Metode Imunokimia

untuk analisis senyawa aktif

Marlia Singgih Wibowo

School of Pharmacy
Institut Teknologi Bandung
Analisis Imunokimia
 Berdasarkan prinsip reaksi spesifik antara
Antigen-Antibodi
 Penggunaan senyawa penanda (label) untuk
visualisasi reaksi
 Deteksi menggunakan metode fisiko-kimia
Prinsip Reaksi : meniru reaksi
imunologi dalam tubuh
Reaksi imunologi di dalam mamalia :

Ag memicu
Ab Reaksi primer

Reaksi (Fiksasi komplemen,

sekunder aglutinasi, presipitasi)

Reaksi tersier
(degranulasi,opsonisasi)
 Mengapa reaksi Antigen-Antibodi?

 Reaksi dan kekuatan

antibodi untuk “specific
and reproducible protein
binding”
 Prinsip reaksi :
immunoassays
Antigen-Antibody Interaction for
analysis

SUBSRATE

PRODUCT
Complex (visualized)
Ag-Ab-Label
Metode analisis berbasis
imunokimia
 Imunopresipitasi
 Imunoaglutinasi
 Imunokimia berlabel :
 EIA/ELISA (Enzyme ImmunoAssay)
 RIA (Radio ImmunoAssay)
 IFA (ImmunoFluorescence Assay)
 LIA (Luminescence Immuno Assay)
 dll
Antigen (antibody generator)
 Senyawa atau kompleks senyawa yang dapat
menginduksi sistem imun mamalia
 Sifat : Imunogenik : induksi/stimulasi sistem imun
mamalia
 Antigenik : bereaksi spesifik dengan antibodi
 Syarat antigen: High Molecular Weight (>5000),
chemical structure → Complex
 Jika MW < 5000, supaya bersifat imunogenik dan
antigenik dapat dikonjugasi dengan suatu protein
untuk meningkatkan immunogenicity
Yang dapat menjadi antigen
 Mikroba patogen dan atau toksin mikroba
 Toksin tanaman, hewan
 Protein spesifik atau senyawa lain yang
berstruktur spesifik
 Senyawa obat (narkotik, psikotropik), tidak
imunogenik, tetapi dapat dikonjugasi dengan
suatu protein carrier (contoh : BSA)
 Senyawa pestisida, dll.
Apakah Antibodi?
 Antibodi adalah protein yang disekresi oleh
sel plasma limfosit B akibat stimulasi
molekul asing (antigen) pada reseptor
antigen limfosit B
 Spesifik terhadap antigen yang memicunya
 Antibodi adalah molekul-molekul
glikoprotein yang dikenal sebagai
immunoglobulin: IgA, IgD, IgM, IgE, IgG
SIFAT UMUM ANTIBODI
 Antibodi memiliki spesifisitas dan aktivitas biologi
 Struktur Antibodi : Dua fragmen tempat
berikatannya antigen secara spesifik, disebut
sebagai fragmen Fab (fragment antigen binding)
yang univalen, masing-masing memiliki satu situs
pengikatan dan identik satu sama lain dalam segala
hal
 Fragmen ketiga adalah Fc (Fragment crystallisable),
fragmen yang dapat dikristalkan, tidak berikatan
dengan antigen, tetapi bertanggung jawab untuk
fungsi biologik molekul antibodi setelah antigen
berikatan dengan daerah Fab dari molekul utuh
Struktur Antibodi

 Terdiri dari dua rantai berat (heavy chain = H) dan dua

rantai ringan (light chain = L).
 Rantai H IgG () memiliki massa molekul sekitar 50 –
55 kDa, sementara rantai H IgM (μ) memiliki massa
molekul sekitar 65 – 70 kDa.
 Rantai L (dengan massa molekul 20 – 25 kDa)
memiliki isotype kappa atau lambda dan ditemukan
berikatan dengan seluruh kelas rantai H.
 Rantai peptida ini berikatan melalui ikatan non-kovalen
dan jembatan kovalen disulfida. Ikatan disulfida ini
relatif terekspos dan oleh karena itu dapat mudah di
reduksi atau oksidasi.
 Domain konstan (Fc) IgG dan IgM dapat
berinteraksi dengan sel dan sistem efektor
dalam tubuh, dan domain variabel (Fab) nya
dapat berinteraksi dengan antigen.
 Lokasi pada struktur antigen tempat berikatan
dengan antibodi disebut ‘epitope’ atau disebut
‘antigenic determinant’, sedangkan lokasi pada
struktur antibodi yang dapat berikatan dengan
antigen disebut ‘paratop’.
IgG and IgM

