereka (23).

Studi lain menggarisbawahi hubungan antara metilasi DNA IGF2 / H19 IC1
dan pengembangan kelebihan berat badan / obesitas. St Pierre et al. (27)
menunjukkan bahwa ekspresi berlebih IGF2 pada DNA plasenta dikaitkan dengan
pemrograman metabolik obesitas onset lambat di janin (27). Perkins et al. (28)
berhipotesis bahwa mekanisme epigenetik dapat mendorong obesitas pada anak usia
dini, menunjukkan metilasi DNA IGF2 / H19 IC1 yang lebih besar pada anak berusia
1 tahun yang kelebihan berat badan atau obesitas dibandingkan dengan berat normal
(28).

Tujuan dari penelitian kami adalah untuk menyelidiki hubungan antara pola
pertumbuhan, determinan gizi, dan mekanisme epigenetik.

BAHAN DAN METODE

Kami mendaftarkan 38 bayi baru lahir yang dirawat di NICU Universitas

Rumah Sakit Pisa, Italia dari Januari 2016 hingga Juli 2016. Kriteria inklusi adalah:
usia kehamilan (GA) saat lahir <34 minggu dan usia postmenstrual (PMA) antara 36
dan 42 minggu pada saat dipulangkan. Kami mengeksklusikan bayi dengan kelainan
bawaan atau sindrom klinis.

Kami mencatat beberapa variabel yang dikategorikan sebagai faktor prenatal,

neonatal, auksologis, nutrisi, dan epigenetik (Tabel 1).

Di antara faktor prenatal, kami mempertimbangkan skor-z berat dan lingkar

kepala saat lahir, selama tinggal di rumah sakit dan saat pemulangan, menggunakan
grafik pertumbuhan Fenton 2013 untuk bayi prematur (29) Penggunaan skor z dan
SD yang tepat memungkinkan penilaian optimal pertumbuhan bayi. Untuk setiap bayi
dalam populasi penelitian, skor-z berat badan dan lingkar kepala dihitung
menggunakan tabel LMS (Lambda untuk kemiringan , Mu untuk median, dan Sigma
untuk koefisien variasi umum), yang diterbitkan oleh Fenton dan Sauve (30). Skor-z
(Skor Standar Deviasi) = (X–U) / SD, dimana X adalah nilai individual, U
menunjukkan nilai rata-rata dan SD menunjukkan standar deviasi (31). SGA (kecil
untuk kehamilan) didefinisikan sebagai nilai antropometrik <−1.28 SD (<persentil ke-
10), merujuk data auxologis SD atau skor-z. EUGR didefinisikan sebagai
pengurangan z-skor > 1 SD (EUGR parah> 2 SD) dalam parameter antropometrik
antara kelahiran dan pemeriksaan lainnya yang diambil selama tinggal di rumah sakit
(7, 8).

Pemberian makan secara parenteral dan enteral dievaluasi setiap hari seperti
jumlah cairan (ml / kg / hari), makronutrien (g / kg / hari), unsur makro (mg atau mEq
/ kg / hari) yang diasumsikan pada bayi baru lahir. Pemberian infus lain (mis., NaCl
0.9% atau D5%) dimasukkan sebagai asupan cairan harian.

Analisis epigenetik dilakukan pada sampel darah perifer dalam EDTA,

dikumpulkan dalam dua titik waktu yang berbeda saat lahir dan saat pulang). Semua
evaluasi yang kami lakukan adalah bagian dari perawatan normal yang diberikan
kepada bayi prematur. Pada evaluasi metilasi IC1 kami menggunakan sejumlah kecil
sampel, sisa darah setelah hitung jenis darah dan / atau uji silang. Ekstraksi DNA
dilakukan dengan menggunakan QIAsymphony (Qiagen, Hilden, Germany). Tingkat
metilasi dievaluasi melalui methylation-specific multiplex ligationdependent probe
amplification ( (MS-MLPA) pada satu ICR di 11p15. MS-MLPA dilakukan pada DNA
genom dengan kit SALSA MS-MLPA ME030-c3 (MRCHolland, Amsterdam,
Belanda).

Analisis statistik dilakukan dengan menggunakan STATA 12 (Perusahaan

Stata, TX, USA). Distribusi data diuji dengan tes Shapiro-Wilk. Perbandingan antar
kelompok dibuat dengan Student’s t-test untuk variabel kontinu dan dengan Odds
Ratio (OR) untuk variabel kualitatif. Data dengan distribusi miring dianalisis dengan
uji parametrik (uji Mann-Whitney). Korelasi antara dua variabel kontinu dievaluasi
dengan regresi linier dan plot pencar. Nilai p <0,05 dianggap signifikan secara
statistik. Informed consent dikumpulkan dari orang tua neonatus untuk analisis data
dan pemeriksaan darah.

