HASANAH

6.13.0008
 Immunoassay

Sistem pemeriksaan yang mempergunakan satu atau lebih

produk atau reagen imunologik
Prinsip dasar: ikatan antara molekul imunoglobulin (Ab)
dengan antigen (Ag)
Hasil interaksi Ag – Ab (kompleks imun) harus terlihat
dan dapat diukur
Dasar

Reaksi Ag dengan Ab spesifik

Tujuan
Mendeteksi keberadaan Ag dalam serum memakai Ab
spesifik
Mendeteksi keberadaan Ab dalam serum memakai Ag yang
sesuai
 Manfaat
1. Menentukan status imunitas
2. Memperkirakan prevalensi penyakit
3. Mengetahui adanya invasi
mikroorganisme, jika isolasi kuman
tidak dapat dilakukan
4. Menunjang diagnosis penyakit
Macam :
1. Uji kualitatif hasil + / -
2. Uji kuantitatif hasil kadar

Pengenceran tertinggi hasil +

(uji semikuantitatif)
Contoh :
 pengenceran 1 dalam 8: 1 vol serum +7 vol
pengencer: titer 1/ 8 sampel diencerkan 8 X
 Bahan pemeriksaan
Serum, plasma, urin
Plasma hanya untuk pemeriksaan tertentu saja.
Puasa: untuk metode aglutinasi.
Serum harus dihindarkan dari hemolisis, lipemik &
kontaminasi bakteri (pengiriman < 2 jam)
Disimpan dalam
Suhu 2 – 8oC : 48 jam
-20oC s/d - 70oC: > 48 jam
Diberi label
 Teknik Pemeriksaan Imunoserologi

Non
1. Imunopresipitasi
Labelling 2. Aglutinasi, flokulasi
3. Fiksasi komplemen
4. Radioimmunoassay (RIA)
5. Enzyme immunoassay (EIA) atau
Enzyme linked immunosorbent assay
Labelling
(ELISA)
6. Immunofluorescent (IF)
7. Immunochromatographic technique (ICT)
 Interaksi Antigen-Antibodi

Interaksi primer:
Pengikatan Ag-Ab tingkat molekuler
Memerlukan indikator/label (isotop, enzim, floresen)
Sesuai utk pengukuran Ag/Ab dgn kadar yg rendah

Interaksi sekunder:
Reaksi Ag-Ab bisa secara langsung atau dgn bantuan
komplemen
Prinsip dasar : reaksi presipitasi/ aglutinasi
Bila partikel Ag terikat latex atau eritrosit → aglutinasi
Primary immune phenomena

Ag Ab Kompleks Imun

Secondary immune phenomena

IMUNOASSAI
NON LABEL
 1. Imunopresipitasi
Interaksi sekunder → Ag-Ab komplek tdk larut
(presipitat)
Media : cair atau semisolid (gel)
Faktor yg mempengaruhi :
 Aviditas Ab → stabilitas komplek Ag-Ab
 Suhu (optimal 0-37o C)
 pH (netral = 6-7,5), pH < 6 ; >7,5 → mudah
disosiasi
 Molaritas (molaritas < 0,15 M) ; >0,15 M → men-
cegah presipitasi
 Imunopresipitasi
…

Pembentukkan presipitat terjadi apabila

konsentrasi Ag dan Ab seimbang (zona ekivalen =
ZE)
Konsentrasi Ag berlebih → Komplek Ag-Ab yg
terbentuk larut kembali disebut postzone effect
Konsentrasi Ab berlebih → Komplek Ag-Ab yg
terbentuk tetap larut disebut prozone effect
ZE sempit → Ag bersifat mudah larut
ZE lebar → Ag bersifat tdk mudah larut, BM
besar, & multikomponen Ag
 Ekses antibodi Seimbang Ekses antigen
PRESIPITASI ANTIGEN-ANTIBODI

Prozone KONSENTRASI ANTIGEN Postzone

 2. Aglutinasi

Umumnya : Ag bentuk partikel + Ab spesifik →

Aglutinasi
Reaksi 2 tahap :
1. Ab dgn salah satu antigen binding site (Fab) bereaksi dgn
Ag
2. Fab yg lainnya berikatan dgn Ag lain yg sudah berikatan
dgn Ab gumpalan (lattice)
Aglutinasi lebih mudah terjadi pada IgM o/k pentamer
dibanding IgA dan IgG
 Ag Ab K.I

Tahap I
+

Tahap II Aglutinasi
Contoh-contoh pemeriksaan aglutinasi
1. Aglutinasi direk
2. Aglutinasi indirek (pasif)
3. Aglutinasi pasif terbalik
4. Hambatan aglutinasi
 3. Fiksasi komplemen
 Tahap :

1. Pengikatan sejumlah komplemen oleh kompleks Ag –

Ab
2. Penghancuran Eritrosit yg telah dilapisi hemolisin oleh
komplemen
 Interpretasi :

 +
tidak hemolisis
 _ hemolisis
 Contoh : Deteksi tripanosoma, virus
 Tes Fiksasi Komplemen
Fiksasi komplemen Sistem hemolitik