IgG IgM
 Specificity and Selectivity

 Monoclonal Antibody
 Polyclonal Antibody
 Recombinant Monoclonal Antibody
KELEBIHAN ANTIBODI MONOKLONAL
DIBANDINGKAN POLIKLONAL

 Dapat menjamin keseragaman kandungan antibodi yang

dihasilkan karena berasal dari satu jenis klon saja yang diproduksi
secara berulang dari suatu kumpulan sel hibrid yang telah
diseleksi sebelumnya.
 Mengurangi kemungkinan terjadinya reaksi silang atau reaksi non-
spesifik seperti yang dapat terjadi pada penggunaan antibodi
poliklonal.
 Kekuatan atau afinitas kecepatan reaksi antigen-antibodi
monoklonal umumnya lebih kuat dibandingkan dengan ikatan
antigen-antibodi poliklonal.
 Proses pemurnian lebih mudah karena relatif lebih sedikit jenis
kandungan antibodinya.
 Dapat digunakan untuk tujuan terapi yaitu antara lain untuk
perbaikan overdosis obat, mengurangi resiko transplantasi organ,
deteksi tumor metastasis, dan sebagai obat target sitotoksik.
Teknik lain untuk produksi
antibodi monoklonal
 Teknologi Antibody Expression Libraries, yaitu konstruksi
cDNA dari mRNA yang diisolasi dari sel B manusia atau
murine
 Gen IgG diamplifikasi dengan cara PCR, lalu rantai berat dan
ringan nya dikonstruksi dengan cara digesti dan insersi ke
dalam bakteriofaga atau plasmid yang sesuai.
 Rekombinasi random terjadi , lalu diekspresi di dalam bakteri,
skrining dengan western blot
 Klon yang positif diisolasi dan diperbanyak untuk menghasilkan
antibodi Fab yang murni
 Mudah melakukan kimerisasi, perubahan afinitas,dan
modifikasi fungsi efektor
 Penggunaan Prinsip reaksi
Antigen-Antibodi di bidang
Farmasi

 Clinical Diagnosis , misalnya Serodiagnosis

untuk Penyakit Infeksi
 Drug Monitoring and Toxicology
 Cancer Research
 Proteomic Study
KINETIKA INTERAKSI
ANTIGEN-ANTIBODI
Antigen-Antibody Interaction
Prinsip ELISA (Enzyme Linked-Immunosorbent Assay)

Konjugat
Antigen
enzim pada
Ag-Ab
Kompleks Ag-
Antibodi Ab
Substrat

Reaksi Produk
enzimatik berwarna
Kinetika reaksi Antigen-Antibodi
 Reaksi reversibel

k1
Ag + Ab Ag-Ab
k2

k1 dan k2 adalah konstanta laju asosiasi dan disosiasi

Laju pembentukan kompleks Ag-Ab :

d (Ag-Ab) = k1(Ag) (Ab) – k2 (Ag-Ab)

dt

(AgAb)
k1/k2 = = K (konstanta kesetimbangan)
(Ag) (Ab)

Bila antibodi memiliki aviditas atau afinitas tinggi, maka K tinggi,

demikian sebaliknya
B/F (rasio terikat
dan bebas)
Bila F adalah antigen bebas, dan B
5.00 adalah antigen yang terikat, Abx
adalah konsentrasi awal Ab,maka
pada kesetimbangan :
K = k1/k2 = (Ag-Ab)/(Ag)(Ab)
= B / F [(Abx)-B]

Jadi B/F = K [(Abx)-B]