Tabel 1. Analisis variabel

Faktor Prenatal Kehamilan (tunggal, multipel, pertama
atau berikutnya)
Adanya komplikasi kehamilan seperti
solusio plasenta, PROM, pre-eklampsia /
eklampsia, diabetes gestasional.
Persalinan (spontan, SC)
IUGR
Steroid antenatal
Faktor neonatal Jenis kelamin
Usia kehamilan
SGA untuk berat dan lingkar kepala
Komplikasi kelahiran preterm : anemia,
IVH, PDA yang memerlukan terapi,
sepsis, NEC, gagal napas (dengan
ventilasi mekanik beberapa hari), BPD,
ROP, Hipotensi
Steroid postnatal
Faktor Auksologikal Parameter auksologikal (berat, panjang,
dan lingkar kepala) saat lahir dan
pemulangan.
Berat badan ketika usia 28 hari (skor z)
Berat badan ketika usia post menstrual 36
minggu (skor z)
Penurunan berat badan (%)
Waktu untuk kembali ke berat lahir
EUGR untuk berat (EUGRw) dan lingkar
kepala (EUGRhc)
Faktor Nutrisi Hari mendapat nutrisi parenteral
Waktu mencapai makanan enteral penuh
Jenis susu (ASI, campuran, formula)
Konsentrasi makronutrien di makanan
parenteral dan enteral selama 1 minggu
kehidupan
Faktor Epigenetik Tingkat metilasi pada IC1 pada saat
kelahiran dan saat pulang
HASIL

Kami mengamati penurunan berat badan dan lingkar kepala dalam SD

terutama selama 28 hari pertama kehidupan. Dari 1 bulan kehidupan hingga
pemulangan, skor-z tetap hampir tidak berubah, kecuali beberapa kasus (Gambar 1,
2).

Pada pemulangan kejadian EUGR untuk berat (w) adalah 71%, dan kejadian
EUGR untuk lingkar kepala (hc) adalah 50%. Di antara bayi EUGR ini, kami
mengamati bahwa 30% menunjukkan EUGR> 2 SD untuk berat dan 37% EUGR> 2
SD untuk lingkar kepala (Gambar 3, 4).

Gambar 1. Tren z-score berat badan selama perawatan di RS

Gambar 2. Tren z-score lingkar kepala selama perawatan di RS

Gambar 3. Insidensi global EUGRw selama perawatan di RS

Gambar 4. Insidensi global EUGRhc selama perawatan di RS

 Di antara faktor-faktor prenatal dan neonatal yang dipertimbangkan, kami
mengamati bahwa beberapa faktor (preeklampsia, eklampsia, anemia, PDA, BPD,
ROP, penggunaan steroid antenatal, dan postnatal) lebih banyak sering dikaitkan
dengan EUGRw, walau perbedaannya tidak signifikan (Tabel 2). Semua kasus
dengan IUGR dan / atau SGA menjadi EUGRw saat pemulangan (Tabel 2).

Tabel 2. Karakteristik pasien dan distribusi variabel, prediksi hambatan penambahan

