Imunokimia

Sistem Imun
• Sistem imun merupakan serangkian peristiwa
kompleks yang melindungi individu dari zat
yang berasal dari luar tubuh dan kemungkinan
akan menimbulkan bahaya
• Zat asing yang masuk ke dalam tubuh yang
dikenali oleh sistem tubuh disebut antigen
• Bagian struktur antigen yang dikenali oleh
sistem imun disebut epitop/antigen
determinan
 Antigen
• Merupakan zat asing
• Mempunyai waktu paruh yang cukup panjang untuk
menimbulkan respon dari tubuh.
• Biasanya mempunyai berat molekul besar (mis 10.000,
molekul lebih kecil disebut hapten dan dapat berikatan
ataupun tidak berikatan dengan molekul karier yang lebih
besar,
• Memiliki struktur yang kompleks
• Antigen biasanya berupa molekul organik yang besar seperti
protein, polisakarida atau glikoprotein atau glikolipid, tapi
jarang berupa lipid atau asam nukleat,
 Antibodi
• Antibodi berupa senyawa glikoprotein
(imunoglobulin) yang disekresi sel plasma
• Antibodi dihasilkan tubuh sebagai respon
terhadap masuknya antigen ke dalam tubuh
• Antibodi ( anti-binding site) mengenali antigen
dan berikatan dengan antigen (epitop)
 Reaksi Antigen-Antibodi
• Antibody-binding site = Bagian molekul antibodi
yang dapat membentuk ikatan dengan antigen
selama reaksi antigen-antibodi berlangsung.
• Determinan antigen = Bagian antigen yang
dapat berikatan dengan antibody-binding site
• Spesifisitas reaksi antigen-antibodi = derajat
pengikatan antibodi terhadap antigen tertentu
(mis. homolog antigen) tanpa berikatan dengan
molekul lain yang strukturnya sama
 Reaksi Antigen-Antibodi
• Afinitas antibodi = Kekuatan ikatan antara determinan antigen
(atau hapten) dengan suatu binding site dari antibodi tunggal.
Afinitas ikatan suatu antibodi dinyatakan dengan Tetapan Kesetim-
bangan (K), sebab ikatan non-kovalen antara antibodi dan antigen
bersifat reversible.