0
B (terikat)
5.00

Slope = -K, potongan dgn

x adalah b, potongan dgn y
adalah Kb
Reaksi pada permukaan bahan padat
dan cair
 Kebanyakan metode imunokimia yang ada
dibuat dalam media/fase padat (solid phase)
untuk memudahkan proses pemisahan dalam
percobaan yang heterogen
 Ketika antigen diimobilisasi pada fase padat,
ikatan antibodi tergantung pada laju difusi dan
ikatan pada konsentrasi diatas 1 pmol/cm2
dipengaruhi oleh interaksi sterik
 Reaksi pada fase padat memiliki laju reaksi
intrinsik dan reaksi balik yang lebih kecil
dibandingkan reaksi di dalam larutan
 Oleh karena itu reaksi Ag-Ab pada fase padat-
cair secara praktis merupakan reaksi
irreversibel
Parameter analisis
 Sensitivitas
 Spesifisitas
 Selektivitas
Hal yang mempengaruhi parameter :
 Reaksi silang
 Adanya senyawa yang mempengaruhi
aviditas reaksi Ag-Ab, misalnya garam, urea
Bagaimana menentukan jenis
analisis imunokimia berlabel?
 Reaktan apa yang akan diberi label, antigen
(analit) atau antibodi?
 Apakah antigen atau antibodi yang akan
ditentukan?
 Apakah analisis kompetitif atau non-
kompetitif?
 Apakah sistem analisis homogen atau
heterogen?
Pengelompokkan jenis analisis
imunokimia
1. Analisis kompetitif untuk antigen/hapten dengan
analit yang diberi label
2. Analisis kompetitif untuk antigen/hapten dengan
antibodi yang diberi label
3. Analisis imunokimia yang tergantung pada deteksi
langsung kompleks imun
4. Analisis imunokimia dengan melibatkan label dan
reaksi khusus yang berlebih
5. Analisis imunokimia untuk mengukur antibodi
spesifik
6. Analisis imunokimia yang melibatkan pereaksi
berlabel dimana hasil reaksi Ag-Ab merupakan
penguatan sinyal
1. Analisis kompetitif untuk antigen/hapten
dengan analit yang diberi label : Analisis ini
mirip dengan analisis radiokimia klasik, melibatkan
penggunaan sejumlah terbatas antibodi. Analit dapat
dilabel dengan senyawa radioaktif, fluoresensi,
luminesensi atau enzim.
2. Analisis kompetitif untuk antigen/hapten
dengan antibodi yang diberi label : analisis
ini berguna ketika antigen atau hapten yg dilabel
memiliki sifat yang kurang menguntungkan, misalnya
kelarutan yang rendah dalam medium reaksi. Dalam
reaksi digunakan analit imobilisasi dengan jumlah
tetap dan terbatas. Sensitivitas reaksi tergantung
pada afinitas antibodi berlabel
3. Analisis imunokimia yang tergantung
pada deteksi langsung kompleks imun:
analisis yang dilihat langsung yaitu presipitasi,
turbidimetri, aglutinasi, perhitungan partikel
4. Analisis imunokimia dengan melibatkan
label dan reaksi khusus yang berlebih:
analisis sandwich seperti 2-site immunometric
assay, dan ELISA. Analit diinkubasi dengan
antibodi berlabel dalam jumlah berlebih, antibodi
yang tidak berikatan akan dibuang
1. Analisis imunokimia untuk mengukur
antibodi spesifik : analisis ini melibatkan
antigen amobil berlebih pada fase padat untuk
menangkap antibodi spesifik di dalam sampel.
2. Analisis imunokimia yang melibatkan
pereaksi berlabel dimana hasil reaksi Ag-
Ab merupakan penguatan sinyal: analisis
ini termasuk imunokimia homogen untuk
memberikan efek 100% modulasi sinyal dari label
yang digunakan
Reaksi Imunokimia dengan jumlah
antibodi berlebih (tipe I)
 Analit + antibodi → kompleks Ag-Ab → sisa antibodi
 Sensitivitas maksimum dicapai pada jumlah antibodi
yang tidak terhingga
 Sensitivitas adalah 1 molekul analit (teoritis)
 Antigen yang dapat bereaksi silang berpotensi
reaksi seimbang dengan sistem antibodi berlebih
 Reaksi antigen-antibodi hanya sedikit dipengaruhi
oleh senyawa seperti garam atau urea
 Waktu analisis relatif cepat dengan antibodi berlabel
2-site immunometric sandwich assay
(non-kompetitif untuk Ag polivalen)