berat saat pemulangan

Variabel klinis Insiden global EUGRw Bukan Nilai p

EUGRw
FAKTOR PRENATAL n(%)
Jenis kelamin (Laki- 16 (42%) OR 1.4 12 4 0.46
Laki)
SC 32 (84%) OR 0.44 22 10 0.42
Kehamilan pertama 28 (73,7%) OR 0.52 19 9 0.38
Preeklampsia / 11 (28,9%) OR 2.25 9 2 0.30
Eklampsia
DM Gestasional 7 (18,4%) OR 2.8 6 1 0.33
IUGR 4 (10,5%) 4 0
Steroid antenatal 32 (84%) OR 3 24 8 0.22
FAKTOR NEONATAL
Usia gestasional (rata- 29 ± 2 t-test 29.4 ± 28.6 ± 0.31
rata dalam minggu) 0.43 0.60
SGA untuk berat badan- 10 (26.3%) 10 0
n(%)
SGA untuk lingkar 6 (15.8%) OR 2.27 5 1 0.43
kepala-n(%)
Anemia-n(%) 32 (84%) OR 1.27 23 9 0.5
Transfusi-n(%) 22 (57.9%) OR 3.5 18 4 0.08
PDA-n(%) 8 (21%) OR 3.5 7 1 0.24
Sepsis-n(%) 2 (5.7%) 2 0
NEC-n(%) 0
VMI (rata-rata hari) 2±4
NIVM (rata-rata hari) 19 ± 16.2
BPD-n(%) 4 (10.5%) 4 0
ROP-n(%) 5 (13.2%) 4 1
Hipotensi dengan 5 (13.2%) 4 1
kebutuhan dopamin-
n(%)
Kortikosteroid postnatal- 10 (26.3%) OR 1.89 8 2 0.38
n(%)
FAKTOR AUKSOLOGIS
Berat badan lahir, BW 1159 ± 358.4 t-test 1157 ± 1166 ± 0.94
(g) 76 80
Panjang badan lahir (cm) 37.07 ± 3.51 t-test 37.2 ± 36.6 ± 0.63
0.74 0.80
Lingkar kepala lahir 26.95 ± 2.45 t-test 27.03 ± 26.72 ± 0.73
(cm) 0.50 0.63
Berat badan terendah (g) 976.7 ± 310.4 t-test 968.4 ± 997.8 ± 0.79
64 80
Hari ke berat badan 4.0 ± 1.62 t-test 4.40 ± 4.63 ± 0.69
terendah (rata-rata) 0.32 0.47
Hari kembali ke BW 15.0 ± 4.4 t-test 14.7 ± 14.0 ± 0.70
lahir (rata-rata) 0.87 1.3
Berat badan saat pulang 2407 ± 455.1 t-test 2291.5 ± 2690 ± 0.01
(g) 88 93
Panjang badan saat 45.5 ± 2.6 t-test 45 ± 46.6 ± 0.08
pulang (cm) 0.51 0.67
Lingkar kepala saat 32.6 ± 1.7 t-test 32.3 ± 33.5 ± 0.04*
pulang (cm) 0.34 0.37
EUGRhc n(%) 19 (50%) OR 20 18 1 0.001*
Nilai p signifikan <0.05

Faktor Nutrisi dan EUGR

Di antara semua faktor gizi yang dipertimbangkan (Tabel 3), analisis median pasokan
gizi tunggal pada minggu pertama kehidupan menunjukkan bahwa asupan protein
yang lebih besar mengurangi risiko EUGRw. T-test menunjukkan bahwa bayi dengan
EUGRw telah menerima asupan protein lebih rendah dibandingkan bayi baru lahir
tanpa EUGRw (EUGRw 2.56 ± 0,05 g / kg / hari vs bukan EUGRw 2,86 ± 0,06 g / kg
/ hari ∗ p = 0,005). Selain itu, asupan lemak yang rendah juga berperan penting dalam
pembatasan pertumbuhan pascanatal (t-test : EUGRw 2,03 ± 0,06 g / kg / hari vs.
bukan EUGRw 2,38 ± 0,09 g / kg / hari ∗ p = 0,005). Perbedaan asupan protein dan
lipid telah diamati secara retrospektif dan hal ini disebabkan oleh keparahan kondisi
klinis yang berbeda.

Tabel 3. Faktor Nutrisi, Prediktor hambatan pertumbuhan berat dan lingkar kepala
saat pemulangan.

Variabel klinis Insiden global EUGRw Bukan Nilai p

EUGRw
FAKTOR NUTRISI dan EUGRw
Hari mendapat nutrisi 21.0 ± 8.52 t-test 21.66 ± 19.3 ± 0.44
parenteral (rata-rata) 1.4 3.4
Waktu untuk mencapai 24 ± 9.8 t-test 25 ± 1.5 23 ± 3.9 0.57
makanan enteral penuh
(rata-rata)
ASI n(%) 10 (26,3%) OR 1.89 8 2 0.38
Susu formula n(%) 9 (23,7%) OR 0.2 4 5 0.058
Susu campuran n(%) 19 (50%) OR 2.18 15 4 0.23
Rata-rata intake kalori 67.94 ± 5.83 t-test 66.3 ± 71.3 ± 0.005*
total dalam minggu 1.1 1.3
pertama kehidupan
(Kcal/kg/hari)
Intake total gula dalam 9.44 ± 0.74 t-test 9.37 ± 9.6 ± 0.39
minggu pertama 0.16 0.13
kehidupan (g/kg/hari)
Intake total lemak dalam 2.13 ± 0.36 t-test 2.03 ± 2.38 ± 0.005*
minggu pertama 0.06 0.09
kehidupan (g/kg/hari)
Intake total protein 2.65 ± 0.30 t-test 2.56 ± 2.86 ± 0.005*
dalam minggu pertama 0.05 0.06
kehidupan (g/kg/hari)
FAKTOR NUTRISI dan EUHRhc
Hari mendapat nutrisi 21.0 ± 8.52 t-test 21.9 ± 20.1 ± 0.51
parenteral (rata-rata) 1.8 2.1
Waktu untuk mencapai 24 ± 9.8 t-test 25.3 ± 2 23.5 ± 0.57
makanan enteral penuh 2.5
(rata-rata)
ASI n(%) 10 (26,3%) OR 3.1 7 3 0.13
Susu formula n(%) 9 (23,7%) OR 0.4 3 6 0.22
Susu campuran n(%) 19 (50%) OR 0.81 9 10 0.5
Rata-rata intake kalori 67.94 ± 5.83 t-test 67.4 ± 68.4 ± 0.60
total dalam minggu 1.15 1.5
pertama kehidupan
(Kcal/kg/hari)
Intake total gula dalam 9.44 ± 0.74 t-test 9.5 ± 9.37 ± 0.56
minggu pertama 0.17 0.17
kehidupan (g/kg/hari)
Intake total lemak dalam 2.13 ± 0.36 t-test 2.08 ± 2.17 ± 0.41
minggu pertama 0.7 0.9
kehidupan (g/kg/hari)
Intake total protein 2.65 ± 0.30 t-test 2.58 ± 2.72 ± 0.14
dalam minggu pertama 0.06 0.07
kehidupan (g/kg/hari)
Nilai p signifikan <0.05

