Jurnal Analisis Farmasi dan Biomedis 83 (2013) 82-88

Daftar isi tersedia di SciVerse ScienceDirect

Jurnal Analisis Farmasi dan Biomedis

beranda: www. elsevier. com / cari / jpba

Pengembangan dan validasi metode kromatografi cepat untuk skrining dan kuantifikasi agen
pemutih kulit legal dan ilegal
Sebuah,b b Sebuah Sebuah b,1 Sebuah,∗,1
B. Desmedt , V. Rogiers , P. Courselle , JO De Beer , K. De Paepe , E. Deconinck
aDivisi Makanan, Obat-obatan dan Keamanan Konsumen, Bagian Produk Obat, Institut Ilmiah Kesehatan Masyarakat (IPH), Juliette wytsmanstraat 14, 1050 Brussels, Belgia
b Departemen Toksikologi, Dermato-Kosmetologi dan Farmakognosi, Pusat Penelitian Farmasi (CePhar), Vrije Universiteit Brussel (VUB), Laarbeeklaan 103, 1090 Brussels, Belgia

articl ei nfo abstrak

Sejarah artikel: Selama beberapa tahun terakhir, pasar UE dibanjiri oleh kosmetik ilegal melalui Internet dan yang disebut sebagai “pasar
Diterima 29 November 2012 Diterima gelap”. Di antaranya, produk pemutih kulit merupakan kelompok penting. Mereka mengandung, menurut undang-undang
dalam bentuk revisi 9 April 2013 Diterima kosmetik Eropa saat ini (Directive 76/768 / EEC), sejumlah zat aktif ilegal termasuk hidrokuinon, tretinoin dan kortikosteroid.
10 April 2013
Ini dapat memprovokasi serta efek toksik sistemik lokal, menjadi alasan pelarangan mereka dari pasar UE. Untuk
Tersedia online 4 Mei 2013
mengendalikan pasar ini diperlukan metode penyaringan cepat yang mampu mendeteksi bahan-bahan ilegal dalam berbagai
macam formulasi kosmetik pemutih yang ada.
Kata kunci:
Kosmetik ilegal
Dalam makalah ini dijelaskan pengembangan dan validasi metode kromatografi cair tekanan tinggi (UHPLC). Metode
Agen pemutih
Asam salisilat yang diusulkan menggunakan kolom Waters Acquity BEH shield RP18 dengan gradien menggunakan buffer amonium borat
Hydroquinone 25 mM (pH 10) dan asetonitril.
Kortikosteroid Metode ini tidak hanya mampu mendeteksi zat ilegal utama (hidrokuinon, tretinoin dan enam kortikosteroid aktif
Tretinoin dermatologis) dan zat pemutih legal, yang terakhir memiliki batasan sehubungan dengan konsentrasi dan aplikasi (asam kojat,
arbutin, nikotinamid dan asam salisilat), tetapi juga dapat menghitungnya dalam waktu berjalan 12 menit.

Metode ini berhasil divalidasi menggunakan pendekatan "kesalahan total" sesuai dengan persyaratan validasi ISO-17025.
Selama validasi, berbagai matriks kosmetik termasuk krim, lotion, dan sabun dipertimbangkan.

© 2013 Elsevier BV Semua hak dilindungi undang-undang.

1. Perkenalan
Produk pemutih telah digunakan selama puluhan tahun untuk
mencerahkan warna kulit, terutama pada orang dengan foto tipe IV, V atau VI
dan semakin populer [1,2]. Alasan pemutihan kulit sangat beragam dan
kompleks serta mencakup masalah medis, estetika, budaya, sosial-ekonomi,
dan politik. [1,3]. Memang, selain diaplikasikan dalam kosmetik, zat pemutih
juga digunakan dalam obat-obatan untuk mengobati penyakit kulit seperti
melasma dan hiperpigmentasi inflamasi. [4,5]. Agen pemutih, termasuk
kortikosteroid, hidrokuinon, dan tretinoin dapat memicu efek lokal yang tidak
diinginkan (ochronosis, dermatitis iritan, leukoderma, hiperpigmentasi pasca
inflamasi, . . .) dan toksisitas sistemik (masalah ginjal dan hati). Oleh karena
itu di Eropa, zat-zat tersebut telah ditempatkan pada lampiran II Kosmetik
Petunjuk 76/768 / EEC dan dengan demikian dilarang dari pasar UE [6]. Tapi
Meskipun ada larangan ini, produk yang mengandung bahan-bahan ini bisa
masih bisa dibeli melalui sirkuit ilegal. Mengetahui bahwa formulasi biasanya
mencakup kombinasi bahan-bahan yang disebutkan di atas bersama dengan
bahan-bahan legal dan peningkat penetrasi, potensi risikonya bagi kesehatan
manusia tidak dapat dikesampingkan, khususnya setelah paparan berulang dan
jangka panjang.
Serangkaian zat baru telah dikembangkan termasuk asam kojic, arbutin
dan nikotinamida. Untuk beberapa zat ini, keamanannya diselidiki di tingkat
komisi oleh Scientific Commit-tee on Consumer Safety (SCCS) dan masalah
kesehatan diungkapkan, misalnya untuk arbutin yang dianggap dapat
melepaskan hidro-kuinon[7,8].