inkubasi
pencucian

Ab1 Ag

Ab2 berlabel

Pencucian ditambahkan
dan inkubasi berlebih

Ukur aktivitas labelnya

Reaksi Imunokimia dengan jumlah
antigen berlebih (tipe II)

 Analit + antibodi → kompleks Ag-Ab → sisa antigen

 Sensitivitas maksimum dicapai ketika konsentrasi
antibodi mendekati 0
 Penjenuhan ini diatur oleh konstanta kesetimbangan
 Sensitivitas tergantung pada konstanta afinitas
antibodi
 Sensitivitas maksimum 10-14 mol/liter (teoritis)
 Antigen yang dapat bereaksi silang akan
menunjukkan kekuatan relatifnya tergantung pada
laju konstanta kesetimbangan antara analit dan
antigen cross-reactant tersebut
 Reaksi dalam percobaan lambat karena
kesetimbangan harus tercapai
Imunokimia kompetitif dengan
analit berlabel

+
+ +
Ag
Ag-berlabel Ab

Analit berlabel berkompetisi dengan antigen tidak berlabel untuk

berikatan dengan antibodi.Aktivitas spesifik dari fraksi analit berlabel
yang terikat dgn antibodi berbanding terbalik dengan konsentrasi analit
bebas
Sensitivitas metode
 Kesalahan eksperimen paling besar kira-kira
17%
 Konstanta kesetimbangan antibodi kira-kira
10-11 liter/mol
 Sensitivitas tertinggi (limit deteksi) kira-kira
10-13 mol/liter (kira-kira 108 molekul per mL)
 ANALISIS
IMUNOKIMIA
DENGAN LABEL
NON-RADIOAKTIF
Karakteristik suatu label untuk
analisis imunokimia

 Memiliki aktivitas spesifik

 Mudah dideteksi

 Tidak berbahaya
Aktivitas spesifik label
berhubungan dengan :

 Fraksi pada label yang akan digunakan untuk

deteksi
 Derajat amplifikasi
 Efisiensi deteksi
Syarat Enzim yang ideal
sebagai label
 Memiliki aktivitas tinggi pada konsentrasi (Km
rendah)
 Stabil pada kondisi reaksi (biasanya pH netral)
 Mudah dikonjugasi ke molekul lain untuk reaksi
lanjutan atau dalam penyimpanan
 Tersedia dalam keadaan murni (high purity)
 Harga murah
 Mudah dideteksi dengan cara yang sederhana
 Tidak terdapat di dalam cairan sampel biologi yang
akan diuji
 Contoh enzim sebagai label

Enzim dan pH optimum Aktiv.spes BM

sumber (U/mg, 37 C)