Eritrosit
Ag

+
c + +
+ Hemolisin tidak hemolisis
? Ab

Eritrosit

Ag
+ +
+ +
c Hemolisin

C - Komplemen
hemolisis
 Imunoasai berlabel

 Imunoassai yang menggunakan indikator utk melacak Ag

atau Ab dengan konsentrasi rendah
 Mampu melacak interaksi primer Ag-Ab (initial binding)
 Sensitifitas analitik lebih tinggi dibanding imunoassai non
label
 Label yg digunakan :
 isotop : I125, H3, C14
 non isotop : enzim (ALP, HRP), floresen (fluorescein,
rhodamine), kemiluminesen
 Selain uji kuantitatif, dpt digunakan pada uji kualitatif (ANA
tes, antitiroid Ab)
 Imunoassai Berlabel

Imunoassai berlabel homogen

Sinyal kadar analit diperoleh langsung dari reaksi ikatan
label dgn analit
Tidak memerlukan separasi Ag terikat dan Ag bebas (B/F)

Imunoassai berlabel heterogen

Sinyal kadar analit diperoleh secara tdk langsung
Memerlukan seperasi B/F
Lebih sensitif dibandingkan imunoassai homogen
Imunoasai kompetitif
● Ab label dan analit direaksikan sekaligus terhadap Ag

Imunoasai non kompetitif

● Ag analit yg diukur terikat antara Ab phase solid &
label Ab
● Lebih sensitif dibandingkan metode kompetitif
Imunoasai Berlabel

1. Radioimunoassai (RIA/IRMA)
2. Imunofloresen (IF)
3. Enzyme Imunoassay (EIA/ELISA)
4. Imunokromatografi (ICT)
 1. Radioimunoasai

● Immunoassay berlabel radioisotop  membedakan Ag

yang terikat Ab dengan Ag bebas.
● Sensitif & spesifik untuk ttk kadar bahan yang amat
rendah dalam serum
● Yang diukur : - γ-ray → I125
- β particle → H3

Radiolabel pada imunoassai dibagi 2 kelompok:

a.Radioimmunoassay (RIA): radiolabelisasi pada Ag
b.Immunoradiometric Assay (IRMA): radiolabelisasi pada Ab
● Kerugian:
 Bahaya efek radiasi bahan radioaktif
 Waktu paruh reagen singkat, γ dan β counter mahal

● Keuntungan:
 Presisi baik and high sensitivity
 Isotope conjugation lebih mudah
 Signal detection tanpa optimalisasi
 Lebih stabil terhadap interferensi environment (pH, suhu)
 Prinsip dasar RIA

cuci
Ab pd fase Ag
padat berlabel Ag

Radiaton
counter
 2. Imunofloresen assay (IFA)

 Merupakan teknik untuk deteksi Ag/Ab pada cairan tubuh

atau jaringan/sel
 Prinsip :
Molekul yg mampu menyerap energi radiasi dan
memancarkannya kembali dlm btk cahaya (floresensi)
 Memerlukan alat fluorometer/mikroskop
 Menggunakan label:
• Fluorescein → warna hijau
• Rhodamin → warna merah
Imunofloresen assay
Immunoassay dengan menggunakan label enzim
Enzyme
Relatif immunoassay
murah, banyak tersedia, reagen bertahan lama,
mudah diotomatisasi, peralatan yang relatif murah

Enzim yang digunakan dipilih berdasakan jumlah

molekul substrat yang dapat dirubah per satu molekul
enzim, mudah dan cepat mendeteksi serta stabil.
Dibaca dengan alat :
Spektrofotometer ( λ = 492 m) → microELISA
reader
Fluorometer/Luminometer
 Kerugian:
 Reaksi enzim lebih kompleks dari pada label isotop
 Masih dipengaruhi faktor environment (plasma
constituents)

 Keuntungan:
 Mudah dikerjakan
 Relatif murah, simultan dgn pemeriksaan yg lain
 Bahaya radioaktif (-)
One-step sandwich EIA
Imunokromatografi
 Lateral flow test
Imunokromatografi
 Membacanya cukup dgn mata saja
 Tidak membutuhkan substrat
 Penggunaan colloidal gold waktu inkubasi
pendek (<15 menit)

Kerugian :
 Nitrocelulose membrane tdk stabil pada suhu
↑
Keuntungan :
 Prosedur cepat (<15 menit) dan praktis
 Nilai diagnostik baik
 Stabil untuk jangka panjang
 Relatif tidak mahal
Prinsip dasar ICT

A. Melacak Analit (Ag)

a. Reaksi langsung (Double Antibody Sandwich)/Asai
Imunometrik  untuk melacak analit yang besar dan
memiliki > 1 epitop (LH,hCG dan HIV)
b. Reaksi kompetitif/Hambatan kompetitif (competitive
Inhibition)  untuk melacak molekul kecil dengan
epitop tunggal

B. Melacak Ab  Indirect Assay