PENGUKURAN REAKSI ANTIGEN-ANTIBODI

Aglutinasi/presipitasi
Larut/
Tidak larut Larut

Antigen (Ag) + Antibodi (Ab) Kompleks AgAb

Kwantitas
Afinitas
Laju reaksi

05/17/22 1
  Aplikasi teknik imunologi dalam penelitian di laboratorium

-Aplikasi teknik imunologi di laboratorium dapat dilakukan melalui analisis

kualitatif maupun kuantitatif dari kompleks antigen-antibodi (AgAb) dengan
berbagai pendekatan prosedur teknis.

-Analisis secara kualitatif hanya berdasarkan adanya kompleks antigen-antibodi

yang dapat dilihat dari warna (visualisasi) yang dapat dideteksi dengan teknik
pelabelan antibodi dengan enzim atau senyawa fluoresen

-Analisis secara kuantitatif kompleks Ag-Ab dapat dilakukan dengan perhitungan

konsentrasi antigen atau antibodi yang digunakan, maupun komplek AgAb,
dengan pendekatan rumus:

ka
Ag + Ab AgAb Keterangan:
kd Ka = konstanta asosiasi
Kd = konstanta disosiasi
ka [Ag] + [Ab] kd [AgAb] K = konstanta equilibrium

Ka [AgAb]
K= =
Kd [Ag] + [Ab]
05/17/22 2
05/17/22 3
05/17/22 4
Antibodi mengenali antigennya pada bagian Fab (paratop) dan pengikatannya
sangat spesifik dan bersifat non-kovalen. Antibodi jenisnya bermacam-macam
tergantung dari jenis antigen yang dikenalinya.

05/17/22 5
Rasio jumlah epitope dan paratop antigen-antibodi

Dr. Gene Meyer in Male et al. Immunology 7th edition,

05/17/22 6
Pengukuran kompleks antigen-antibodi secara kuantitatif yang optimal adalah
pada daerah equevalensinya

05/17/22 7
Teknik sederhana untuk menguji adanya antibodi dalam serum yang mengenali
suatu antigen dengan menggunakan media agar. Apabila terjadi reaksi
antigen-antibodi maka terbentuk garis presipitan putih diantara keduanya.

05/17/22 8
Menentukan titer reaksi antiserum-serum (antigen-antibodi)

Dr. Gene Meyer in Male et al. Immunology 7th edition,

05/17/22 9
 Kuantifikasi konsentrasi antigen yang bereaksi dengan antibodi yang
mengenalinya dapat dilakukan dengan teknik presipitasi pada medium agar
dengan menempatkan antigen yang sudah diketahui konsentrasinya untuk
pembuatan kurva standar.
(mm)
Diameter

antigen (µg)
05/17/22 10
Kuantifikasi kompleks antigen-antibodi dengan teknik elektroforesis roket

05/17/22 11
Pengujian adanya reaksi antara antigen yang ada pada larutan dengan antibodi
yang ada dalam kantung dialisis. Dalam kondisi setimbang jumlah antigen dalam
kantung dialisis akan lebih banyak dari pada antigen dalam larutan diluarnya.

05/17/22 12
Pengukuran reaksi antigen-antibodi dengan teknik dialisis

05/17/22 13
(Lanjutan gambar sebelumnya)

05/17/22 14
05/17/22 15
(Lanjutan gambar sebelumnya)

05/17/22 16
 Teknik Imunopresipitasi

- Teknik imunopresipitasi dapat dilakukan untuk mendeteksi keberadaan

suatu antigen dalam suatu sampel, baik berupa antigen terlarut maupun tidak
larut.

- Deteksi imunopresipitasi dalam larutan, sebagai contoh: uji hormon hCG

(hormon yang menunjukkan tanda kehamilan) dalam sampel urin.
Uji ini dapat dilakunan dengan menggunakan monoklonal antibodi anti-hCG
sebagai antibodi pertama(1’) dan antibodi kedua (2’) yang sudah dilabel
enzim.