Seperti yang dinyatakan oleh Chisvert et al. [2], Pengembangan metode

performans yang memungkinkan dilakukannya analisis yang efisien terhadap
∗ jenis kosmetik ini sangat dibutuhkan untuk menguasai pasar. Metode yang
Penulis yang sesuai. Telp .: +32 02 642 51 36; fax: +32 02 642 53 27. Alamat
email:Eric.Deconinck@wiv-isp.be (E. Deconinck).
mendeteksi dan mengukur hidrokuinon saja tidak cukup[9,10].
1 Pemimpin proyek yang berkontribusi sama. Hal yang sama berlaku untuk metode skrining yang hanya mendeteksi
kortikosteroid atau kelompok agen pemutih tertentu yang terutama terdiri dari
0731-7085 / $ - lihat materi depan © 2013 Elsevier BV Semua hak dilindungi asam kojat, arbutin dan hidrokuinon. [11,12].
undang-undang. http://dx.doi.org/10.1016/j.jpba.2013.04.020
 B. Desmedt dkk. / Jurnal Analisis Farmasi dan Biomedis 83 (2013) 82-88

Hingga saat ini, sejauh pengetahuan kami, belum ada metode yang Tabel 1
Konsentrasi sampel validasi dan standar kalibrasi yang sesuai untuk tiga tingkat konsentrasi. *
diterbitkan atau divalidasi untuk mengidentifikasi dan mengukur agen
Larutan yang mengandung arbutin dibuat dalam asetonitril yang mengandung 0,05% air.
pemutih kulit ilegal dan legal yang paling penting dengan tetap
mempertimbangkan variasi komposisi dari berbagai formulasi kosmetik yang Senyawa Konsentrasi
mungkin mengandung bahan-bahan tersebut. zat pemutih misalnya krim, Sampel validasi Kalibrasi akhir
losion, dan sabun. Metode umum seperti itu dapat menghemat waktu dan (g / 100 g) standar (g / ml)
sumber daya, dan memberikan otoritas pengatur lebih banyak fleksibilitas 0,5 6
untuk mensurvei pasar (ilegal) dan menginformasikan konsumen dengan Asam kojic 1 13
lebih baik tentang potensi risiko kesehatan. 2 26

4 53
Makalah ini menjelaskan metode seperti itu. Ini adalah aplikasi UHPLC
Arbutin 7 93
yang memungkinkan analisis kualitatif dan kuantitatif, dari delapan agen 10 133
pemutih kulit ilegal (hidrokuinon, tretinoin dan enam kor-tikosteroid aktif
1 20
dermatologis) dan empat agen pemutih kulit legal (asam kojat, arbutin, Hydroquinone 5 100
nikotinamida dan asam salisilat) yang ada dalam berbagai jenis persiapan 7 140
kosmetik dan ini dalam waktu 12 menit.
1 13
Nikotinamida 2 26
3 40
2. Bahan-bahan dan metode-metode 1 13
Asam salisilat 3 40
2.1. Standar dan reagen 5 66

Standar referensi asam kojat (batch 1363411 V, kemurnian ≥98%),
arbutin (batch BCBD1957V, kemurnian ≥98%), nic-otinamide (batch
0001448241, kemurnian ≥99%), hidrokortison 21-asetat (batch 025K1123,
kemurnian ≥98%) dibeli dari Sigma – Aldrich (St. Louis, USA). Asam
salisilat (batch 03E37-B02-241946, kemurnian≥99%), tretinoin (batch 09J22-
BO5-251745, kemurnian ≥98%), betametason valerat (batch 10J04-B01-
262745, kemurnian ≥97%), clobetasol propionate (batch 11G25-B02-264743,
kemurnian ≥99%), deksametason (batch 12C09-B03-269762, kemurnian
≥98%), prednison (batch 07L19-B10-232010, kemurnian ≥99%) diperoleh
dari Fagron (Waregem, Belgia). Fluocinolone acetonide (batch 037K1286,
kemurnian≥98%) berasal dari Fluka (Steinheim, Jerman), betametason
dipropionat (batch 10F17-B08-257129, kemurnian ≥97%) dari Certa (Braine-
L'alleud, Belgia) dan hydroquinone (batch 10157959, kemurnian ≥99%) dari
Alfa Aesar (Karlsruhe, Jerman).
Asetonitril dan metanol tingkat HPLC dibeli dari Biosolve
(Valkenswaard, Belanda). Larutan asam borat dan amunisi 25% (v / v) berasal
dari Merck (Darmstadt, Jerman). Air diperoleh dengan menggunakan sistem
milliQ-Gradient A10 (Millipore, Billerica, USA). Basis krim yang digunakan
untuk menyiapkan sam-ples validasi dan bahan yang digunakan untuk
memformulasi lotion dan sabun dibeli dari Fagron (Waregem, Belgia).
0,03 12
Kortikosteroid dan tretinoin 0,05 20
0.1 40
2.2.2. Sampel validasi
Sampel validasi berduri disiapkan sesuai dengan seni profesi farmasi
dengan mencampurkan bahan pemutih padat dengan dasar krim hidrofilik
anionik (minyak dalam air (o / w) emulsi).
Tingkat konsentrasi yang dipilih untuk sampel validasi sesuai dengan
konsentrasi yang biasa ada dalam kosmetik. Untuk mengurangi beban kerja,
krim dengan banyak komponen dibuat dan konsentrasi masing-masing
komponen dalam krim yang berbeda dicantumkan diTabel 1 [15,16].
Kapanpun tretinoin terlibat, semua pekerjaan dilakukan untuk menghindari
paparan cahaya [13,14].
Karena kosmetik pemutih kulit tersedia dalam berbagai formulasi cos-
metic (misalnya krim, losion, sabun, . . .), dengan krim sebagai yang
terpenting. Sebuah studi pemulihan dilakukan dengan menggunakan juga
krim, lotion dan sabun. Formulasi kosmetik ini disiapkan pada tingkat
konsentrasi menengah seperti yang ditunjukkan padaTabel 1. Mereka
dianalisis dalam rangkap tiga. Bahan dan komposisi dari tiga formulasi
kosmetik diberikanMeja 2.

