ANALISIS IMUNOKIMIA ANALISIS IMUNOKIMIA UNTUK DETEKSI MIKROBA UNTUK DETEKSI MIKROBA PATOGEN DAN SENYAWA PATOGEN DAN

SENYAWA RACUN RACUN

Marlia Singgih Wibowo Sekolah Farmasi-ITB

Uji kehamilan menggunakan kit

Test Mikroba patogen

Analisis Imunokimia

Imuno (basis : sistem imun mamalia) Kimia (reaksi kimia)

Analisis Imunokimia
Analisis berdasarkan reaksi spesifik antara Antigen (Ag) dan Antibodi (Ab) Analisis kualitatif maupun kuantitatif Penggunaan senyawa label untuk visualisasi reaksi

Apakah Antibodi&Antigen itu?

Reaksi spesifik antara Antigen (Ag) dan Antibodi (Ab)

Ab dibentuk berdasarkan Ag yang menginduksinya

Antigen (antibody generator)

Imunogenik : Senyawa yang dapat memicu sistem imun mamalia Antigenik : senyawa yangdapat bereaksi spesifik dengan antibodi Syarat : BM tinggi (>5000), struktur kimia kompleks. (bila BM rendah dapat dikonjugasi dengan protein carrier agar bersifat imunogenik)

Bahan yang dapat dianalisis (sebagai Antigen) dengan metode imunokimia

Mikroba patogen dan atau toksin mikroba Toksin tanaman, hewan Protein spesifik atau senyawa lain yang berstruktur spesifik Senyawa obat (narkotik, psikotropik) Senyawa pestisida

Contoh obat XTC

Antibodi
Hasil reaksi humoral sel B dalam limpa mamalia Spesifik terhadap antigen yang memicunya Imunoglobulin : IgA, IgD, IgM, IgE, IgG

Struktur IgG dan IgM

IgG

IgM

Prinsip Reaksi
Reaksi imunologi di dalam mamalia :
Label Ag Ab Reaksi primer

Reaksi sekunder

(Fiksasi komplemen, aglutinasi, presipitasi)

Reaksi tersier (degranulasi,opsonisasi)

Visualisasi Reaksi Ag-Ab

SUBSRAT PRODUK (dapat divisualisasi)

Kompleks Ag-Ab-Label

Senyawa LABEL
Senyawa yang dikonjugasi pada antigen atau antibodi untuk dapat mem-visualisasi reaksi Ag-Ab Dapat berupa enzim, senyawa berfluoresensi, radioaktif, dll. Reaksi amplifikasi dapat dilakukan sehingga dapat diukur secara fisikokimia

Beberapa contoh label

Enzim : Horse radish peroxidase (HRP), Alkaline Phosphatase Senyawa berfluoresensi : Fluorescein, Umbelliferon, Tetrametil rodhamin Senyawa Luminescence : Luciferin Partikel : Tanned erythrocyte, Colloidal, microsphere , gold, silver Vesikel : liposom

Metode analisis imunokimia berdasarkan labelnya

EIA (Enzyme ImmunoAssay) ELISA (Enzyme LinkedImmunosorbent Assay) RIA (Radio ImmunoAssay) IFA (ImmunoFluorescence Assay) LIA (Luminescence ImmunoAssay)

Bahan yang diperlukan dalam reaksi AgAb dalam analisis imunokimia

Antigen Antibodi Media penyangga reaksi Larutan Dapar pelarut Larutan Dapar pencuci Senyawa Label Substrat Senyawa penghenti reaksi Instrumen pendeteksi hasil reaksi

Suatu larutan atau suspensi antigen (dapat pula dilakukan sebaliknya yaitu dengan memasukkan antibodi terlebih dahulu) dimasukkan kedalam sumur pelat solid, lalu diinkubasi pada suhu tertentu selama waktu tertentu pula (sesuai dengan jenis antigen dan antibodi yang digunakan), lalu ditambahkan larutan pemblok untuk menghindari ikatan non-spesifik

Larutan antibodi B (anti-antigen A) dimasukkan kedalam sumur pelat tersebut setelah proses pencucian. Kompleks A-B akan terbentuk dengan kuat. Suatu konjugat antibodi C (anti-antibodi B) dengan suatu Label (misalnya suatu Enzim) ditambahkan sehingga akan membentuk kompleks A-B-C-Enz.

Penambahan substrat tertentu akan menyebabkan terbentuknya warna dan reaksi warna dihentikan dengan penambahan senyawa lain agar warna yang terbentuk stabil pada saat pengukuran.

Warna yang terbentuk diukur intensitasnya dengan menggunakan alat spektrofotometer. Konsentrasi yang terukur akan sebanding dengan antigen yang terikat pada reaksi yang terjadi

Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam menggunakan kit pereaksi imunokimia: Apakah kit tersebut dilengkapi dengan brosur /booklet yang lengkap tentang metode analisis yang digunakan? Apakah sudah ada parameter evaluasi dan validasi yang dilakukan ? Mengevaluasi sumber-sumber kesalahan yang mungkin terjadi Seleksi awal kit pereaksi : pada tahap ini perlu dilakukan

Seleksi awal kit pereaksi : pada tahap ini perlu dilakukan evaluasi terhadap kurva standard dan apakah ada reduksi data yang dilakukan, Parameter evaluasi : accuracy, precision,

sensitivity, selectivity, specificity

Memahami prosedur percobaan : Efek matriks, perolehan kembali, reaksi silang, pengaruh dan penanganan sample, modifikasi prosedur, modifikasi teknis assay. Pengembangan data validasi : rentang normal, uji terhadap kondisi abnormal, stimulasi, supresi, rentang QC

Sumber kesalahan dalam analisis imunokimia

Kesalahan Random/Acak (imprecision) Kesalahan sistemik (inaccuracy)

Kesalahan acak
menggunakan dan hal teknis dalam penggunaan pipet (volume yang dikeluarkan, dll) Pemisahan padatan dari cairan : proses pembtkn endapan yang tergantung pada waktu, kecepatan, suhu, dll, pencucian yang tidak sempurna, dll. Kondisi Reaksi Biokimia : konstanta kesetimbangan antibodi, waktu, suhu Jumlah radioaktif : untuk proses RIA Intensitas fluoresensi yang terjadi : untuk proses IFA Kesalahan spektrofotometrik Stabilitas pereaksi

Pipeting : masalah desain pipet itu sendiri, cara

Kesalahan sistem
Kesalahan mempipet : masalah kalibrasi alat, bentuk pipet, dll Interferensi dalam reaksi : terjadinya nonspecific binding, inhibisi enzim, pendaran cahaya, adanya pengaruh enzim endogen, pengaruh obat lain yang digunakan , pengaruh senyawa endogen lainnya (bilirubin, dll) Efek matriks