- Visualisasi komplek Ag-Ab dapat dilakukan karena Ab 1’ mengenali epitop

hormon hCG, sedangkan bagian antibodi 1’tersebut dikenali oleh antibodi 2’.

- Enzim yang ada pada antibodi 2’ apabila diberikan substratnya maka akan
mengubah bentuk substrat tadi menjadi produknya dengan memberikan
perubahan warna dalam larutan uji (lihat gambar berikut).

05/17/22 17
Deteksi hormon hCG dalam sampel urin dengan teknik imunopresipitasi

05/17/22 18
05/17/22 19
Imobilisasi antigen dan antibodi

Dr. Gene Meyer in Male et al. Immunology 7th edition,

05/17/22 20
Kompleks antigen-1antibodi-2antibodi

Dr. Gene Meyer in Male et al. Immunology 7th edition,

05/17/22 21
Detekti kompleks Ag-Ab secara langsung dan tidak langsung

Dr. Gene Meyer in Male et al. Immunology 7th edition,

05/17/22 22
05/17/22 23
Pelabelan Antibodi dengan Enzim

- Antibodi dapat dilabel dengan enzim yang terikat melalui pasangan

kovalen. Hasil yang ideal untuk terbentuknya ikatan antara pasangan
antibodi dan enzim adalah dengan rasio 1 : 1 dan tanpa kehilangan
aktivitas spesifik dari masing-masing pasangan tersebut.

- Enzim yang umum digunakan untuk pelabelan antibodi:

horseradish peroksidase (HRP), alkaline fosfatase dan -galaktosidase.

05/17/22 24
Skema pengenalan antigen oleh antibodi secara langsung dengan melabel
antibodi 1’ (A), atau tidak langsung dengan menggunakan antibodi 2’ yang
dilabel (B)

A B

05/17/22 25
Imunopresipitasi protein hasil metabolisme dilakukan dengan cara pelabelan unsur
S pada metionin dengan isotop 35S dan protein yang disintesis dipresipitasikan
dengan antibodi yang mengenali protein tertentu, selanjutnya dilakukan pemisahan
dengan teknik elektroforesis (lihat kuliah elektroforesis).

05/17/22 26
Deteksi keberadaan virus HIV dalam serum darah pasien dapat dilakukan dengan
teknik imunopresipitasi dari sampel yang diperlakukan dengan senyawa detergen
(SDS) dan dengan teknik elektroforesis (SDS-PAGE) untuk memisahkan partikel
protein virus.Keberadaan protein virus dideteksi dengan monoklonal antibodi yang
spesifik terhadap epitop dari protein virus.

(sodium dedocyl sulphate)

(lihat gambar selanjutnya)

05/17/22 27
 Pemisahan protein dengan (polyacrylamide gel electrophoresis)

05/17/22 28
Western Blot adalah teknik deteksi protein yang sudah dipisahkan dengan
SDS-PAGE, dan dipindahkan dari gel poliakrilamid ke kertas nitroselulase
(1,2 dan 3) dan diinkubasi dengan antibodi spesifik (4 dan 5)

05/17/22 29
Teknik Immunoblotting

05/17/22 30
Dot blotting dan immunodetection

05/17/22 31
Radioimmuno assay merupakan assay yang sangat sensitif yang mampu
mendeteksi nanogram/ml antigen dan banyak dipakai dalam mengukur molekul
yang kadarnya rendah, misalnya hormon, neuropeptida.

