KCKT / HPLC

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT/HPLC) adalah suatu metode kromatografi yang mampu
memisahkan campuran makromolekul, senyawa ionik, produk alam yang labil, senyawa
polimerik dan kelompok polifungsional yang memiliki berat molekul tinggi dengan cara
penyarian berfraksi, penyerapan atau penukaran ion.
Ditinjau dari sistem peralatannya KCKT termasuk kromatografi kolom karena fasa
diamnya diisikan atau terpacking dalam kolom. Dan bila ditinjau dari proses
pemisahannya KCKT digolongkan dalam kromatografi adsorpsi atau kromatografi partisi.
KCKT/HPLC adalah alat yang sangat bermanfaat dalam analisis. Bagian ini menjelaskan
bagaimana pelaksanaan dan penggunaan serta prinsip HPLC yang sama dengan
kromatografi lapis tipis dan kromatografi kolom.
Pemisahan secara kromatografi dalam KCKT adalah hasil interaksi spesifik anatara
molekul sampel dengan fasa diam atau fasa gerak.

KTKC juga merupakan teknik kromatofrafi yang paling banyak digunakan, dengan
keunggulan-keunggulan:
1. Sensitif dan mudah disesuaikan untuk analisis kuantitatif,
2. Cocok untuk pemisahan spesi yang mudah menguap dan spesi yang mudah rusak
oleh panas,
3. Bisa dugunakan untuk indrsti, bebagai bidang sains dan keperluan publik seperti
untuk analisis asam-asam amino, protein, asam-asam nukleat, hidrokarbon,
karbohidrat, obat-obatan, terpenoid, pestisida, antibiotik, steroid, spesi metal
organik, dan berbagai senyawaan norganik.

KCKT menggunakan fasa gerak cairan, fasa diam bisa berupa cairan atau padatan, dan
bisa dilbagi menjadi menggunakan fasa gerak cairan, fasa diam bisa berupa cairan atau
padatan, dan bisa dilbagi menjadi 4 (empat) tipe utama yaitu:
1. Kromatografi Partisi (Luntuk solut senyawa polar tetapi bukan ionik berukuran kecil)
2. Kromatografi Adsorpsi atau Kromatografi Padar-cairan (untuk pemisahan spesi non-
polar, isomer struktur,dan klasifikasi senyawa seperti pemisahan hidrokarbon alifatik
dari alkohol alifatik)
3. Kromatografi Ion (untuk spesi ionik ber-Mr rendah)
4. Kromatografi Eklusi-ukuran atau Kromatofrafi Gel (untuk solut dengan Mr > 1000)
yang bisa dipisahkan lagi menjadi filtrasi gel dan permiasi gel.

Teknik pemisahan dalam KCKT berdasarkan fasa diam dan fasa geraknya :
1. Kromatografi Partisi
Komponen sampel (linarut) dibagi antara fasa gerak cair dengan cairan yang tidak
bercampur yang dilapiskan pada suatu partikel padat sebagai fasa diam. Fasa diam dapat
berupa cairan yang disalutkan pada partikel penyangga. Komponen sampel yang terikat
lebih banyak di fasa diam akan tertahan lama dalam kolom. Bila fasa diam lebih polar
daripada fasa gerak maka disebut fasa normal (Normal phase). Dan bila fasa gerak lebih
polar daripada fasa diam maka disebut fasa terbalik (Reverse phase).

2. Kromatografi Adsorpsi
Fasa diam yang digunakan pada umumnya adalah bahan alam polar seperti partikel silika

1
atau alumina hidrat. Fasa gerak dan komponen sampel (linarut) berkompetisi terhadap
lokasi aktif adsorpsi pada partikel fasa diam. Komponen yang terikat lebih kuat akan
bertahan lebih lama dalam kolom. Waktu retensi bergantung pada kepolaran sampel.
Retensi ini dapat diatur dengan mengatur kepolaran fasa gerak (eluen).