ICR Metilasi DNA dan Faktor Nutrisi

Di antara semua faktor gizi yang dipertimbangkan (Tabel 4), kami mengamati
korelasi negatif yang lemah antara tingkat metilasi IC1 pada pemulangan dan asupan
protein dan lipid pada minggu pertama kehidupan (Coef −0,06 [95% CI −0,11 hingga
−0,02] ∗ p = 0,009; r2 0,17; Coef −0.05 [95% CI −0.09 to −0.001] ∗p = 0.043; r2 0.11,
masing-masing; Gambar 5,6). Data ini harus dievaluasi pada seri kasus lebih besar.

Tabel 4. Faktor Nutrisi dan Metilasi IC1 saat pemulangan

Regresi IC1 dengan : Koefisien 95% CI Nilai p

Total cairan / kg -0.001 -0.003 hingga 0.0004 0.13
Total kalori -0.0008 -0.004 hingga 0.002 0.55
Kalori parenteral -0.002 -0.005 hingga 0.0006 0.12
Klaori enteral 0.001 -0.001 hingga 0.003 0.37
Kalori / Protein 0.01 0.04 hingga 0.02 0.004*
Total glukosa 0.013 -0.009 hingga 0.03 0.22
Glukosa parenteral 0.006 -0.02 hingga 0.03 0.59
Glukosa enteral 0.01 -0.13 hingga 0.03 0.38
Total protein -0.06 -0.11 hingga -0.012 0.017*
Protein parenteral -0.06 -0.11 hingga -0.02 0.009*
Protein enteral 0.06 -0.06 hingga 0.17 0.34
Total lipid -0.03 -0.07 hingga 0.02 0.225
Lipid parenteral -0.05 -0.09 hingga -0.001 0.043*
Lipid enteral 0.01 -0.02 hingga 0.06 0.37
Nilai p signifikan <0.05

Gambar 5. Korelasi antara metilasi IC1 saat pemulangan dan intake protein
(g/kg/hari; p=0.009; r2 = 0.17)
 Gambar 6. Korelasi antara metilasi IC1 saat pemulangan dan intake lipid (g/kg/hari;
p=0.043; r2 = 0.11)

ICR Metilasi DNA dan Parameter Auksologikal

Mengenai analisis epigenetik kami mempertimbangkan korelasi antara

metilasi DNA IC1 dan berat dan lingkar kepala saat lahir dan kami tidak menemukan
korelasi signifikan.

Pada evaluasi tingkat metilasi antara kelahiran dan kepulangan,kami

mengamati tren yang dinamis. Metilasi IC1 meningkat saat pemulangan, setidaknya
5% dari nilai kelahiran, ditemukan di 47,3% dari kasus. Kami telah meneliti
hubungan hipermetilasi IC1 dengan pola pertumbuhan, dengan Fisher’s exact
test,dan kami telah menemukan korelasi signifikan. Sebagian besar pasien dengan
EUGRw dan EUGRhc menunjukkan peningkatan metilasi IC1 (> 5%) sejak lahir
hingga pemulangan (p = 0,018 dan p = 0,0028, masing-masing), dibandingkan bayi
baru lahir tanpa EUGR.
DISKUSI

Kami mengamati peningkatan insiden EUGR untuk berat badan (EUGRw =

71%) dan EUGR untuk lingkar kepala (EUGRhc = 50%).

Pengukuran berat badan dan lingkar kepala bayi mingguan (29), dapat
dilakukan untuk mengamati bahwa penurunan terbesar dalam skor-z terjadi dalam 28
hari pertama kehidupan dan sebagian besar bayi baru lahir EUGR saat dipulangkan
sudah menunjukkan pembatasan pertumbuhan ekstrauterin pada bulan pertama
kehidupan (Gambar 3, 4). Aspek penting lain yang harus dinilai adalah pada periode
berikutnya, antara 28 hari dan 36 minggu, skor z berat badan tidak berkurang lebih
lanjut, kecuali dalam kasus yang jarang terjadi. Selanjutnya, mulai dari 36 minggu
pengejaran pertumbuhan lebih banyak terbukti dalam banyak kasus.