K = [Ab-Ag] / [Ab][Ag] = k1 / k2
k1
Ab + Ag Ab-Ag
k2
 Evaluasi Sistem Imun
• Difusi
• Elektroforesis
• Western Blot
 Difusi
• Evaluasi sistem imun dengan metoda ini
berdasarkan kemampuan campuran antigen-
antibodi untuk mengendap
• Metoda ini dapat digunakan untuk analisis
kualitatif (single immunodiffusion dan double
immunodifusion) dan analisis kuantitatif
(radial immunodiffusion/RID)
 Single Immunodiffusion
• Larutan antigen dimasukan kedalam lubang
pada suatu matriks semisolid (eg. Agar) yang
telah mengandung antibodi, selanjutnya akan
terbentuk daerah endapan yang opak, yang
bentuknya tergantung pada berat molekulnya.
• Digunakan untuk analisis kualitatif
Ingle Immunodiffusion
Single Immunodiffusion
 Double Immunodiffusion
• Larutan antigen dan antibodi dimasukan ke dalam
dua lubang terpisah dan dibiarkan berdifusi,
sehingga kedua larutan bersatu dan membentuk
endapan hasil reaksi antigen-antibodi
• Lokasi dan pola endapan dibandingkan dengan
sampel pasien.
• Metoda ini dapat digunakan untuk identifikasi
rheumatoid arthritis (anti-RANA) dan systemic
lupus erythematosus (anti-SM)
Double Immunodiffusion
 Radial Immunodiffusion
• Antibodi yang sangat spesifik didispersikan
dalam gel (agarose) dan dipisahkan, antigen
berdifusi dari lubang dengan kadar yang terus
meningkat secara terkontrol, dan kondisi
konstan.
• Dengan adanya kelebihan antibodi zona
endapan (diameter) yang terbentuk
proporsional dengan konsentrasi antigen
dalam lubang
Radial Immunodiffusion
 Elektroforesis
• Dapat digunakan untuk menskrining serum
protein
• Beberapa teknik elektroforesis diantaranya :
– Immunoelektroforesis (IEP)
– Immmunofixation (EIF)
 Immunoelektroforesis
• Serum / protein cairan spinal dipisahkan pada
media selulosa asetat atau agarose
• Konstituen hasil pemisahan didifusikan
melewati media yang mengandung antibodi
dari konstituen serum tersebut
• Terbentuk precipitin (endapan) saat jumlah
antibodi-antigen setimbang, selanjutnya pelat
dicuci dan ditandai
IFE
 Immunoelektroforesis
• Protein diidentifikasi dengan mobilitas
elektroforetik, difusi dan spesifitas antibodi
• Digunakan untuk mengevaluasi protein
myeloma, abnormalitas struktur protein,
ketiadaan antigen protein atau untuk
menskrining kompleks imun
Immunoelektroforesis
 Immunofixation
• Aliquot serum/urin/CSF dielektroforesis dalam 6
lajur pada suatu gel agarose
• Protein pada satu lajur tetap (fixed), sedangkan
lima lajur lainnya masing-masing ditambahkan
antisera monospesifik yang berbeda-beda
• Inkubasi untuk tahap imunofiksasi, selanjutnya
gel dicuci dan ditandai, akan muncul pita
antigenik dan lokasinya akan cocok dengan pola
referens dan antisera individual
Teknik Gabungan (difusi-elektroforesis)

• Electroimmunodiffusion (EID)
• Counter-current immunoelectrophoresis (CIE)
• Rocket electrophoresis
• Crossed Immunoelectrophoresis (CRIE)
 Western Blot
• Teknik ini dapat digunakan jika jml antigen << atau medium
tidak cocok
• Antigen ditempelkan pada medium (eg. Nitroselulose)
dengan cara absorpsi atau ikatan kovalen (bloting)
• Kemudian antigen dideteksi oleh antibodi pelacak (probes),
pelacak tersebut dapat diberi label dengan senyawa
radioaktif, enzim yang dapat menghasilkan produk yang
visual, atau berflouresensi atau chemiluminescent.
• Deteksi dengan menggunakan instrumen yaitu :
spektrofotometer, fluorometer dan luminometer
 Immunoassay
• Berbagai klasifikasi immunoassay yaitu :
– Berlabel dan tidak berlabel
– Kompetitif dan non kompetitif
– Homogen dan heterogen
Immunoassay
 TEKNIK IMUNOKOMPETISI
1) Teknik dengan pemisahan [Fase Heterogen]
• ELISA [Enzyme Linked Immunosorbent Assay]

2) Teknik tanpa pemisahan [Fase Homogen]

• EMIT [Enzyme Multiplied Immunoassay Technics]
• Imunofluoresensi pada fase homogen
– Ekstinksi fluoresensi
– FPIA [Fluorescence Polarization Immunoassay]
– Polarisasi fluoresensi
– FETIA [Fluorescence Excitation Transfer Immuno-assay
 Competitive Binding Reactions
Prinsip : Pengikatan (spesifik) antigen terhadap antibodi adalah
proporsional terhadap konsentrasi antigen dalam larutan
baku (standard), pembanding (control), dan uji (sample).

Asumsi kondisi yang diharapkan :

1) Antigen dan antibodi homogen dan interaksi (kesetimbangan)
bersifat reversible.
2) Petanda antigen tidak mengganggu interaksi antigen-antibodi.
3) Antigen dan antibodi hanya membentuk komplek bimolekuler
(antigen dan antibodi bersifat univalen).
4) Komplek antigen-antibodi dapat dipisahkan sempurna dari
bentuk bebas antigen berpetanda.