2.3. Perawatan sampel

2.2. Persiapan sampel
2.2.1. Standar kalibrasi
Senyawa tersebut dibagi menjadi dua kelompok. Kelompok A,
mengandung lebih banyak senyawa hidrofilik (asam kojat, hidrokuinon,
nikotinamida, asam salisilat dan arbutin) dan kelompok B yang lebih
hidrofobik (kortikosteroid dan tretinoin). Konsentrasi yang digunakan untuk
setiap standar kalibrasi ditunjukkan diTabel 1.Larutan dibuat dalam 100%
asetonitril kecuali larutan arbutin yang mengandung 0,05% air. Kalibrasi
dilakukan dengan menambahkan 5 ml larutan standar ke 1 g krim plasebo
dalam penerima yang dilindungi cahaya untuk menghindari degradasi foto
tretinoin.[13,14]. 5 ml larutan standar internal, mengandung 0,1 mg / ml
prednison dilarutkan dalam asetonitril, ditambahkan dan larutan selanjutnya
diencerkan dengan asetonitril hingga volume total 25 ml. Agar tetap dalam
kisaran dinamis detektor, sampel yang mengandung senyawa dari grup A
diencerkan. Konsentrasi akhir yang diperoleh untuk setiap level ditampilkan
diTabel 1. Perawatan sampel lebih lanjut dijelaskan di bagian 2.3.
Satu gram krim atau losion ditimbang dengan teliti dalam labu kerucut
berwarna coklat. 5 ml larutan standar internal (IS) ditambahkan dan volume
total diubah menjadi 25 ml dengan asetonitril. Larutan ini diaduk selama 10
◦
menit dan ultrasonifikasi (Branson 8510) pada 50 C selama 30 menit. Setelah
◦
ultrasonifikasi, larutan disimpan di-20 C selama satu jam untuk
mengendapkan bahan berminyak dari krim / lotion. Sediaan kemudian
disaring melalui syringe filter 25 mm Polytetrafluoroethylene (PTFE) 0,2 m.
Konsentrasi yang diperoleh pada saat ini adalah sama untuk sampel validasi
dan standar kalibrasi yang sesuai.
Untuk senyawa golongan B, larutan yang disaring dapat langsung
digunakan. Untuk grup A, pengenceran lebih lanjut dengan campuran air:
asetonitril (90:10, v / v) diperlukan untuk tetap berada dalam rentang dinamis
linier dari detektor.
Untuk sabun, 1 g formulasi dilarutkan dalam 10 ml air dan segera
dinetralkan dengan asam klorida, karena hidro-kuinon tidak stabil dalam
larutan alkali. IS kemudian ditambahkan dan
84 B. Desmedt dkk. / Jurnal Analisis Farmasi dan Biomedis 83 (2013) 82-88
Meja 2
Formula peracikan untuk krim, losion, dan sabun yang digunakan selama prosedur validasi. Krim dan losion disiapkan seperti yang dijelaskan dalam[19], formulasi sabun diadaptasi dari [20].
Rumus peracikan
Krim
% (m /
Bahan m)
Air yang diawetkan 78.5
Methyl-p-hydroxybenzoate 0,08
Propyl-p-hydroxybenzoate 0,02
Cetostearylalkohol 15
Gliserin 5 Decyloleate
Natrium laurilsulfat 1.5
larutan dibawa ke volume total 25 ml dengan asetonitril.
Perlakuan sampel dilanjutkan seperti dijelaskan di atas.
2.4. Kondisi instrumental
Pengembangan metode, optimasi dan validasi dilakukan dengan
TM
menggunakan Acquity UPLC sistem (Waters, Milford, USA), yang terdiri
dari manajer pelarut biner, manajer sampel, dan detektor larik fotodioda.
Sinyal keluaran dipantau dan diolah menggunakan Waters Empower 3
Perangkat lunak Citrix.
Metode yang digunakan adalah Waters Acquity BEH shield RP18 2.1 mm
×100 mm, kolom 1,7 m. Gradien terdiri dari a
0,025 M buffer amonium borat pH 10 sebagai fasa air dan asetonitril sebagai
pengubah organik. Gradien dimulai pada buffer 99% dan kondisi ini
berlangsung selama 3 menit. Setelah itu persentase usia buffer turun secara
linier menjadi 70% dalam 1 menit dan kemudian menurun secara linier
menjadi 30% dalam 6 menit sebelum kembali ke kondisi awal. Gradien
memiliki aliran 0,4 ml / menit. Volume yang diinjeksikan adalah 4 l dan suhu
◦ diikuti dengan penurunan linier menjadi 30% buffer di 6 menit sebelum
kolom diatur pada 40 C. Senyawa dari grup A dan B terdeteksi masing-
masing pada 230 dan 240 nm.
2.5. Validasi metode
Metode saat ini divalidasi sesuai dengan profil akurasi penerapan ISO-
17025, yang didasarkan pada pendekatan "kesalahan total" [17].
Pendekatan ini memperkirakan “kesalahan total” dengan menggabungkan
kesalahan sistemik (kebenaran) dan kesalahan acak (keputusan menengah)
untuk mengetahui perbedaan antara hasil pengamatan dan nilai sebenarnya.