Nutrisi yang tepat diketahui sangat penting dalam mempromosikan

pertumbuhan dan bisa menjadi sangat penting untuk perbaikan pertumbuhan postnatal
(32-37). Dalam penelitian kami, kami mengkonfirmasi bahwa asupan protein dan
lipid yang rendah memiliki dampak yang luar biasa pada pembatasan pertumbuhan
postnatal (38).

Efek nutrisi pada pertumbuhan neonatal dapat dikaitkan dengan mekanisme

epigenetik seperti yang kami amati dalam data kami tentang korelasi antara metilasi
dan protein dan asupan lipid. Beberapa penulis menggarisbawahi hubungan antara
berkurangnya asupan protein dan metilasi DNA (39-41). Gong et al. (41) menemukan
bahwa metilasi DNA IC1 meningkat secara signifikan mengikuti diet rendah protein
ibu dalam kelompok kohort Tikus Sprague-Dawley (41). Heijmans dan rekannya
telah menunjukkan hubungan yang mungkin antara Cohort Belanda dan penanda
epigenetik (26). Mereka menemukan bahwa orang dewasa, yang menderita kelaparan
selama kehidupan intrauterin, memiliki peningkatan ekspresi IGF2 bila dibandingkan
dengan kontrol yang cocok dan memiliki risiko komplikasi kardiovaskular lebih
tinggi, termasuk profil lipid pro-aterogenik, fungsi kognitif berkurang, dan juga risiko
lebih tinggi intoleransi glukosa pada usia dewasa (26).

Kami hanya menemukan hubungan lemah negatif antara asupan protein dan
lipid dan metilasi IC1. Data ini seharusnya dievaluasi pada seri kasus yang lebih
besar (38).

Mengenai hasil analisis epigenetik dan parameter auksologis, studi Huang

menunjukkan bahwa metilasi DNA IC1 IGF2 / H19 lebih besar dikaitkan dengan
lemak subkutan yang lebih besar (23). Kedua, metilasi DNA IGF2 / H19 IC1 tidak
terkait dengan berat lahir, panjang lahir atau lingkar kepala, tetapi terkait negatif
dengan HC antara 1 dan 10 tahun dan mereka berhipotesis bahwa HC mungkin
merupakan penanda awal yang lebih sensitif dari pemrograman axis IGF dan fisiologi
janin dari ukuran kelahiran (23).

Kami mempertimbangkan terlebih dahulu korelasi antara metilasi IC1 dan

berat dan lingkar kepala saat lahir dan kami tidak menemukan korelasi yang
signifikan (38). Kami mengamati korelasi antara penurunan pertumbuhan berat badan
dan lingkar kepala setelah kelahiran dan peningkatan kadar metilasi IC1 dari lahir
sampai pulang, menurut penelitian Huang (23, 38).

Pembatasan pertumbuhan kepala postnatal adalah kondisi yang relatif umum

pada neonatus prematur dan lingkar kepala berkorelasi dengan volume otak. Laporan
yang berbeda menggambarkan suatu hubungan antara ukuran kepala berkurang dan
perkembangan saraf (42, 43). Menarik juga untuk mencatat beberapa bukti tentang
hubungan antara hipermetilasi IC1 dan pembatasan pertumbuhan lingkar kepala
dalam model manusia (23, 44-46). Selanjutnya, studi Pidsley menunjukkan bahwa
variasi epigenetik IGF2 / H19 IC1 memiliki hubungan negatif yang signifikan dengan
massa serebelar pada tikus (47).
KESIMPULAN

Kita dapat mempertimbangkan hipermetilasi IC1 terkait dengan pengurangan asupan

nutrisi dalam beberapa model manusia dan hewan, seperti mekanisme pemrograman
ulang untuk mengejar ketinggalan pertumbuhan melalui peningkatan ekspresi IGF2.
Di penelitian kami, bayi dengan EUGRw dan / atau EUGRhc mengalami peningkatan
metilasi IC1 dari lahir sampai pemulangan. Menurut hipotesis ini, metilasi IC1 dapat
digunakan sebagai penanda berkurangnya pertumbuhan dan dapat membimbing kita
untuk mencegah EUGR parah. Hipermetilasi IC1 persisten sejak awal kehidupan
dapat bertanggung jawab untuk suatu perubahan pengaturan metabolik, menyebabkan
komplikasi metabolisme dan kardiovaskular dalam kehidupan saat dewasa.26 Studi
kami adalah studi pilot, tetapi temuan awal ini harus dipertimbangkan untuk validasi
lebih lanjut di seri kasus yang lebih besar.

