Immunoassay

- imunossay merupakan suatu teknik analisis yang prinsip dasarnya menggunakan

perangkat sistem imun tubuh yaitu berupa ikatan spesifik antara antigen dan antibodi.

- Analisis yang dilakukan dapat berupa analisis kualitatif maupun kuantitatif. aplikasi
Teknik ini telah digunakan secara luas untuk membantu penegakan diagnosis pasien.

Istilah penting dalam sistem imun

1. Antibodi
antibodi adalah senyawa yang diekskresikan oleh sel B untuk melawan senyawa asing
yang masuk ke dalam tubuh secara spesifik. Ada dua jenis antibodi yaitu monoklonal
dan polyclonal. Bedanya adalah
- Pada monoklonal hanya dapat mengenal satu jenis epitop antigen, sedangkan
- Pada poliklonal dapat mengenali lebih dari satu macam epitop Antigen

2. Antigen
antigen sendiri merupakan senyawa asing yang dapat menginduksi sistem imun tubuh
untuk menghasilkan senyawa imun, sehingga disebut juga memiliki sifat imunogen.

3. Hapten
hapten merupakan senyawa asing berukuran kecil yang dapat mengaktivasi sistem imun
jika berikatan dengan senyawa yang lebih besar seperti protein.

4. Label
maksud kata label adalah penempelan senyawa lain yang dapat membantu proses
reaksi maupun deteksi pada immunoassay.

Ikatan antara Antigen dengan Antibodi

- Ikatan antara Antigen dengan Antibodi bersifat spesifik artinya antibodi hanya dapat
mengenali antigen tertentu dengan tiga jenis kemungkinan ikatan yaitu vanderwalls
 hidrofobik dan ionik. Kompleks hasil ikatan yang terbentuk dapat dilihat pada gambar
berikut:
➔ gambar yang paling atas atau gambar A
menunjukkan ikatan antara satu antigen yang ditempeli oleh lebih dari satu
antibodi jenis ikatan ini membentuk kompleks yang dapat larut.
➔ pada gambar b
menunjukkan ikatan antara antigen dan antibodi yang saling terikat satu sama
lain membentuk kompleks yang tidak larut.
➔ gambar C
menunjukkan terbentuknya kompleks yang terdiri dari satu antibodi yang
mengikat dua antigen sehingga ukuran kompleksnya kecil dan dapat larut.

- Jenis ikatan yang terbentuk dapat dipengaruhi oleh adanya muatan ionik seperti kation
maupun anion dan juga efek polimer yang dapat meningkatkan kecepatan pembentukan
kompleks imun sehingga menyebabkan terbentuknya endapan Kompleks imun.

Uji kualitatif

- Uji kualitatif pada immunoassay dapat dilakukan dengan Western Blot. Uji ini analog
dengan soutern blot yang digunakan untuk analisis DNA dan northern blot yang analog
dengan analisis RNA.

- Western Blot merupakan metode lanjutan dari sds-page yang dilakukan pada analisis
protein lebih tepatnya spesifik protein. gel hasil analisis sds-page kemudian dipindahkan
ke dalam nitrocellulose atau membran nilon untuk selanjutnya dilakukan electroplating
atau penambahan antibodi spesifik pada membran.

- Ketika terdapat antigen pada membran, maka antibodi akan tertahan pada membran.
Keberadaan antibodi dalam membran dapat dideteksi dengan radioaktif atau enzim ada
dua cara deteksi yaitu secara direct ataupun indirect.
➔ pada direct
antibodi yang ditambahkan telah terlabel dengan enzim yang nantinya akan
mengubah substrat menjadi produk berwarna. warna yang terbentuk ini
menunjukkan ada tidaknya senyawa yang kita deteksi pada membran.
 ➔ pada indirect
antibodi pertama yang ditambahkan pada membran bukanlah antibodi yang
berlabel, sehingga ditambahkan antibodi kedua atau yang disebut sebagai
antibodi sekunder yang berlabel enzim untuk deteksi. Cara deteksi sama dengan
metode direct yaitu dengan menambahkan substrat yang akan berubah menjadi
produk yang ditandai dengan perubahan warna.

- contoh hasil Western Blot adalah seperti gambar berikut, pada gambar terdapat 10 hasil
Western Blot dari delapan pasien yang diuji ada tidaknya virus HIV dalam serumnya.
➔ gambar paling kiri
Merupakan kontrol negatif dengan menggunakan sampel berupa air.
➔ Gambar sebelah kanannya
merupakan kontrol positif berupa serum yang positif HIV.
◆ tampak bahwa pada kontrol negatif tidak terbentuk pita berwarna
karena pada sampel air tidak mengandung antigen, sedangkan
pada kontrol positif menunjukkan beberapa pita berwarna yang
terbentuk karena adanya antigen pada sampel.
◆ gambar nomor 3 hingga 10 adalah hasil deteksi antigen pada
serum pasien. cara membaca hasilnya adalah dengan
mencocokkan petrn pita milik pasien dengan kedua kontrol. pada
hasil nomor 3 hingga 7 menunjukkan hasil yang masih belum
dapat dipastikan karena terdapat pita dalam jumlah yang sedikit
tidak sebanyak kontrol positif namun juga tidak dapat kita
samakan dengan kontrol negatif, sedangkan pada gambar 8-10
menunjukkan pita yang mirip dengan kontrol positif sehingga
pasien dinyatakan positif HIV