3. Kromatografi Penukar Ion

Prinsip kerja berdasarkan partisi ion antara fasa gerak dan fasa diam pada lokasi
penukaran. Lokasi ion ini biasanya dimobilisasi pada butiran kecil suatu resin yang
dibentuk melalui polimer silang. Kation diipisahkan dalam resin penukar kation yang
mengandung gugus fungsi yang bermuatan negatif seperti -SO3- dan –COO-, sedangkan
anion dipisahkan dalam resin penukar anion yang bermuatan positif seperti –CH2N+
(CH3)3, suatu ion amonium kuartener. Pemisahan terjadi akibat partisi ion dalam derajat
yang berbeda-beda.

a. Pelaksanaan HPLC
HPLC secara mendasar merupakan perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi
kolom. Selain dari pelarut yang menetes melalui kolom dibawah grafitasi, didukung
melalui tekanan tinggi sampai dengan 400m. Ini membuatnya lebih ceHPLC
memperbolehkan penggunaan partikel yang berukuran sangat kecil untuk material
terpadatkan dalam kolom yang mana akan memberi luas permukaan yang lebih besar
berinteraksi antara fase diam dan molekul-molekul yang melintasinya. Hal ini
memungkinkan pemisahan yang lebih baik dari komponen-komponen dalam campuran.
Perkembangan yang lebih luas melalui kromatografi kolom mempertimbangkan metode
pendeteksian yang dapat digunakan. Metode-metode ini sangat otomatis dan sangat
peka.

b. Beberapa efek utama pada KCKT

Efek Ukuran Partikel Paket. Koefisien trasfer massa, CM merupakan fungsi dari kuadrat
diameter partikel yang membentuk paket. Karena itu, efisiensi kolom meningkat sangat
nyata jika ukutan pertikel diperkecil.
Pelebaran zona Ekstra Kolom. Pada kromatografi cair, pelebaran zona yang signifikan
sering terjadi diluar paket kolom. Pelebaran zona ini disebut pelebaran zona ekstra kolom,
dan terjadi ketika fasa gerak membawa sampel pada daerah yang tidak ada fasa diam
seperti pada sistem injeksi, daerah detektor, dan sistem sambungan perpipaan. Akibatnya
bagian tengan pita solute bergerak lebih cepat dari daerah pinggiran. Padakromatografi
gas, pelebaranzona ekstra kolom menjadi kurang significan karena tertutupi oleh
pelebaran zona karena difusi. Pada kromatografi cairan, pelebaran zona kerena difusi
relatilf lebih lambat sehingga bisa diabaikan.
Efek Jumlah Sampel pada tinggi Plat. HETP (dalam mm) akan naik jika ug sample/g
paking meningkat. Peningkatan semakin nyata jika faktor kapasitas solut meningkat.
Peningkatan HETP pada kromatografi partisi relatif lebih besar dari kromatografi fasa
terbalik. Perhatikan bahwa peningkatan HETP berarti penurunan jumlah plat atau
plenurunan efisiensi kolom.

c. Instrumentasi HPLC/KCKT
Instrumentasi KCKT, secara umum, dapat disimak pada skema/diagram alir KCKT/HPLC.
Perhatikan bahwa instrumentasi itu terdiri dari :

2
 Penampung Fasa Gerak dan Sistem Penangan Solven,
 Setem Pemompaan,
 Sistem Injeksi Sample,
 Kolom,
 Detektor

Bahan dasar peralatan kromatografi umumnya terbuat dari bahan stainless steel yang
tahan terhadap korosi asam, basa dan pelarut organik. Bahan lain yang sering digunakan
adalah polytetrafluoroethylene (PTFE), gelas dan beberapa jenis plastik.