Alkalinfosfatase 8-10 1000 100.000

(usus sapi)
-galaktosidase 6-8 600 540.000
(E.coli)
HRP (lobak) 5-7 4500 40.000

Enzim lain : amilase, katalase, urease, xantin-oksidase, heksokinase, adenosin

deaminase, invertase, -laktamase, dll.
Enzim dan sumbernya
 B-galaktosidase Escherichia coli
 Peroksidase Lobak
 Glukosa oksidase Aspergillus sp.
 A-amilase Bacillus subtilis
 G6PDH Leoconostoc mesenteroides
 MDH Lactobacillus arabinosus
 Heksokinase Saccharomyces sp.
 Propionil-CoA-karboksilase Saccharomyces sp.
 Lisozim Egg-white
Senyawa berfluoresensi
sebagai label
 Pada saat molekul fluoresensi dieksitasi oleh sinar
terpolarisasi, polarisasi sinar yang teremisi
tergantung pada rotasi acak yang terjadi selama
proses eksitasi
 Semakin kecil molekul, makin cepat rotasi yg terjadi
dan sinyal semakin kecil
 Pada IFA, senyawa fluoresensi sebagai label yang
terkonjugasi dengan Ag atau Ab, akan tereksitasi,
lalu setelah ikatan Ag-Ab, rotasi diperlambat, dan
polarisasi meningkat
 Oleh karena itu, untuk label ukuran dan rotasi label
bebas menjadi hal yang penting, karena akan
mempengaruhi polarisasi label yang terikat
Syarat ideal Senyawa
Fluoresensi sebagai label
 Memiliki intensitas fluoresensi yang tinggi
(absorptivitas molar tinggi)
 Stoke shift > 50 nm untuk mengurangi
pengaruh “latar belakang” (background)
akibat scattering
 Larut dalam air
 Mudah dikonjugasi dengan molekul lain
 Harga murah
Contoh label fluoresensi
Fluorofor Quantum Lifetime (ns) Emisi/eksita Absorptivitas
yield si (nm) (liter/mol)

Dansil 0,3 14,0 480-520/340 3,4x10 3

klorida
Fluoresein 0,85 4,5 520/492 7x10 4
isotiosianat
Rhodamin B 0,7 3,0 585/550 1,2x10 4
isotiosianat
 Senyawa kelat dari logam lantanida saat ini
banyak digunakan untuk label fluoresensi
 Europium, terbium, samarium, memiliki emisi
fluoresensi yang panjang (mikrodetik sampai
milidetik)
 Dapat menghilangkan pengaruh background
Reaksi silang (cross-reaction)
 Ketepatan suatu analisis tergantung pada
spesifisitas nya
 Reaksi Antigen-Antibodi bersifat spesifik,
namun dapat pula terjadi reaksi silang, yaitu
reaksi dengan sebagian atau seluruh struktur
kimia dari analit lain
 Reaksi silang dievaluasi dengan cara
membandingkan kemampuan masing-masing
analit terhadap ikatan dengan label
 B (%)

100

50 Cross-reactant
Std

Log konsentrasi
x1 x2

% reaksi silang = konsentrasi Std (x1) / konsentrasi cross-reactant (x2) x 100%

Perkembangan metode
Imunokimia
 Penggunaan sintetik peptida untuk epitop spesifik
pada Ag virus
 Metode Scintillation Proximity : Radioimunokimia
menggunakan fluomicrosphere yang dilapisi dengan
Ab atau reseptor. Fluomicrosphere ini akan
menghasilkan sinyal bila Ab atau molekul reseptor
berikatan dengan ligand yang dilabel dengan
radioaktif (3H atau 125I)
 Metode Idiometrik (Idiometric assay) : non-kompetitif
untuk pengukuran senyawa molekuler yang kecil
 Ultrasensitive two-site enzyme immunoassay
Metode Scintillation Proximity
Radiasi

FI A + L* FI A L*

sinar

Suatu Ligand radioaktif berikatan dengan molekul akseptor (A)

yang terikat pada molekul fluomikrosfer, yang setelah diradiasi
akan memancarkan sinar
Metode Idiometrik
 Pada metode ini digunakan tambahan dua jenis
antibodi “anti-idiotipik” (anti-idiotypic antibody) selain
antibodi utama
 Antibodi anti-idiotipik alfa dan beta
 Alfa akan mengenali epitop dalam daerah variabel
Ab utama, dan tidak sensitif terhadap ada atau
tidaknya analit pada situs ikatannya
 Beta akan berkompetisi dengan analit pada bagian
paratop (daerah ikatan Ag pada Ab)
 Biasanya digunakan untuk antigen kecil , misalnya
estradiol
Ultrasensitive two-site enzyme
immunoassay
 Untuk mengukur kadar antigen yang sangat
kecil :
 Chorionic gonadotropin dalam serum atau plasma
(pada kasus tumor)
 Thyrotropin dalam serum darah
 Luteinizing hormon dalam serum darah anak-
anak
 Growth hormon