Dengan kata lain, kesalahan tertinggi dari suatu metode analisis dapat
diperkirakan.
Sampel validasi (disiapkan seperti yang dijelaskan di Bagian 2.2.2)
dianalisis dalam rangkap tiga selama tiga hari berturut-turut dan konsentrasi
yang sesuai dihitung kembali menggunakan garis kalibrasi.
3. Hasil dan Pembahasan
3.1. Pengembangan dan pengoptimalan metode
Pengembangan UHPLC melibatkan dua fase diam: (i) a Waters Acquity
BEH RP18 column 2.1 mm × 150 mm, 1,7 m dan
(ii) a Perisai Perairan BEH Perairan RP18 2.1 mm × 100 mm, 1,7 m kolom,
yang terakhir dikenal untuk memisahkan senyawa fenolik [18].
Tiga buffer organik digunakan: (i) buffer amonium format 0,025 M pH 3,
(ii) buffer amonium asetat 0,025 M pH 6 dan (iii) bufer amonium borat 0,025
M pH 10. Semua percobaan dilakukan dengan menggunakan metanol dan
asetonitril sebagai pengubah organik.
Skrining awal dengan inspeksi visual dari chro-matograms yang diperoleh
menunjukkan bahwa Waters Acquity BEH melindungi RP18
Losion Sabun mandi
% (m /
Bahan % (m / m) Bahan m)
Air yang diawetkan 94.8 Mentega kelapa 35
Methyl-p-hydroxybenzoate 0,08
Propyl-p-hydroxybenzoate 0,02
Cetostearylalkohol 2.5 Shea butter 30
2.5 air 25
Carbopol 980 0.2 NaOH 10
2,1 mm ×100 mm, kolom 1,7 m menunjukkan pemisahan terbaik pada pH 10
(data tidak ditampilkan). Selain itu, pengubah organik asetoni-trile dipilih
sebagai pengganti metanol, memberikan resolusi yang lebih baik antara
betametason valerat dan dipropionat. Kondisi ini digunakan untuk optimasi
gradien lebih lanjut.
Gradien UHPLC awal, dimulai pada buffer 99% dan secara linier turun
menjadi buffer 10% dalam 10 menit sebelum kembali ke kondisi awal dalam 2
menit. Seperti yang disebutkan untuk kondisi instrumen, gradien memiliki
◦
TM aliran 0,4 ml / menit, dengan volume injeksi 4 l dan suhu kolom 40 C.
Karena pemisahan antara hidrokuinon dan nikotinamida tidak optimal,
gradien awal disesuaikan dengan menahan kondisi awal (mengandung 99%
buffer), isokratik selama 3 menit sebelum penurunan linear buffer selama 7
menit hingga 10% terjadi. Adaptasi ini memberikan resolusi yang lebih baik
untuk semua senyawa hidrofilik tetapi fluosinolon dan hidrokortison bekerja
bersama. Untuk mengatasi masalah ini dan tidak memperpanjang waktu
berjalan, gradien dimodifikasi dengan menahan kondisi awal isokratik selama
3 menit, kemudian turunkan secara linier menjadi 70% buffer dalam 1 menit,
kembali ke kondisi awal dalam 2 menit.
Contoh pemisahan yang diperoleh dengan kondisi eksperimen yang
dioptimalkan untuk krim yang dibubuhi 12 senyawa ditunjukkan pada
Gambar 1. Dalam gambar yang sama, kromatogram yang diperoleh untuk
sampel kosmetik ilegal yang tersedia secara komersial, positif untuk clobe-
tasol propionate ditampilkan.
Untuk menyederhanakan metodologi telah diteliti apakah validasi metode
dapat dilakukan tanpa menggunakan IS. Untuk senyawa dari grup A, ini tidak
menjadi masalah. Namun, untuk senyawa kelompok B, hasilnya tidak
memuaskan karena variasi pemulihan yang lebih tinggi. Ini tidak diamati
ketika prednison ditambahkan sebagai IS. Senyawa ini adalah kor-tikosteroid
tidak aktif bila dioleskan secara topikal dan karenanya, tidak ada dalam
formulasi dermatologis / kosmetik.
Pemulihan juga terganggu ketika standar kalibrasi disiapkan dalam
pelarut. Oleh karena itu, ini disiapkan dalam matriks seperti mengoreksi
inklusi matriks dan efek adsorpsi.
3.2. Validasi metode
Sampel validasi plasebo berduri terdiri dari sampel yang disusun kembali
dan mewakili sampel masa depan yang harus diukur oleh prosedur analitis.
Mereka dianalisis dalam rangkap tiga selama tiga hari berturut-turut untuk tiga
tingkat konsentrasi dan konsentrasi yang sesuai dihitung kembali
menggunakan garis kalibrasi. Karena kosmetik pemutih paling sering adalah
krim, studi validasi dilakukan dengan menggunakan sampel krim plasebo
berduri.
3.2.1. Selektivitas
Selektivitas sistem kromatografi dikonfirmasi dengan menentukan waktu
retensi setiap komponen dan spektrum UV yang sesuai selama analisis yang
berbeda. Menggambarkan
 B. Desmedt dkk. / Jurnal Analisis Farmasi dan Biomedis 83 (2013) 82-88