Kontrol: jumlah antigen yang dilabel bereaksi dengan antibodi yang jumlahnya cukup
(mengikat 70% antigen)

Percobaan: antigen yang tidak diketahui ditambahkan dan berebut antibodi yang dapat
mengikat antigen yang dilabel
05/17/22 32
Penentuan kadar antigen yang belum diketahui jumlahnya dengan menggunakan
antigen yang dilabel yang sudah diketahui jumlahnya berdasarkan kurva standar

05/17/22 33
  Enzyme-linked immunoansorbant assay (ELISA)
- ELISA merupakan suatu metode untuk mengetahui konsentrasi antibodi
atau antigen yang terdapat dalam sampel (serum atau cairan tubuh) dengan
menggunakan reaksi kompleks antigen-antibodi.

- Teknik ini sangat sensitif dan mampu mendeteksi konsentrasi antigen

maupun antibodi yang relatif rendah (dalam piko atau nano gram).
Pengukuran dilakukan dalam mikroplat (microplate ) dengan jumlah sumuran
96.

- Apabila yang ingin diketahui adalah konsentrasi antigen dalam sampel maka
dasar sumuran mikroplate akan dilapisi lebih dahulu dengan antibodi yang
spesifik terhadap antigen tsb.
Apabila yang ingin diketahui konsentrasi antibodi maka dasar sumuran
mikroplat dilapisi dengan antigen yang dikenali antibodi tsb.

- Dalam teknik ELISA diperlukan adanya antibodi yang dilabel dengan enzim
yang mampu mengubah substrat menjadi produk dan menghasilkan
perubahan warna

- Antibodi yang dilabel dengan enzim dapat dilakukan pada antibodi 1’ atau 2’
05/17/22 34
Skema kerja dari teknik ELISA

05/17/22 35
- Penggunaan antibodi 2’ yang dilabel enzim yang mampu mengubah substrat
menjadi produk (A) dengan ditandai adanya perubahan warna yang dapat diukur
secara spektrofotometri dengan ELISA reader (B)

A
05/17/22 B 36
Mikroplate dan ELISA reader

05/17/22 37
Prosedur umum teknik ELISA

05/17/22 38
Teknik Umum ELISA

1. Pengikatan antigen/antibodi pada permukaan plastik microplate

2. Pencucian dengan bufer untuk sisa antigen atau antibodi yang tidak
terikat pada permukaan plastik

3. Inkubasi dengan antibodi pertama/kedua yang dilabel dengan enzim

4. Pencucian sisa antigen/antibodi yang tidak terikat dalam kompleks

antigen-antibodi

5. Pemberian substrat yang bersifat kromogenik atau fluorogenik, apabila

diputus ikatannya oleh enzim yang dilabelkan pada antibodi akan
menghasilkan warna.

6. Warna yang muncul dari rekasi enzimatis tersebut diukur secara

spektrofotometri dengan ELISA reader.

7. Penentuan kadar/titer antibodi dapat dilakukan dengan menggunakan

konsentrasi standart yang dibuat.

05/17/22 39
Contoh kerja kit deteksi virus avian influenza dengan teknik Elisa

AIV+ ELISA
Monoclonal Antibodies
r NP
Antibody
Chicken Sera

Conjugate
Anti-species IgG Polyclonal
goat anti-chicken Ab/peroxidase

Substrate
Uncolored/Colored substrate

Positive Negative
05/17/22 40
Hal penting dalam teknik Elisa:

-Elisa kit sudah banyak diproduksi secara komersial

-Sensitivitas elisa berkisar dalam nanogram antigen per mililiter

-Spesivitas dari elisa tergantung dari kemampuan antibodi pertama mengenali

secara tepat antigen yang dideteksi

-Kontrol positif dan negatif harus disertakan

-Pencucian ekses antigen atau antibodi dengan bufer harus terlaksana dengan
baik, biasanya diulang minimal 3 kali.

-Perlu dilakukan bloking (penutupan) bagian non spesifik pada antigen,

biasanya dengan serum atau susu skim.