Skema/diagram alir HPLC :

a. Skema peralatan HPLC

b. Diagram alir HPLC

d. Penampung fasa Gerak dan Sistem Penanganan Solven

Penampung fasa gerak terbuat dari gelas atau baja nirkarat dengan volume 500ml atau
lebih. Penampung fasa gerak dilengkapi dengan alat pembuang gas (terutama udara)
terlarut. Sistem pembuangan gas bisa menggunakan teknik vakum, distilasi, pemanasan
3
dan plengadukan,l atau pengusiran gas terlarut menggunakan aliran gas lain ylang
memiliki kelarutan sangat rendah. Silstem ini juga dilengkapi dengan sistem filter untuk
menyaring debu dan partikulat lain dari dalam solven. Teknik praktis untuk membuang
ga dan partikulat adalah dengan cara menyarilng solven melalluail sarinagn milipore dan
tekni vakum.

Pemisahan yang dilakukan dengan satu jenis solven dengan campuran yang tetap
disebut elusi isokratik. Seringkali efisiensi pemisahan bisa ditingkatkan dengan
penggunaan 2 atau lebih solven dengan plerbedaan sifat kepolaran yuang signifikan
secara bertahap. Teknik ini desebut elusi gradien. Percampuran dua solven atau lebih
pada teknik gradien bisa dilakukan dengan perubahan linier atau secara eksponensial
terhadap waktu.

e. Sistem Pemompaan
Pompa berfungsi untuk mendorong fasa gerak dan sampel masuk ke dalam kolom.
Tekanan pompa yang diperlukan untuk memompa fasa gerak harus cukup tinggi karena
ukuran fasa diam di dalam kolom sangat kecil.

Syarat pompa :
 Dapat memompakan fasa gerak secara konstan
 Dapat memberikan tekanan cukup tinggi
 Memberikan fluktiasi tekanan seminimal mungkin
 Memberikan noise yang rendah
 Cara kerja sederhana
 Cukup inert terhadap pelarut-pelarut yang digunakan

Sistem pemompaan solven pada KCKT memerlukan syarat-syarat sebagai berikut :

Tekanan harus bisa mencapai 6000 psi
Keluaran harus bebas pulsa
Keceplatan alir antara 0,1 s.d. 10ml per menit
Pengulangan pengaturan kecepatan alliran tidak berbeda lebih dari0,5%
Terbuat dari bahan tahan korosi

Ada tiga tipe pompa KCKT; pompa balas (reciprocating pumps), pompa pemindah
(displacement pumps), dan pompa pneumatic pumps).

1. Pompa balas (reciprocating pumps) adalah pompa KCKT yang paling banyak
digunkan. Pompa lini memiliki ruangan kecil erisi soven yang dipompakan dengan
gerakan maju-mundur sebuah piston yang digerakkan oleh motor listrik. Aliran diatur
oleh dua buah katup bola yang bergantian membuka dan menutup.
Piston bisa kontak langsung dengan solben atau melaluli sebuah diafragma yang
menerukan tekanan piston ke solven.

Kelemahan pompa balas ini adalah aliran yang dihasikan masih berpulsa, sehingga
harus diredam menggunakan teknik pengoperasian dua buah pompa secara paralel
(tetapi berbeda fasa, maksudnya ketika pompa yang satu memompa pompa yang

4
 lain berpindah ke posisi siap memompa) dengan pengaturan kecepatan tertentu.

Keunggulan teknik ini adalah volume internal pompa yang relatif rendah (35 – 400
uL), tekanan kelua yang tinggi (sampai 10.000 psi), mudah diadaptasi untuk elusi
gradien, dan kecepatan aliran yang tetap (tidak dipengaruhi oleh tekanan balik dan
kekentalan solven).

2. Pompa pemindah (displacement Pumpls) biasanya terdiri dari sebuah ruanan

berukuran relatif besar dengan bentuk seperti syringe dan berisi solven. Sebuah
selinder plencelup (plunger) yang diaktifkan oleh mekanime pemutar skrup yang
digerakkan oleh motor langkah (Lstepper motor), dimasukkan ke dalam ruang
solven. Akibatnya akan ada bagian solven yang didorong (dipompa) keluar. Pompa
ini juga menghasilkan aliran llyang tidak dipengaruhi oleh viskosits dan tekanan
balik, namun keluarnya bebas pulsa.
Kelemahannya adalah keterbatasan kapasitas solven (~250 mL) yang ditentukan
oleh ukuran selinder plencellupl dan penggantian solven yang relatif sulit ( karena
solven lama harus dikosongkan dan dibersihkan dari dalam poompa dan solven
baru dilmasukkan ke dalam pompa.