Gambar 1. Gambaran dari empat kromatogram diperoleh dengan menerapkan kondisi UHPLC yang dioptimalkan. (I) Kromatogram krim kosong. (II) Kromatogram sampel kosmetik ilegal. (III)
Kromatogram dari komponen matriks yang umumnya terdapat asam askorbat dan metil-p-hidroksibenzoat. (IV) Kromatogram setelah analisis krim yang dibubuhi dua belas zat pemutih yang
diselidiki. (AUC: area di bawah kurva).

selektivitas metode, kromatogram yang diperoleh untuk krim kosong dan pendekatan [17]. Ini dibangun berdasarkan analisis sampel validasi dan
untuk zat kosmetik yang sering digunakan asam askorbat (anti-oksidan) dan konsentrasi dihitung kembali menggunakan garis kalibrasi. Hasil ini
metil-p-hidroksibenzoat (pengawet), ditunjukkan pada Gambar 1. Puncak digunakan untuk menentukan linieritas hasil, ketepatan, presisi (pengulangan
yang sesuai tidak mengganggu analisis. dan presesi antar-mediasi) dan akurasi. Hasilnya diberikanTabel 4 dan
Gambar 2.
3.2.2. Linearitas garis kalibrasi
Kurva kalibrasi diperoleh dengan menggunakan regresi linier kuadrat Profil akurasi adalah pendekatan kesesuaian untuk tujuan yang
terkecil biasa dan linieritas dikonfirmasi menggunakan R nilai, koefisien
2 memungkinkan untuk menilai kebenaran dan presisi secara bersamaan,
kualitas (QC) dan uji kurangnya kesesuaian (LOF), Hasilnya dirangkum sehingga menghindari beberapa kekurangan prosedur validasi tradisional.
2 Tujuannya terdiri dari menemukan prosedur analitis yang memberikan hasil
dalam Tabel 3. Dengan semua R nilai di atas 0,999, nilai QC di bawah 2%
yang berbeda dari nilai target yang tidak diketahui dengan kurang dari batas
dan Semua nilai P dari uji LOF lebih tinggi dari 0,05, menjadi jelas bahwa
garis kalibrasi cukup menggambarkan hubungan yang diamati, dalam rentang penerimaan yang telah ditentukan [-; ]. Hal ini dimungkinkan melalui
2 penghitungan interval toleransi ekspektasi yang merupakan interval yang akan
konsentrasi yang dipilih. Sendiri, R dan QC bukanlah indikator terbaik untuk
berisi hasil di masa mendatang yang berada dalam batas akseptabilitas dengan
linieritas, tetapi karena linieritas telah diuji dengan uji LOF, kedua parameter
tersebut dapat digunakan untuk uji kesesuaian sistem di masa mendatang probabilitas tertentu.[21,22]. Dengan kata lain, pendekatan ini memperkirakan
2 "kesalahan total" dengan menggabungkan kesalahan sistemik (kebenaran) dan
dengan batasan R ≥ 0,995 dan QC ≤ 2,5% [19,20].
kesalahan acak (keputusan menengah) untuk mengetahui perbedaan antara
hasil pengamatan dan nilai sebenarnya.
3.2.3. Penilaian linieritas, kebenaran, presisi, akurasi dan
ketidakpastian
Metode saat ini telah divalidasi sesuai dengan ISO-17025 yang Batas toleransi ekspektasi, dihitung pada setiap tingkat konsentrasi, dapat
menerapkan profil akurasi yang didasarkan pada "kesalahan total" digunakan sebagai alat prediksi yang menjamin bahwa 95% () dari hasil di
masa mendatang, yang diberikan oleh metode analitis, akan berada di dalam
batas penerimaan yang telah ditentukan [-; ], untuk kosmetik menjadi [-10%;
Tabel 3
2 10%]. Profil akurasi (ditampilkan diGambar 2) dibangun untuk mengevaluasi
Gambaran garis kalibrasi yang terkait R -, QC- dan kurangnya nilai p yang sesuai untuk semua
® keakuratan metode dan diperoleh dengan menghubungkan nilai bawah dan
dua belas senyawa. Garis regresi dievaluasi secara statistik dengan Statgraphics Centurion
XIV.I. atas dari batas toleransi ekspektasi dan memplot batas penerimaan [-; ].
Metode tersebut dapat dianggap akurat, untuk tingkat konsentrasi yang
Kurang fit R2 QC (%) dipelajari, dengan syarat batas penerimaan yang telah ditentukan [-; ] tidak
Asam kojic 0,9888 0,99967 1.766 terlampaui oleh batas toleransi ekspektasi.
Arbutin 0,2193 0,99927 1.950
Hydroquinone 0.4511 0,99950 1.498 Latar belakang teoritis profil akurasi dijelaskan dengan baik oleh Hubert
Nikotinamida 0.1564 1,00000 0,019 dan rekan kerja [23] dan telah berhasil diterapkan oleh kelompok riset kami
Asam salisilat 0.8923 0,99986 1.140
[24,25]
Deksametason 0.8931 0,9979 <0,001
Fluocinoloneacetonide 0.2109 0,9994 <0,001
Hidrokortison asetat 0,0905 0,99966 <0,001 3.2.3.1. Hasil linier. Linearitas adalah kemampuan suatu prosedur analitik
Tretinoin 0,9957 0,9995 <0,001 untuk memberikan hasil tes yang berhubungan secara proporsional dengan
Betametason valerat 0.4892 0,9998 <0,001
konsentrasi. Hubungan linier ini adalah tanggung jawab antara konsentrasi
Clobetasol propionate 0,9085 0,99999 <0,001
Betametason dipropionat 0.1085 0,9995 <0,001 teoritis dan terukur tetapi tidak diperlukan antara respon metode dan
konsentrasi
86 B. Desmedt dkk. / Jurnal Analisis Farmasi dan Biomedis 83 (2013) 82-88

Gambar 2. Profil akurasi dari semua 12 agen pemutih yang diselidiki dengan ditetapkan pada 95%. Bias relatif ( ), - batas toleransi harapan ( ), batas penerimaan
( ), konsentrasi yang dihitung balik relatif ().
ketidakpastian kromatografi metode untuk semua 12 yang agen pemutih. (RSD: relatif deviasi standar).
diselidiki

Kebenaran Presisi Ketepatan Ketidakpastian

Bias relatif (%) Pengulangan (RSD) Presisi Menengah (RSD) Batas toleransi ekspektasi (%) Relatif diperluas ketidakpastian (%)

123 123 123 12 3 12 3

-0.16 1. 2.322 0. 0. 0.84819 1. 1. 1.672757 - -[8,28; 7,96] [3,26; 5,87] -[3,49; 7,93] 3. 2.7787 3.59
- 06 061.314.5. 54 36 430.0.0. 66 37 600.0.0. - 10; [3,15; 0,52] [3. 5.02] 14; [3. 6,98] 43 811.0. 381.
- -640.1.263.18 87 78 330.1.1. 61 82 971.1.1. - -[5.15; 6.42] [5.28; 2.76] -[9,00; 2.65] 64 723.3. 24.
-4.74 0. 0.0199 0. 0. 1.436411 1. 1. 1.032639 - -[9,55; 0,07] [6,09; 6.11] -[2,95; 4,92] 2. 2.2384 3.06
- -3.240.67 2.57 0. 0. 0.716295 1. 0. 1.279174 - -[7,64; 1,17] [3,87; 2.53] -[3,81; 8,94] 2. 2.7701 4.01
- - -3.251.932.92 30 35 992.1.0. 30 37 342.1.1. - -[8,80; 2,30] [5,27; 1,42] -[6,90; 1,07] 69 834.2. 872.
- - -0.290.891.43 36 63 621.0.0. 43 63 762.1.0. - -[8,97; 8,39] [8,80; 7.03] -[3,54; 0,68] 45 685.3. 641.
- - -1.590.361.86 44 67 411.0.1. 99 72 411.1.1. - -[7.58; 4,41] [8,75; 8.02] -[5,31; 1,60] 32 904.3. 922.
0. 0. 4.721171 2. 3. 1.631737 2. 3. 1.631737 - -[5,88; 7,33] [7,79; 8.01] [1. 8,29] 13; 5. 6.5968 3.03
- - -4.423.042.49 1. 1. 0,047970 1. 1. 1.557946 - -[9,66; 0,83] [7,37; 1,30] -[9,42; 4.44] 3. 3.3067 3.22
- - -1.71.672.05 90 55 062.2.2. 90 59 452.2.2. - -[8,81; 5,40] [8,05; 4,71] -[8,73; 4,62] 01 396.5. 195.
- - -1.981.631.20 90 16 660.1.0. 57 91 701.1.0. - -[7,47; 3,50] [8,32, 5,06] -[3,01; 0,61] 45 213.4. 481.