PERSETUJUAN ETIK

Protokol telah disetujui oleh komite Etik dari Rumah Sakit Universitas Pisa. Semua
subjek memberi informmed consent tertulis sesuai dengan Deklarasi Helsinki.

KONTRIBUSI AUTHOR

MT merancang penelitian, melakukan analisis awal, menyusun naskah awal,

merevisinya, dan menyetujui naskah final yang dikumpulkan. FM melakukan analisis
awal,menyusun naskah awal, dan menyetujui naskah final yang dikumpulkan. AM
dan CC melakukan analisis genetik, ditinjau,dan menyetujui naskah final seperti yang
dikumpulkan. FL dan MC mengkaji analisis statistik secara kritis, menyusun konsep
awal naskah, merevisinya, dan menyetujui naskah final yang dikumpulkan. PG
mengkonseptualisasikan dan merancang penelitian, menyusun konsep naskah awal,
mengkoordinasi dan mengawasi pengumpulan data, dan menyetujui naskah final
seperti yang dikumpulkan. Semua penulis menyetujui naskah akhir seperti yang
diajukan dan setuju untuk bertanggung jawab untuk semua aspek pekerjaan.

DAFTAR PUSTAKA

1. Stoelhorst GM, Rijken M, Martens SE, Brand R, den Ouden AL, Wit JM, et
al. Changes in neonatology: comparison of two cohorts of very preterm
infants (gestational age <32 weeks) : the Project On Preterm and Small for
Gestational Age Infants 1983 and the Leiden Follow-Up Project on
Prematurity 1996- 1997. Pediatrics (2005) 115:396–405. doi:
10.1542/peds.2004-1497
2. Dusick AM, Poindexter BB, Ehrenkranz RA, Lemons JA. Growth failure in
the preterm infant: can we catch up? Semin Perinatol. (2003) 27:302–10. doi:
10.1016/S0146-0005(03)00044-2
3. Martin CR, Brown YF, Ehrenkranz RA, O’Shea TM, Allred EN, Belfort MB,
et al. Nutritional practices and growth velocity in the first month of life in
extremely premature infants. Pediatrics (2009) 124:649–57. doi:
10.1542/peds.2008-3258
4. Hay WW. Early postnatal nutritional requirements of the very preterm infant
based on a presentation at the NICHD-AAP workshop on research in
neonatology. J Perinatol. (2006) 26(Suppl 2):S13–8. doi: 10.1038/sj.jp.72
11426
5. Ehrenkranz RA, Dusick AM, Vohr BR, Wright LL, Wrage LA, Poole WK.
Growth in the neonatal intensive care unit influences neurodevelopmental and
growth outcomes of extremely low birth weight infants. Pediatrics (2006)
117:1253–61. doi: 10.1542/peds.2005-1368
6. Clark RH, Thomas P, Peabody J. Extrauterine growth restriction remains a
serious problem in prematurely born neonates. Pediatrics (2003) 111(5 Pt
1):986–90. doi: 10.1542/peds.111.5.986
7. Ofek Shlomai N, Reichman B, Lerner-Geva L, Boyko V, Bar-Oz B.
Populationbased study shows improved postnatal growth in preterm very-
lowbirthweight infants between 1995 and 2010. Acta Paediatr. (2014)
103:498– 503. doi: 10.1111/apa.12569
8. Griffin IJ, Tancredi DJ, Bertino E, Lee HC, Profit J. Postnatal growth failure
in very low birthweight infants born between 2005 and 2012. Arch Dis Child
Fetal Neonatal Ed. (2016) 101:F50–5. doi: 10.1136/archdischild-2014-30
8095
9. Clark RH, Wagner CL, Merritt RJ, Bloom BT, Neu J, Young TE, et al.
Nutrition in the neonatal intensive care unit: how do we reduce the incidence
of extrauterine growth restriction? J Perinatol. (2003) 23:337–44. doi:
10.1038/sj.jp.7210937
10. Pampanini V, Boiani A, De Marchis C, Giacomozzi C, Navas R, Agostino R,
et al. Preterm infants with severe extrauterine growth retardation (EUGR) are
at high risk of growth impairment during childhood. Eur J Pediatr. (2015)
174:33–41. doi: 10.1007/s00431-014- 2361-z
11. Wit JM, Finken MJ, Rijken M, de Zegher F. Preterm growth restraint: a
paradigm that unifies intrauterine growth retardation and preterm extrauterine
growth retardation and has implications for the small-forgestational-age
indication in growth hormone therapy. Pediatrics (2006) 117:e793-5. doi:
