1.

Sanger sequencing
Sanger sequencing adalah metode sekuensing DNA berdasarkan selektif penggabungan
pemutusan rantai dideoxynucleotides oleh DNA polymerase selama replikasi DNA in vitro. Metode
Sanger disebut sebagai sekuensi dideoksi atau pemutusan rantai, didasarkan pada penggunaan
dideoxynucleotides (ddNTP's) di samping nukleotida normal (NTP) yang ditemukan dalam DNA.
Dideoksinukleotida pada dasarnya sama dengan nukleotida kecuali mengandung gugus hidrogen pada
karbon 3 'dan bukan gugus hidroksil (OH). Nukleotida yang dimodifikasi ini, ketika diintegrasikan ke
dalam suatu urutan, mencegah penambahan nukleotida lebih lanjut. Ini terjadi karena ikatan fosfodiester
tidak dapat terbentuk antara dideoksinukleotida dan nukleotida yang masuk berikutnya, dan dengan
demikian rantai DNA diakhiri.
Langkah Sequencing Sanger. Terdapat tiga langkah utama untuk sequencing Sanger, antara lain
sebagai berikut:
1. Chain Termination PCR
Urutan DNA digunakan sebagai templat untuk jenis PCR khusus yang disebut PCR pemutusan
rantai. PCR pemutusan rantai bekerja sama seperti PCR standar, tetapi dengan satu perbedaan utama:
penambahan nukleotida termodifikasi (dNTP) yang disebut dideoxyribonucleotides (ddNTPs). Dalam
langkah perpanjangan PCR standar, DNA polimerase menambahkan dNTPs ke untai DNA yang
berkembang dengan mengkatalisasi pembentukan ikatan fosfodiester antara kelompok 3'-OH bebas dari
nukleotida terakhir dan 5'-fosfat yang berikutnya.
 Dalam urutan Sanger manual, empat reaksi PCR diatur, masing-masing dengan hanya satu jenis
ddNTP (ddATP, ddTTP, ddGTP, dan ddCTP) dicampur.
 Dalam pengurutan Sanger otomatis, semua ddNTP dicampur dalam satu reaksi, dan masing-masing
dari empat dNTP memiliki label fluorescent yang unik.
2. Pemisahan Ukuran dengan Gel Elektroforesis
Oligonukleotida yang diputus rantai dipisahkan berdasarkan ukuran melalui elektroforesis gel.
Sampel DNA dimuat ke salah satu ujung matriks gel, dan arus listrik diterapkan; DNA bermuatan negatif,
sehingga oligonukleotida akan ditarik ke arah elektroda positif di sisi gel yang berlawanan. Semakin kecil
fragmen, semakin sedikit gesekan yang akan dialami saat bergerak melalui gel, dan semakin cepat akan
bergerak. Hasilnya, oligonukleotida akan disusun dari terkecil hingga terbesar, membaca gel dari bawah
ke atas.
 Dalam sekuensing Sanger manual, oligonukleotida dari masing-masing dari empat reaksi PCR
dijalankan dalam empat jalur gel yang terpisah. Ini memungkinkan pengguna untuk mengetahui
oligonukleotida yang sesuai dengan masing-masing ddNTP.
 Dalam sekuensing Sanger otomatis, semua oligonukleotida dijalankan dalam elektroforesis gel kapiler
tunggal dalam mesin sekuensing.
3. Analisis Gel & Penentuan Urutan DNA
Melibatkan membaca gel untuk menentukan urutan DNA input. Karena DNA polimerase hanya
mensintesis DNA dalam arah 5 'sampai 3' mulai dari primer yang disediakan, setiap terminal ddNTP akan
sesuai dengan nukleotida spesifik dalam urutan asli (misalnya, fragmen terpendek harus berakhir pada
nukleotida pertama dari ujung 5 '). Oleh karena itu, dengan membaca pita gel dari yang terkecil hingga
terbesar, kita dapat menentukan urutan 5' hingga 3 'dari untai DNA asli.
 Dalam urutan Sanger manual, pengguna membaca keempat lajur gel sekaligus, bergerak dari bawah ke
atas, menggunakan lajur untuk menentukan identitas terminal ddNTP untuk setiap pita.
 Dalam sekuensing Sanger otomatis, komputer membaca setiap pita gel kapiler, secara berurutan,
menggunakan fluoresensi untuk memanggil identitas setiap terminal ddNTP.