Penyimpangan terhadap kondisi yang diharapkan tersebut tidak

mengubah sifat umum reaksi imunokimia kompetitif.
Imunoassay homogen dan heterogen
 Teknik dengan pemisahan
• Prinsip reaksi kompetisi dengan pemisahan
• Senyawa-senyawa petanda
Atom Radioaktif
Enzim
Molekul berfluoresensi
Kelat berfluoresensi
Substrat berfluoresensi
Luminesensi kimia

• Teknik pemisahan fraksi terikat & fraksi bebas

Pemisahan fraksi dengan PEG
Adsorpsi dengan Karbon-Dekstran
Pengendapan dengan antibodi sekunder
Pemisahan dengan antibodi terfiksasi dalam fase padat
 PRINSIP ELISA
Reaksi Imunokimia

Reaksi Indikasi SUBSTRAT

KROMOGEN

Pencucian
PRODUK
KROMOFOR

Pengukuran Sinyal

Aktivitas Enzim
DA/t

[Antigen]
 TEKNIK IMUNOKIMIA
Reaksi Imunokimia
Reaksi Antigen-Antibodi
Competitive-Binding Reactions
Teknik Label Radioaktif
Radioimmunoassay [RIA]
Immunoradiometric Assay [IRMA]
Teknik Label Enzim
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay [ELISA]
Enzyme-Multiplied Immunoassay Technique [EMIT]
Teknik Label Fluoresen
Substrate-Labeled Fluorescent Immunoassay [SLFIA]
Fluorescence Polarization Immunoassay [FPIA]
 Radioimmunoassay [RIA]
Radioimmunoassay adalah teknik imunokimia menggunakan
radioisotop untuk mendeteksi kuantitas antigen atau antibodi dalam spesimen cairan
biologis; berdasarkan pembentukan komplek Ag-Ab (endapan atau agregat tidak
larut) yang dilakukan pada kondisi optimal.

RIA merupakan immunoassay heterogen yang memerlukan tahap pemisahan secara

fisik bentuk bebas antigen berpetanda dari bentuk lain antigen berpetanda yang
terikat pada antibodi, dilakukan sebelum pengukuran radioaktivitas petanda terikat.

Teknik :
• Solid-phase attachment
• Activated charcoal separation method
• Precipitation technique
RIA
 Radioimmunoassay [RIA]
Deteksi :
Radioisotop (atom atau unsur yang mengalami peningkatan jumlah
neutron dalam intinya sehingga ketidakstabilan inti akan berubah
spontan kembali ke bentuk stabil dengan memancarkan radiasi).
Radionuklida adalah inti radioisotop tidak stabil yang dapat meman-
carkan radiasi : partikel alfa, elektron positif/negatif, sinar gamma.

%B x Logit B/Bo
x

x
x

Log konsentrasi antigen Log konsentrasi antigen

 Immunoradiometric Assay [IRMA]
Immunoradiometric assay : metode untuk menentukan kadar antigen
dalam spesimen cairan biologis menggunakan antibodi yang diberi
petanda radionuklida. Kelebihan antibodi berpetanda menunjukkan
antigen yang terdapat dalam larutan berdasarkan reaksi non-kompetitif.

Teknik :
• Two-site solid-phase assay (sandwich technique)
• One-site fluid-phase assay

Aplikasi :
Protein serum, faktor koagulasi VIII, ferritin, thyroid-binding protein,
carcinoembryonic antigen (CEA), a-fetoprotein, IgE, ACP prostat,
Antigen spesifik prostat, hormon (TSH, prolaktin, hGH, hCG urin dan
hCG serum).
IRMA
 Enzyme immunoassay [EIA]
ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)
Petanda enzim sebagai pengganti radioisotop untuk mengukur
pembentukan komplek antigen-antibodi, digunakan untuk kuantisasi
ligan berbobot mulekul besar (>30.000 dalton).
Petanda enzim terkonyugasi pada ligan, mis. antigen, antibodi spesifik
antigen tertentu,atau antibodi spesifik terhadap antibodi primer.
ELISA menggunakan solid phase, umumnya untuk reaksi kompetitif.