10.1542/peds.2005-1705
12. Ruchat SM, Hivert MF, Bouchard L. Epigenetic programming of obesity and
diabetes by in utero exposure to gestational diabetes mellitus. Nutr Rev.
(2013) 71(Suppl 1):S88–94. doi: 10.1111/nure.12057
13. Choi, SW, Friso S. Epigenetics: a new bridge between nutrition and health.
Adv Nutr. (2010) 1:8–16. doi: 10.3945/an. 110.1004
14. Gonzalez-Rodriguez P, Cantu J, O’Neil D, Seferovic MD, Goodspeed DM,
Suter MA, et al. Alterations in expression of imprinted genes from the
H19/IGF2 loci in a multigenerational model of intrauterine growth restriction
(IUGR). Am J Obstet Gynecol. (2016) 214:625.e1-625.e11. doi:
10.1016/j.ajog.2016.01.194
15. Jiménez-Chillarón JC, Díaz R, Martínez D, Pentinat T, Ramón-Krauel M,
Ribó S, et al. The role of nutrition on epigenetic modifications and their
implications on health. Biochimie (2012) 94:2242–63. doi:
10.1016/j.biochi.2012.06.012
16. Altmann S, Murani E, Schwerin M, Metges CC, Wimmers K, Ponsuksili S.
Dietary protein restriction and excess of pregnant German Landrace sows
induce changes in hepatic gene expression and promoter methylation of key
metabolic genes in the offspring. J Nutr Biochem. (2013) 24:484–95. doi:
10.1016/j.jnutbio.2012.01.011
17. Jousse C, Parry L, Lambert-Langlais S, Maurin AC, Averous J, Bruhat A, et
al. Perinatal undernutrition affects the methylation and expression of the leptin
gene in adults: implication for the understanding of metabolic syndrome.
Faseb J. (2011) 25:3271–8. doi: 10.1096/fj.11-181792
18. Cordeiro A, Neto AP, Carvalho F, Ramalho C, Dória S. Relevance of
genomic imprinting in intrauterine human growth expression of CDKN1C,
H19, IGF2, KCNQ1 and PHLDA2 imprinted genes. J Assist Reprod Genet.
(2014) 31:1361–8. doi: 10.1007/s10815-014- 0278-0
19. Gicquel C, Rossignol S, Cabrol S, Houang M, Steunou V, Barbu V, et al.
Epimutation of the telomeric imprinting center region on chromosome 11p15
in Silver-Russell syndrome. Nat Genet. (2005) 37:1003–7. doi:
10.1038/ng1629
20. Reik W, Walter J. Genomic imprinting: parental influence on the genome.
Nat Rev Genet. (2001) 2:21–32. doi: 10.1038/ 35047554
21. Ibrahim A, Kirby G, Hardy C, Dias RP, Tee L, Lim D, et al. Methylation
analysis and diagnostics of Beckwith-Wiedemann syndrome in 1,000 subjects.
Clin Epigenet. (2014) 6:11. doi: 10.1186/1868-7083-6-11
22. Kannenberg K, Weber K, Binder C, Urban C, Kirschner HJ, Binder G.
IGF2/H19 hypomethylation is tissue, cell, and CpG site dependent and not
correlated with body asymmetry in adolescents with Silver-Russell syndrome.
Clin Epigenet. (2012) 4:15. doi: 10.1186/1868-7083-4-15
23. Huang RC, Galati JC, Burrows S, Beilin LJ, Li X, Pennell CE, et al. DNA
methylation of the IGF2/H19 imprinting control region and adiposity
distribution in young adults. Clin Epigenet. (2012) 4:21. doi: 10.1186/1868-
7083-4-21
24. Barker DJ, Hales CN, Fall CH, Osmond C, Phipps K, Clark PM. Type 2 (non-
insulin-dependent) diabetes mellitus, hypertension and hyperlipidaemia
(syndrome X): relation to reduced fetal growth. Diabetologia (1993) 36:62–7.
doi: 10.1007/BF00399095
25. Schulz LC. The Dutch Hunger Winter and the developmental origins of
health and disease. Proc Natl Acad Sci USA. (2010) 107:16757–8. doi:
10.1073/pnas.1012911107
26. Heijmans BT, Tobi EW, Stein AD, Putter H, Blauw GJ, Susser ES, et al.
Persistent epigenetic differences associated with prenatal exposure to famine
in humans. Proc Natl Acad Sci USA. (2008) 105:17046–9. doi:
10.1073/pnas.0806560105
27. St-Pierre J, Hivert MF, Perron P, Poirier P, Guay SP, Brisson D, et al. IGF2
DNA methylation is a modulator of newborn’s fetal growth and development.
Epigenetics (2012) 7:1125–32. doi: 10.4161/epi.21855