Tabel 4Kebenaran, presisi, akurasi dan

Senyawa
B. Desmedt dkk. / Jurnal Analisis Farmasi dan Biomedis 83 (2013) 82-88

Tingkat konsentrasi

Asam kojic

Arbutin

Hydroquinone
Nikotinamida

Asam salisilat
Deksametason

Fluocinoloneacetonide
Hidrokortison asetat

Tretinoin
Betametason valerat
Clobetasol propionate

Betametason dipropionat
[23,26]. Itu linearitas hasil yang diperoleh dapat diterima Validasi telah dilakukan dengan menggunakan krim o / w karena ini
2 adalah formulasi kosmetik utama yang digunakan untuk tujuan pemutihan
sebagai R nilai di atas 0,9999.
kulit. Pemulihan dari krim dapat diperoleh dari hasil yang digunakan untuk
membangun profil akurasi.
3.2.3.2. Kebenaran. Menurut ISO, kebenaran prosedur analisis
Formulasi yang kurang populer untuk produk pemutih adalah lotion dan
mengungkapkan kedekatan kesepakatan antara nilai rata-rata
yang diperoleh dari pengukuran berulang dan nilai sebenarnya sabun. Untuk keduanya, studi pemulihan, berdasarkan perantara
konvensional. Ini adalah ukuran untuk kesalahan sistematis
dari metode tersebut dan dinyatakan dalam bias relatif[23,26].
Dari Tabel 4 dapat disimpulkan bahwa kebenaran untuk
semua komponen dapat diterima karena bias relatif terbatas
antara [-4,8% dan 5,1%].

3.2.3.3. Presisi. Juga menurut ISO, ketepatan metode ana-litik

mengungkapkan kedekatan kesepakatan antara nilai yang
diperoleh dari pengukuran berulang. Ini diselidiki pada dua
tingkat: (i) pengulangan, yang memberikan ketepatan di bawah
kondisi operasi yang sama selama interval waktu yang singkat,
dan (ii) ketepatan menengah, yang mengekspresikan variasi
intra-laboratorium, dinilai pada hari yang berbeda. Presisi
adalah ukuran untuk kesalahan relatif dari metode tersebut dan
dinyatakan menggunakan deviasi standar relatif (RSD)[23,26].

Dari Tabel 4 dapat dilihat bahwa keputusan menengah yang

dapat diterima diperoleh untuk semua komponen, seperti yang
dikonfirmasi oleh profil kesalahan total.

3.2.3.4. Ketepatan. Akurasi memperhitungkan kesalahan total

dari hasil tes dan diwakili oleh ß-ekspektasi toleransi lim-its.
Batas penerimaan umum sediaan farmasi adalah [-5%; 5%]
yang sama dengan batas produksi[21]. Untuk metode yang
dikembangkan di sini, alasan yang sama diikuti dan batas
penerimaan ditetapkan pada [-10%; 10%], yang mewakili batas
produksi yang diterima secara umum untuk sediaan kosmetik.
Seperti yang ditunjukkan padaTabel 4 dan Gambar 2, batas
toleransi ß-ekspektasi tidak melebihi batas penerimaan yang
berarti bahwa - persen (95%) dari pengukuran sampel yang
tidak diketahui di masa mendatang akan dimasukkan dalam
batas toleransi.

Ketidakpastian pengukuran adalah parameter yang terkait

dengan hasil pengukuran dan mengkarakterisasi dispersi nilai
yang secara wajar dapat dikaitkan dengan analit.
Ketidakpastian yang diperluas mewakili interval di sekitar
hasil di mana nilai sebenarnya yang tidak diketahui dapat
diamati dengan tingkat kepercayaan 95%. Ketidakpastian yang
diperluas relatif (%) diperoleh dengan membagi ketidakpastian
yang diperluas yang sesuai dengan konsentrasi yang sesuai.
Hasil ini juga ditampilkan diTabel 4. Sejak semua
ketidakpastian berada di bawah 7%, metode ini dianggap
memiliki ketidakpastian yang dapat diterima untuk semua
komponen.

3.2.4. Batasan deteksi dan kuantifikasi

Berdasarkan metode yang dijelaskan dalam European
Pharma-copoeia [27] dan oleh Konferensi Internasional tentang
Harmonisasi (ICH) [28], batas deteksi dan kuantifikasi
diperoleh secara eksperimental. Metode ini memanfaatkan
rasio signal over noise (S / N). Umumnya rasio 3,3 dan 10
masing-masing dianggap untuk batas deteksi (LOD) dan batas
kuantifikasi (LOQ). Hasil yang diperoleh untuk metode yang
dikembangkan di sini diberikan diTabel 5. LOQ tertinggi yang
ditemukan adalah 0,9 g / ml untuk hidrokuinon, yang cukup
untuk jenis analisis ini.