05/17/22 41
  Imunositokimia dan imunohistokimia

Imunositokimia merupakan teknik yang mampu untuk melokalisasi adanya

antigen tertentu (dapat berupa protein spesifik) yang terdapat dalam sel
(subseluler) dengan menggunakan antibodi spesifik. Keberadaan kompleks
antigen-antibodi dideteksi dengan enzim atau senyawa kromofom maupun
fluorokrom yang dilabelkan pada antibodi (dapat diberikan pada antibodi
pertama maupun kedua).

Teknik umum imunositokimia

1. Kultur sel ditumbuhkan pada gelas penutup preparat (cover slip glass)
2. sel dicuci dengan bufer
3. Fiksasi sel dan bloking (menutupi permukaan protein non spesifik)
4. Inkubasi dengan antibodi primer
5. Kelebihan antibodi primer dicuci dengan bufer
6. Inkubasi dengan antibodi sekunder yang telah dilabel dengan fluorokrom
(misal: FITC atau Texas red)
7. Kelebihan antibodi sekunder dicuci dengan bufer
8. Gelas penutup yang telah berisi hasil preparasi imunositokimia ditutupkan
diatas gelas benda
9. Preparat diamati dibawah mikroskop fluoresen
05/17/22 42
Skema preparasi imunositokimia
Gelas penutup yang diletakkan di dasar media
sebelum kultur sel diinokulasikan dan ditumbuhkan

Petri berisi media kultur sel

Gelas benda

Gelas benda yang telah

ditumbuhi kultur sel dan dilakukan
pengecatan secara imunositokimia

Preparasi imunositokimia
untuk kultur sel yang tumbuh pada
gelas penutup

05/17/22 43
- Mikroskopi imunofluorescence merupakan teknik yang diperlukan untuk mengetahui lebih
jauh tentang protein, organel atau sel spesifik dalam sel atau jaringan melalui preparasi
imunositokimia atau imunohistokimia dengan alat pengamatan menggunakan mikrokop epi-
fluorescence

Mikroskop epi-fluorescence

05/17/22 44
-Hasil pengamatan imunositokimia dengan teknik mikroskopi imunofluorescence
untuk kolokalisasi reseptor fibronektin (hijau) dan benang aktin (merah) yang
muncul akibat stress (cekaman)

05/17/22 45
Beberapa contoh teknik deteksi antibodi. (a) Pelabelan langsung pada antibodi
primer, (b) pelabelan tidak langsung dengan antibodi sekunder dan (c) pelabelan
tidak langsung dengan antibodi kedua yang dilabel dengan streptavidin (umumnya
untuk preparasi imunohistokimia).
a

c
05/17/22 46
Imunohistokimia merupakan teknik untuk lokalisasi antigen (dapat berupa protein
spesifik) pada suatu jaringan dengan menggunakan antibodi primer yang spesifik
terhadap antigen. Untuk antibodi pertama atau kedua dapat dilabel dengan
senyawa dengan biotin, sehingga apabila diberi avidin atau streptovidin maka
terbentuk kompleks yang warnanya coklat gelap.

Teknik umum imunohistokimia

1. dibuat preparat histologis (jaringan dari suatu organ)
2. Fiksasi jaringan dan bloking protein non spesifik
3. Inkubasi dengan antibodi primer
4. Kelebihan antibodi dicuci dengan bufer
5. Inkubasi dengan antibodi sekunder yang telah dilabel (misalnya dengan biotin)
6. Kelebihan antibodi sekunder dicuci dengan bufer
7. Inkubasi dengan reagen pewarna (avidin atau streptovidin) yang dapat
membentuk kompleks dengan biotin
8. Setelah terbentuk warna maka preparat dicuci dan ditutup
9. Setelah selesai preparat diamati dibawah mikroskop cahaya

05/17/22 47
-Hasil deteksi sel tumor dengan teknik imunohistokimia. Sel tumor berasal
dari sel yang mensekresikan hormon neuroendokrin dan dikenali oleh antibodi
yang spesifik untuk hormon tersebut dan dilabel dengan antibodi kedua yang
mengandung streptavidin .

05/17/22 48