IEMA (immunoenzymetric assay) berdasarkan teknik sandwich untuk

reaksi non-kompetitif.

EMIT (enzyme-multiplied immunoassay technique) : metode

tanpa pemisahan dengan menggunakan petanda enzim terkonyugasi
pada hapten disertai reaksi deteksi menggunakan perubahan substrat
membentuk produk reaksi enzimatik.
 Teknik Petanda Fluoresen
SLFIA (substrate-labeled fluoresent immunoassay) : metode tanpa
pemisahan menggunakan petanda substrat fluorogen pada reaksi
enzim-substrat untuk menentukan komplek antigen-antibodi.
Banyak digunakan untuk kuantisasi TDM, hormon, IgG dan IgM serum
akibat infeksi virus.

FPIA (fluorescence polarization immunoassay) : metode tanpa

pemisahan berdasarkan reaksi kompetitif untuk menentukan hapten
berbobot molekul kecil (< 20.000 dalton). Dalam metode ini dipantau
reaksi antara hapten dan antibodi menggunakan petanda fluoresen
yang terkonyugasi pada suatu hapten.
Banyak digunakan pada pengukuran kuantitatif obat pada TDM,
drug abuse, hormon.
 Teknik Petanda DNA
Teknik hibridisasi asam nukleat digunakan pada pengukuran sampel atau spesimen kontrol
yang membentuk hibrida untai-ganda (double stranded) stabil dari DNA atau RNA untai
tunggal yang terdapat dalam spesimen, yang berinteraksi dengan untai-tunggal DNA probe
komplementer (sebagai molekul petanda).
Untuk mendeteksinya DNA probe dikonyugasi dengan petanda (radioisotop, enzim,
fluoresen, biotin) seperti pada immunoassay.

DNA probe digunakan a.l. untuk deteksi cepat dan spesifik jasad
penyebab infeksi mis. bakteri atau virus, berdasarkan keunikan deret
basa DNA di dalam genom yang berbeda dari DNA inang (host).

Contoh : Mycoplasma pneumoniae, retrovirus HIV, adenovirus, cyto-megalovirus, hepatitis

B, herpes simplex, Chlamidya trachomatis.
 TEKNIK PETANDA KELAT
BERFLUORESENSI
Pembentukan kompleks lantanida (Eu, Tb) dg molekul
organik b-diketon pembawa fluoresensi.

• Rendemen kuantik mendekati batas teoritis

• Pita emisi berdekatan
• Pergeseran Stockes lebar (270 nm:Eu, 200 nm:Tb)
• Panjang gelombang eksitasi dan emisi terdpt di luar
daerah interferensi spesimen biologi
• Masa hidup fluoresensi 50-1000 mdetik (jauh lebih
lama dari fluorofor klasik.
 TEKNIK PETANDA SUBSTRAT
BERFLUORESENSI

Fluoresensi hanya muncul setelah reaksi hidrolisis

enzimatik terhadap senyawa bertanda.
Ada 3 contoh kopel reaksi enzim :
1. Umbeliferon – Esterase
2. b-galaktosil umbeliferon – b-galaktosidase
3. Flavin Adenin Dinukleotid (FAD) – Nukleotida
pirofosfatase
 TEKNIK PETANDA LUMINISENSI KIMIA &
BIOLUMNISENSI

Terbentuk emisi sinar sebagai hasil reaksi

kimia/enzimatik terhadap substrat molekul
organik : luminol, dioksetan, turunan akridin,
imidazol.
Kelemahan : sifat hidrofob membatasi
pemakaian untuk makromolekul seperti
protein, kecuali jika hapten ber-BM kecil
akan terlarut setelah diberi petanda.