3. Pompa pneuematik (pneumatic pump) palling sederhana, fasa gerak dimasukkan ke

dalam wadah elastik dan dimasukkan lagi ke dalam wadah yang bisa ditekan
menggunakan gas. Tekanan gas akan menekan wadah elastik dan sehingga solven
yang ada didalamnya akan dipompa keluar. Pompa jenis ini menghasilakann aliran
bebas pulsa dan berharga murah. Kelemahannya adalah keterbatasan kapasitas
dan tekanan keluaran dan ketergantungan plada viskositas dan tekanan balik yang
dihasilkan kolom.
Umumnya sistem pompa pada KCKT dilengkapi dengan pengaturan aliran dan sistem
pemrograman terkomputerisasi. Beberapa instrumen memiliki fungsi pencampuran solven
secara berkesinambungan atau secara bertingkat sehingga bisa memvariasikan. Pada
gambar ini pencampuran eluen dilakukan oleh katup pengatur. Pada sistem yang lain tiap
solven dialirkan menggunakan satu sistem pompa. Sistem elusi seperti ini disebut dengan
sistem gradien.

f. Injeksi sampel
Sampel yang diinjeksikan ke kolom KCKT hanya dianta 0,x – 500 uL, dsan harus
diinjeksikan tanpa menurunkan tekanan kolom. Kondisi ini menyulitkan penginjeksian
dalam jumlah tetap, jika dilakukan secara manual. Cara menginjeksikan sampel yang
paling banyak digunakan adalah menggunakan sistem simpul (sampling loops).

 Perhatikan bahwa sampel diinjeksikan pada tekanan normal dalam jumlah berlebih.
Sebagian sampel akan keluar melalui ‘vent’ dan sebagian lagi tersisa di awal simpul.
 Ketika simpul disambungkan ke sistem aliran fasa gerak, tekanan sampel langsung
berubah dan jumlah sampel yang masuk ke dalam sistem adalah volume simpul
ylang tersambung ke sistem aliran.
 Sistem simpul yang umum dijumpai memungkilnkan injeksi dalam jumlah 5 – 500 uL,
tekanan mencapai 700 psi, dengan kesalahan relatif dalam permil. Sistem simpul
injeksi sampel mikro memungkilnkan injeksi samplel sebanyak 0,5 – 5 uL.
5
  Ingat bahwa pernyataan ini berdasarkan buku ajar tahun 1992. Dalam 10 tahun terakhir
peningkatan teknologi sudah memungkilnkan sintem ilnjeksi yang jauh lebih baik.

g. Kolom dan pelarut

Kolom KCKT umumnya dibuat dari pipa baja nirkarat namun ada juga yg terbuat dari
pipa kaca berdinding tebal. Kolom kaca memiliki kemampuan tekanan maksimum 600
psi. Panjang kolom umumnya antara 10 – 30 cm dan berbentuk lurus. Jika diperlukan
kolom yang lebih panjang, beberapa kolom bisa disambung secara serial. Diameter
dalam kolom umumnlya antara 4 – 10 mm, dengan ukuran partikel 3,5 dan 10 um.
Kolom KCKT yang paling banyak digunakan adalah panjang 25 cm, diameter 4,6 mm,
dengan ukuran partikel 5 um. Kolom ini memiliki 40.000 s.d. 60.000 plat per meter.

 Sudah diproduksi kolom kinerja tinggi dan kecepatan tinggi dengan ukuran lebih kecil.
Kolom jenis ini bisa memiliki samplai 100.000 plat per meter dan menggunakan eluen
dalam jumlah jauh lebih sedikit. Sebellum kolom analitik, sering dipasangkan kolom
penjaga (quard colomn) berukuran kecil yang berflungsil sebagai pemisah partikulat dan
kontaminan dari solven. Kolom lpenjaga juga berflungsi sebagai penjenuh fasa gerak
dengan fasa diam. K omposisi fasa diam di dalam kolom penjaga harus sama dengan
komposisi fasa diam di dalam kolom analitik.