Uji kuantitatif

- Uji kuantitatif dapat dilakukan dengan beberapa cara berikut:

1. Radial diffusion & Electroimmunoassay
2. Turbidimetric & Nephelometric Assay
3. Labeled Immunochemical Assay
 a. Radioimmunoassay (RIA): 125I & 131I
b. Fluoroimmunoassay (FIA): fluorophores
c. Enzyme Immunoassay (EIA)
● Cth enzim: alkalin fosfatase, horseradish peroksidase, β-galaktosidase
● Enzyme-multiplied IA technique (EMIT)
● Cloned enzyme donor IA (CEDIA)
● ELISA enzyme linked immunosorbent assay
namun yang paling sering digunakan adalah metode Elisa.

- Elisa atau enzyme linked immunosorbent assay adalah metode yang digunakan untuk
deteksi maupun menghitung jumlah antigen tertentu dalam sampel dengan prinsip
penambahan antibodi spesifisiknya.
➔ Prinsip dasar mirip dengan Western Blot, namun pada Elisa tidak
menggunakan membran, Elisa dilakukan menggunakan suatu Well plate
yang didalamnya dapat kita tambahkan sampel pasien berikut dengan
antibodi pendeteksi yang terlabel serta substrat yang akan dapat membantu
proses deteksi nya.
➔ berbeda dengan Western Blot pada Elisa jumlah produk yang terbentuk akan
dapat dihitung menggunakan spektrofotometer. ada tiga macam Elisa yaitu
direct indirect dan sentris Elisa
➔ Metode pertama yaitu direct, pada direct (langsung)
prinsipnya sama dengan direct pada Western yaitu senyawa
pertama ditambahkan pada sumuran atau wel adalah sampel
pasien, Kemudian ditambahkan antibodi pendeteksi yang berlabel,
baru kemudian substratnya. jumlah produk yang terbentuk linear
dengan jumlah antigen yang terdapat dalam sampel.
◆ kekurangan metode ini adalah
1. antibodi primer yang ditambahkan Harus dilabel satu persatu
sehingga membutuhkan waktu yang lama.
2. metode ini juga kurang fleksibel untuk pengujian beberapa
antigen secara bersama dan ketika warna yang terbentuk
sedikit dapat tidak terdeteksi akibat sensitivitasnya yang
rendah.
 ➔ metode yang kedua adalah indirect (tidak langsung)
prinsipnya sama dengan indirek pada Western Blot sampel pasien
yang mengandung antigen ditempelkan pada sumuran, Kemudian
ditambahkan antibodi primer yang spesifik mendeteksi antigen
tersebut. deteksi dilakukan dengan menambahkan antibodi
sekunder yang terlabel enzim, baru kemudian substrat diberikan
pada well untuk mendapatkan produk. jumlah antigen akan
dihitung berdasarkan absorbansi yang dihasilkan dari pembacaan
produk dengan spektrofotometer.
◆ kelebihan metode ini adalah
1. sensitivitasnya lebih tinggi daripada direct Elisa,
2. fleksibel untuk melihat antibodi sekunder nya dan
3. lebih hemat karena jumlah antibodi yang terlabel lebih sedikit.
◆ kelemahan dari metode ini adalah
1. Adanya kemungkinan sinyal yang non-spesifik akibat
terjadinya Cross reaction pada antibodi sekunder.

➔ Metode sandwich
adalah metode yang paling sering digunakan berbeda dengan
kedua metode sebelumnya. pada metode ini senyawa pertama
yang ditambahkan adalah antibodi primer yang diikuti dengan
penambahan antigen pada spesimen pasien. barulah selanjutnya
kita tambahkan antibodi sekunder yang terlabel enzim beserta
dengan substratnya
◆ kelebihan metode ini adalah
1. digunakan pada sampel yang belum murni karena
sensitivitasnya 2-5 kali lebih tinggi dibanding kedua metode
sebelumnya
2. spesifisitas nya jauh lebih tinggi.

- contoh aplikasi sandwich Elisa adalah pada deteksi hba1c. seperti pada gambar berikut.
antibodi sekunder yang digunakan dapatlah berupa antibodi spesifik yang dapat
mendeteksi antigen tanpa label, baru Kemudian ditambahkan antibodi ketiga yang
terlabel untuk deteksi.
- contoh lain adalah pada deteksi kehamilan menggunakan script untuk lebih jelasnya
dapat dilihat pada video berikut

- selain dari beberapa contoh yang telah disebutkan sebetulnya Elisa telah sangat luas
digunakan di laboratorium klinik untuk deteksi berbagai jenis antigen penyebab penyakit
seperti pada gambar berikut