28. Perkins E, Murphy SK, Murtha AP, Schildkraut J, Jirtle RL,
DemarkWahnefried W, et al. Insulin-like growth factor 2/H19 methylation at
birth and risk of overweight and obesity in children. J Pediatr. (2012) 161:31–
9. doi: 10.1016/j.jpeds.2012.01.015
29. Fenton TR, Kim JH. A systematic review and meta-analysis to revise the
Fenton growth chart for preterm infants. BMC Pediatr. (2013) 13:59. doi:
10.1186/1471-2431-13-59
30. Fenton TR, Sauve RS. Using the LMS method to calculate z-scores for the
Fenton preterm infant growth chart. Eur J Clin Nutr. (2007) 61:1380–5. doi:
10.1038/sj.ejcn.1602667
31. Lin Z, Green RS, Chen S, Wu H, Liu T, Li J, et al. Quantification of EUGR as
a measure of the quality of nutritional care of premature infants. PLoS ONE
(2015) 10:e0132584. doi: 10.1371/journal.pone.0132584
32. Choi AY, Lee YW, Chang MY. Modification of nutrition strategy for
improvement of postnatal growth in very low birth weight infants. Korean J
Pediatr. (2016) 59:165–73. doi: 10.3345/kjp.2016.59. 4.165
33. Wang XM, Zhu YP, Wang L. Effect of positive nutritional support strategy on
extrauterine growth restriction in preterm infants. Zhongguo Dang Dai Er Ke
Za Zhi (2013) 15:1054–8.
34. Su BH. Optimizing nutrition in preterm infants. Pediatr Neonatol. (2014)
55:5–13. doi: 10.1016/j.pedneo.2013.07.003
35. Bi CY, Ru XF, Feng Q, Wang Y, Zhang X, Li X, et al. The status of protein
intake and energy supply in the early life of very/extremely low birth weight
infants. Zhonghua Er Ke Za Zhi (2013) 51:349–55.
36. Dinerstein A, Nieto RM, Solana CL, Perez GP, Otheguy LE, Larguia AM.
Early and aggressive nutritional strategy (parenteral and enteral) decreases
postnatal growth failure in very low birth weight infants. J Perinatol. (2006)
26:436–42. doi: 10.1038/sj.jp.7211539
37. Vlaardingerbroek H, Vermeulen MJ, Rook D, van den Akker CH, Dorst K,
Wattimena JL, et al. Safety and efficacy of early parenteral lipid and high-
dose amino acid administration to very low birth weight infants. J Pediatr.
(2013) 163:638–44.e1-5. doi: 10.1016/j.jpeds.2013.03.059
38. Tozzi MG, Massei A, Michelucci A, Moscuzza F, Lorenzoni F, Cosini C, et
al. Extrauterine growth restriction(EUGR) in VLBW infants: growth patterns,
nutrition and epigenetic markers. Endocr Rev. (2018) 39:2.
39. Lillycrop KA, Phillips ES, Torrens C, Hanson MA, Jackson AA, Burdge GC.
Feeding pregnant rats a protein-restricted diet persistently alters the
methylation of specific cytosines in the hepatic PPAR alpha promoter of the
offspring. Br J Nutr. (2008) 100:278–82. doi: 10.1017/S0007114507894438
40. Rees WD, Hay SM, Brown DS, Antipatis C, Palmer RM. Maternal protein
deficiency causes hypermethylation of DNA in the livers of rat fetuses. J Nutr.
(2000) 130:1821–6. doi: 10.1093/jn/130. 7.1821
41. Gong L, Pan YX, Chen H. Gestational low protein diet in the rat mediates
Igf2 gene expression in male offspring via altered hepatic DNA methylation.
Epigenetics (2010) 5:619–26. doi: 10.4161/epi.5.7.12882
42. Neubauer V, Griesmaier E, Pehböck-Walser N, Pupp-Peglow U,
KiechlKohlendorfer U. Poor postnatal head growth in very preterm infants is
associated with impaired neurodevelopment outcome. Acta Paediatr. (2013)
102:883–8. doi: 10.1111/apa.12319
43. Hack M, Breslau N, Weissman B, Aram D, Klein N, Borawski E. Effect of
very low birth weight and subnormal head size on cognitive abilities at school
age. N Engl J Med. (1991) 325:231–7. doi: 10.1056/NEJM1991072532 50403
44. Pidsley R, Dempster EL, Mill J. Brain weight in males is correlated with
DNA methylation at IGF2. Mol Psychiatry (2010) 15:880–1. doi:
10.1038/mp.2009.138
45. Claas MJ, de Vries LS, Koopman C, Uniken Venema MM, Eijsermans MJ,
Bruinse HW, et al. Postnatal growth of preterm born children