3.2.5. Pemulihan
88 B. Desmedt dkk. / Jurnal Analisis Farmasi dan Biomedis 83 (2013) 82-88

Tabel 5 Referensi
LOD dan LOQ yang diperoleh secara eksperimental untuk semua 12 agen pemutih yang
diselidiki.
(LOD: batas deteksi; LOQ: batas kuantifikasi). [1] K. AlGhamdi, Penggunaan agen pemutih topikal pada wanita: a menyeberang-studi bagian
dari pengetahuan, sikap dan praktek, J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol. 24 (2010) 1214–1219.
Senyawa LOD (ng / ml) LOQ (ng / ml)
[2] A. Chisvert, A. Balaguer, A. Salvador, Tanning dan agen pemutih dalam kosmetik. Aspek
Asam kojic 30.00 75.00 regulasi dan metode analisis, di: A. Salvador, A. Chisvert (Eds.), Analisis Produk Kosmetik,
Arbutin 21.21 56.56 Elsevier Science, Belanda, 2007, hal. 128.
Hydroquinone 299.35 898.27
Nikotinamida 35.03 55.60 [3] A. Mahé, J. Perret, F. Ly, F. Fall, JP Rault, A. Dumont, Penggunaan kosmetik produk
Asam salisilat 18.91 56.88 pencerah kulit selama kehamilan di Dakar. Senegal: umum dan praktik yang berpotensi
Deksametason 65.55 157.32 berbahaya, Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 101 (2007) 183–187.
Fluocinoloneacetonide 49.72 132.60
Hidrokortison asetat 55.76 111.53 [4] S. Briganti, M. Ottaviani, M. Picardo, Kimia, Farmakologis, dan Fisik agen penyebab
Tretinoin 111.63 334.87 hipomelanosis, di: J. Nordlund, RE Boissy, VJ Hearing (Eds.), The Pigmentary System, Wiley-
Betametason valerat 98.40 246,00 Blackwell, Inggris Raya, 2006, hal. 669.
Clobetasol propionate 48.50 97,00
Betametason dipropionat 68.85 137.70
[5] HR Byers, pengolahan melanosom dalam keratinosit, di: J. Nordlund, RE Boissy, VJ
Hearing (Eds.), The Pigmentary System, Wiley-Blackwell, Inggris Raya, 2006, hal. 183.

Tabel 6 [6] EU, Petunjuk Komisi 2010/4 / EU tanggal 8 Februari 2010 Dewan Amandemen Arahan
Pemulihan (rata-rata% ± deviasi standar) dari semua 12 bahan pemutih yang diteliti dianalisa 76/768 / EEC tentang Perkiraan Hukum Negara Anggota Berkaitan dengan Produk Kosmetik,
pada tingkat konsentrasi menengah dalam krim, lotion dan sabun (1 konsentrasi dianalisis Jurnal Resmi L 036 26 (2010), 08 April 2010.
dalam rangkap tiga).
[7] SCCP, SCCP / 1158/08, dalam: Opini on -arbutin, SCCP / 1158/08, Adopted Opinion
Senyawa Pemulihan Pada Rapat Pleno ke-15 tanggal 15 April 2008, 2008.

Sabun [8] SCCS, SCCS / 1481/12, dalam: Draft Opinion on Kojic Acid, Opini yang Diadopsi
Krim Losion mandi Selama Rapat Pleno ke-15 tanggal 26–27 Juni 2012.

Asam kojic 101.12 ± 1.67 90.01 ± 1.21 93.14 ± 1.16 [9] CH Lin, JY Sheu, HL Wu, YL Huang, Penentuan hidrokuinon di cos-metic emulsion
Arbutin 102.60 ± 2.90 101.33 ± 0,52 92.63 ± 1.47 menggunakan microdialysis sampling ditambah dengan kinerja tinggi kromatografi cair, J.
Hydroquinone 98.73 ± 2.26 99,45 ± 3.40 91.04 ± 3.50 Pharm. Biomed. Anal. 38 (2005) 414–419.
Nikotinamida 98.75 ± 2.77 90.35 ± 0.37 93.82 ± 1.59 [10] PM López García, Rocha Miritello Santoro, E. Kedor-Hackman, A. Kumar Singh,
Asam salisilat 99,55 ± 2.70 91.78 ± 1.03 93.27 ± 1.93
Pengembangan dan validasi HPLC dan spektrofotometri turunan UV metode untuk penentuan
Deksametason 97.30 ± 1.69 98.56 ± 1.16 94.48 ± 4.41
hidrokuinon dalam sediaan gel dan krim, J. Pharm. Biomed. Anal. 39 (2005) 764–768.
Fluocinoloneacetonide 99.13 ± 1.59 99.23 ± 1.24 93.13 ± 4.39
Hidrokortison asetat 98.73 ± 1.67 93.17 ± 1.19 95.72 ± 4.44 [11] M. Gaudiano, D. Lucente, E. Antoniella, P. Bertocchi, N. Muleri, L. Manna, M.
Tretinoin 101.85 ± 3.20 95.21 ± 1.30 91.66 ± 0.62 Bartolomei, S. Alimonti, L. Valvo, A. Rodomonte, Untuk obat ekspor saja kembali ke Eropa: a
Betametason valerat 96.69 ± 1.64 93.99 ± 1.50 91.93 ± 0.92 RP-LC metode untuk skrining enam glukokortikoid dalam krim anti-inflamasi dan keringanan
Clobetasol propionate 98.19 ± 2.48 91.55 ± 1.23 93.60 ± 1.55 ilegal dan palsu, J. Pharm. Biomed. Anal. 53 (2010) 158–164.
Betametason dipropionat 98.40 ± 1.33 93.79 ± 1.63 95.95 ± 4.49 [12] A. Chisvert, J. Sisternes, Á. Balaguer, A. Salvador, Sebuah kromatografi gas-
massa metode spektrometri untuk menentukan agen pemutih kulit dalam produk kosmetik ucts,
Talanta 81 (2010) 530–536.
konsentrasi, telah dilakukan dan semua sampel dianalisis rangkap tiga. [13] BM Tashtoush, EL Jacobson, MK Jacobson, Metode HPLC cepat untuk penentuan
Gambaran dari pemulihan rata-rata untuk 12 agen pemutih, seperti yang tretinoin dan isotretinoin secara simultan di dermatologis formulasi, J. Pharm. Biomed. Anal. 43
diformulasikan dalam tiga produk kosmetik, ditunjukkan diTabel 6. (2007) 859–864.
[14] M. Brisaert, I. Everaerts, J. Plaizier-Vercammen, Stabilitas kimia tretinoin dalam
Semua pemulihan di atas 90%, yang menunjukkan kesesuaian perlakuan persiapan dermatologis, Pharm Acta Helv. 70 (1995) 161–166.
yang sama untuk 12 zat pemutih yang mungkin ada dalam formulasi kosmetik [15] TMF, Therapeutical Compounding Formularia (therapeutisch Magistraal Untuk-
utama yang ditemukan di pasar UE. mularium - Formulaire Thérapeutique Magistral), edisi ke-2., FAGG, Belgium, 2010.