Contoh urutan DNA manual (Manual Sanger Sequencing):

• Pertama, anil (anneal) primer untuk templat DNA (harus beruntai tunggal):
5 '-GAATGTCCTTTCTCTAAG
3'-GGAGACTTACAGGAAAGAGATTCAGGATTCAGGAGGCCTACCATGAAGATC
 AAG-5 '
• Kemudian bagi sampel menjadi empat alikuot termasuk nukleotida berikut:
"G" tube: Keempat dNTPs, salah satunya adalah radiolabeled, ditambah ddGTP (konsentrasi rendah)
"A" tube: Keempat dNTP, salah satunya adalah radiolabeled, ditambah ddATP
"T" tube: Keempat dNTP, salah satunya adalah radiolabeled, ditambah ddTTP
"C" tube: Keempat dNTP, salah satunya adalah radiolabeled, ditambah ddCTP
• Ketika DNA polimerase (mis. Fragmen Klenow) ditambahkan ke tabung, reaksi sintetis terus berlanjut,
dan dideoksinukleotida dimasukkan. Ini adalah acara "pemutusan rantai", karena ada kelompok 3 'H dan
bukannya 3' OH. Sejak DNA hasil sintesis diberi label (klasik dengan 35S-dATP), produk dapat
dideteksi dan dibedakan dari template.
Semakin tinggi konsentrasi ddNTP dalam reaksi, semakin pendek produknya. Dengan
konsentrasi ddNTP rendah, rantai terminasi akan lebih kecil kemungkinannya, dan akan didapatkan
produk yang lebih lama (urutan lebih lanjut dari primer). Jika, misalnya, kita hanya melihat reaksi "G",
akan ada campuran berikut ini produk sintesis:

(dan seterusnya, jika DNA yang

diurutkan berlanjut ke kanan)

Setiap untai yang baru

disintesis pada beberapa titik
memiliki ddGTP yang dimasukkan
dan bukan dGTP. Pemutusan rantai
kemudian terjadi (tidak ada lagi
polimerisasi). Karena penggabungan ddGTP adalah acak, semua kemungkinan panjang DNA yang
berakhir dengan G diproduksi. Produk-produk ini didenaturasi menjadi molekul DNA untai tunggal dan
dijalankan pada gel poliakrilamid. Gel dikeringkan pada kertas kromatografi dan terkena film sinar-X.
Karena untai templat tidak berlabel radioaktif, ia tidak menghasilkan pita pada film sinar-X. Hanya
untaian teratas berlabel yang menghasilkan pita, yang akan terlihat seperti ini:

Seperti yang dapat Anda lihat dari satu reaksi ini

(reaksi "G") peristiwa pemutusan rantai menghasilkan
pita-pita tersendiri pada gel. Pemutusan rantai yang
paling dekat dengan primer menghasilkan molekul
DNA terkecil (yang bermigrasi lebih jauh ke bawah
gel), dan pemutusan rantai lebih lanjut dari primer
menghasilkan molekul DNA yang lebih besar (yang
lebih lambat pada gel dan karena itu tetap lebih dekat
ke atas).
Ketika reaksi pemutusan rantai yang serupa dijalankan untuk masing-masing nukleotida, keempat
reaksi dapat berjalan bersebelahan, dan urutan DNA dapat dibaca dari "tangga" pita, urutan 5 'hingga 3'
dibaca dari bawah ke puncak:
Resolusi elektroforesis gel sangat penting dalam
sekuensing DNA. Molekul yang panjangnya 50, 100, atau
200 basa harus dapat dipisahkan dari molekul yang
panjangnya 51, 101, atau 201 basa (masing-masing). Untuk
menyelesaikan ini:
• Poliakrilamid dan bukan agarose yang digunakan
• Gel harus cukup besar sehingga molekul bermigrasi lebih
jauh dan lebih terselesaikan.
• Sampel didenaturasi sebelum dimuat, dan gel harus
mengandung urea konsentrasi tinggi (7 hingga 8 molar)
• Gel dijalankan pada suhu yang lebih tinggi (sekitar 50 C), juga untuk mencegah pembentukan ikatan H.

Urutan pada gel di sebelah kiri:

{TG} TACAACTTTTACTATGGCGTGACACCTAAATTATAGGCAGAAA ..