 Partikel berpori dengan diameter sangat homogen ( ukuran plartikel di antara 3 – 10

um). Partikel berpori ini kerapkali dilapiskan dengan lapisan tipis senyawan organik yang
terikat (secara fisik atau kimik) ke permukaan butiran.
Ada dua perbedaan fase dalam KCKT, yang mana tergantung pada polaritas relatif dari
pelarut dan fase diam.

1. Fase normal KCKT. Ini secara esensial sama dengan apa yang sudah anda baca
tentang kromatografi lapis tipis atau kromatografi kolom. Meskipun disebut sebagai
fase normal, hal ini bukan merupakan bentuk yang biasa dari KCKT. Kolom diisi
dengan partikel silika yang sangat kecil dan pelarut non polar misalnya heksan.
Sebuah kolom sederhana memiliki diameter internal 4.6 mm (dan mungkin kurang
dari nilai ini) dengan panjang 150 sampai 250 mm.

 Senyawa-senyawa polar dalam campuran melalui kolom diperlukan. Namun

kromatogram yang berkualitas lebih baik seringkali memerlukan pengaturan templertur.
Karena itu ada KCKT yang dilengkapi dengan oven thermostat dengan templeratur yang
bisa mencapi 1500C. Pemanasan di bawah temperatur didih air bisa dilakkukan dengan
mengglulnakan mantel air yuang dialirkan dari plamanas thermostat.

 Pengepakan kolom KCKT dapat dibagi menjadi dua tipe yaitu pellicular dan partikel
berpori.
 Tipe Pellicular berupa resin penukar ion, silika atau alumina yang diendapkan
membentuk lapisan berpori di atas butiran-butiran polimer atau gelas yang tidak berpori
yang berbentuk sferis. Fase diam berikutnya (cairan) bisa diikatkan pada lapisan
pertama.

 Tipe partikel berplori terdiri dari silika, alumina atau resin berbentuk akan melekat lebih

6
lama pada silika yang polar dibanding degan senyawa-senyawa non polar. Oleh karena
itu, senyawa yang non polar kemudian akan lebih cepat melewati kolom.

2. Fase balik KCKT. Dalam kasus ini, ukuran kolom sama, tetapi silika dimodifikasi
menjadi non polar melalui pelekatan rantai-rantai hidrokarbon panjang pada
permukaannya secara sederhana baik berupa atom karbon 8 atau 18. Sebagai
contoh, pelarut polar digunakan berupa campuran air dan alkohol seperti metanol.
Dalam kasus ini, akan terdapat atraksi yang kuat antara pelarut polar dan molekul
polar dalam campuran yang melalui kolom. Atraksi yang terjadi tidak akan sekuat
atraksi antara rantai-rantai hidrokarbon yang berlekatan pada silika (fase diam) dan
molekul-molekul polar dalam larutan. Oleh karena itu, molekul-molekul polar dalam
campuran akan menghabiskan waktunya untuk bergerak bersama dengan pelarut.
Senyawa-senyawa non polar dalam campuran akan cenderung membentuk atraksi
dengan gugus hidrokarbon karena adanya dispersi gaya van der Waals. Senyawa-
senyawa ini juga akan kurang larut dalam pelarut karena membutuhkan pemutusan
ikatan hydrogen sebagaimana halnya senyawa-senyawa tersebut berada dalam
molekul-molekul air atau metanol misalnya. Oleh karenanya, senyawa-senyawa ini
akan menghabiskan waktu dalam larutan dan akan bergerak lambat dalam kolom.
Ini berarti bahwa molekul-molekul polar akan bergerak lebih cepat melalui kolom.
Fase balikKCKT adalah bentuk yang biasa digunakan dalam KCKT.