4. Kesimpulan [16] Sabun proses dingin menggunakan mentega dan minyak eksotis (untuk kulit
normal), http: // www. personalcaremagazine.com/FormulationDetails.aspxFormulasi = 1050,
Metode UHPLC cepat yang memakan waktu 12 menit per analisis Mungkin 2012.

dikembangkan dan divalidasi untuk analisis kualitatif sebagai kuantitatif

sediaan kosmetik yang mengandung serangkaian legal (asam kojat, arbutin, [17] ISO / IEC. 17025, Persyaratan Umum untuk Kompetensi Laboratorium Pengujian
dan Kalibrasi, ISO, Jenewa, 2005,www.iso.org
nikotinamida dan asam salisilat) dan ilegal (hidrokuinon, tretinoin dan enam
dermatologis yang berbeda. kortikosteroid aktif) zat pemutih kulit. Validasi [18] Waters Home page, Informasi teknis tentang kolom UPLC Acquity
http://www.waters.com/waters/partDetail.htm?partNumber=176000875
didasarkan pada pendekatan "kesalahan total" mengikuti persyaratan ISO-
17025. Dapat dibuktikan bahwa metode ini sesuai untuk tujuan dan dapat [19] Statgraphics Centurion XVI.I, Satpoint Technologies, Inc., Warrenton, VA, USA,
digunakan untuk analisis rutin kosmetik pemutih yang dicurigai ilegal. 2012.

Metode ini telah diterapkan pada sampel kosmetik yang diambil dari pasar [20] J. Van Loco, M. Elskens, C. Croux, H. Beernaert, Linearitas kurva kalibrasi:
penggunaan dan penyalahgunaan koefisien korelasi, Akreditasi. Kual. Assur. 7 (2002) 281–285.
ilegal dan tidak menunjukkan gangguan dengan zat umum lainnya, seperti
anti-oksidan (asam askorbat) dan pengawet (methyl-p-hydroxybenzoate dan
ethyl-p-hydroxybenzoate).
[21] M. Feinberg, Validasi metode analisis berdasarkan profil akurasi, J. Kromatogr. A
1158 (2007) 174–183.

Untuk sebagian besar kosmetik ilegal, komposisi kimianya tidak diketahui
atau terdapat label kemasan yang menyesatkan. Keduanya merupakan
ancaman bagi kesehatan masyarakat karena jenis produk ini sering digunakan
di bagian tubuh yang lebih besar (wajah, tangan, belahan dada) untuk jangka
waktu yang lebih lama dan tidak bebas dari efek lokal dan sistemik yang tidak
diinginkan. Metode tersebut menjelaskan deteksi agen pemutih utama dan
dapat digunakan untuk survei pasar terhadap kosmetik pemutih yang dicurigai
ilegal.
[22] A. Gustavo Gonzalez, M. Angeles Herrador, Panduan praktis analitik validasi
metode, termasuk ketidakpastian pengukuran dan profil akurasi, Tren Anal. Chem. 26 (2007)
227–283.
[23] P.Hubert, JJ Nguyen-Huu, B. Boulanger, E. Chapuzet, N. Cohen, PA Com-
pagnon, W. Dewé, M. Feinberg, M. Laurentie, N. Mercier, G. Muzard, L. Valat,
E. Rozet, Harmonisasi strategi untuk validasi analisis kuantitatif-prosedur ical. Sebuah
proposal SFSTP - bagian III, J. Pharm. Biomed. Anal. 45 (2007) 82–96.
[24] PY Sacré, E. Deconinck, P. Chiap, J. Crommen, F. Mansion, E. Rozet, P.
Courselle, JO De Beer, Pengembangan dan validasi cairan berperforma sangat tinggi metode
kromatografi-UV untuk deteksi dan kuantifikasi ereksi obat disfungsi dan beberapa analognya
ditemukan pada obat palsu,
J. Kromatogr. A 1218 (2011) 6439–6447.

[25] E. Deconinck, S. Crevits, P. Baten, P. Courselle, J. De Beer, A tervalidasi ultra

tinggi metode kromatografi cair tekanan untuk kualifikasi dan kuantifikasi asam folat dalam
sediaan farmasi, J. Pharm. Biomed. Anal. 54 (2011) 995–1000.

[26] Halaman muka Arlenda, Pelatihan validasi, 2012, http://www.arlenda.com/en/

training.html

[27] Ph. Eur, European Pharmacopeia, edisi ke-7, Dewan Eropa, Strasbourg, Prancis,
2012.

[28] ICH, Q2 (r1), Konferensi Internasional tentang Harmonisasi: Validasi Ana-

Prosedur litik: Teks dan Metodologi, 1996 (Diadopsi oleh CPMP, Dikeluarkan sebagai
CPMP / ICH281 / 95).