11/8/2007

Topik 9

METODE EVALUASI ANTIOKSIDAN

SECARA IN VITRO DAN IN VIVO

Endang Prangdimurti

DEPARTEMEN ILMU DAN TEKNOLOGI PANGAN

FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR - 2007
PPt e-Learning ENBP

Evaluasi Antioksidan

Dr.Ir. Endang Prangdimurti, MSi

Staf Pengajar Ilmu dan Teknologi Pangan IPB

 Antioksidan adalah senyawa yang dapat menahan

terjadinya reaksi oksidasi makromolekul, seperti
lipid, protein, karbohidrat dan DNA, pada
konsentrasi yang lebih rendah daripada
konsentrasi makromolekul target oksidasi tersebut.

 Antioksidan: ada yang dihasilkan dalam tubuh

(endogen) maupun yang berasal dari makanan
(eksogen).

1
 11/8/2007

Komponen yang terlibat dalam sistem antioksidan

Komponen endogen :
• glutation (GSH) dan Se-glutation peroksidase
• Fe-katalase
• NADPH
• ubiquinol-10 (koenzim Q10 tereduksi)
• Mn, Cu, Zn-SOD (superoksida dismutase)
• asam urat
• asam lipoat
• hormon-hormon dengan aktivitas antioksidan
(contoh: melatonin)
• protein pengikat logam,
misalnya protein pengikat Fe dan Cu (transferin,
seruloplasmin), protein pengikat Fe kompleks
(heptoglobin, hemopexin)

Komponen yang terlibat dalam sistem antioksidan

Antioksidan pangan dan antioksidan eksogen :

• tokoferol dan tokotrienol (vitamin E)

• askorbat (vitamin C)
• vitamin A dan karotenoid (-karoten, likopen, lutein, dll)
• Se (dan logam esensial lainnya yang berperan dalam
fungsi enzim antioksidan)
• senyawa-senyawa fitokimia dengan aktivitas antioksidan
• komponen pangan lain (CoQ10, glutation, asam lipoat, dll)
• antioksidan pangan (BTP) (BHA, BHT, propil galat, TBHQ,
ekstrak rosemary)

Penggolongan antioksidan

Berdasarkan cara kerjanya :

• Antioksidan preventif : menekan pembentukan radikal bebas

- disebut juga antioksidan sekunder

1.a. Dekomposisi hidroperoksida dan hidrogen peroksida : peroksida

didekomposisi menjadi produk nonradikal
Katalase:: dekomposisi
Katalase dekomposisi hidrogen peroksida
Glutation peroksidase (seluler):
(seluler): dekomposisi
dekomposisi hidrogen peroksida dan
hidroperoksida asam lemak bebas
Glutation peroksidase (plasma):
(plasma): dekomposisi
dekomposisi hidrogen peroksida dan fosfolipid
hidroperoksida
Fosfolipid hidroperoksida glutation peroksidase:
peroksidase: dekomposisi
dekomposisi fosfolipid
hidroperoksida
Peroksidase: dekomposisi
dekomposisi lipid hidroperoksida
Glutation S-
S-transferase: dekomposisi
dekomposisi lipid hidroperoksida

2
 11/8/2007

1. b. Pengkelat logam
Transferin, laktoferin:
laktoferin: mengikat Fe
Haptoglobin:: mengikat hemoglobin
Haptoglobin
Hemopexin:: menstabilkan heme
Hemopexin
Seruloplasmin, albumin:
albumin: mengikat Cu

1.c. Pendeaktifasi (quencher) SOA (species oxygen active)

Superoxida dismutase (SOD): disproporsionasi superoksida
Karotenoid, vitamin E : mendeaktifasi singlet oksigen

2. Antioksidan peredam radikal (radical (radical--scavenging

antioxidants): bereaksi dengan senyawa radikal untuk memutus
rantai propagasi
- umumnya antioksidan ini akan berubah menjadi antioksidan
radikal setelah bekerja meredam senyawa radikal
- disebut juga antioksidan primer
- berdasarkan sifat kelarutannya, dibedakan menjadi :
a. Golongan hidrofilik : vitamin
vitamin C, asam urat, bilirubin, albumin
b. Golongan lipofilik : vitamin
vitamin E, ubiquinol, karotenoid, flavonoids

Enzim-enzim antioksidan utama (SOD, katalase, glutation peroksidase)

saling bekerjasama mengeliminir anion superoksida yang terbentuk
secara normal di dalam tubuh

3
 11/8/2007

ANTIOKSIDAN DALAM PANGAN

Antioksidan : antioksidan gizi dan non gizi

Antioksidan non gizi

 vitamin E (tokoferol dan tokotrienol)
 vitamin C (asam askorbat)
 vitamin A dan beta karoten (prekursor non gizi)
 zat gizi esensial untuk berfungsinya sistem antioksidan
endogen, seperti mineral Cu, Mn, Zn, Fe (keempatnya
kofaktor enzim SOD), Se, dan vitamin riboflavin merupakan
kofaktor--kofaktor penting dalam sistem enzim antioksidan.
kofaktor

Vitamin E
 Vitamin E berada pada membran sel dan dalam LDL yang
bersirkulasi
 merupakan antioksidan non polar (antioksidan utama pada
medium non polar)
 α-tokoferol efektif dalam sistem pangan, sedangkan -
tokoferol efektif dalam in vivo.
 Vitamin E bekerja sebagai antioksidan pemutus rantai
(mendonorkan atom H pada radikal) serta mendeaktifasi
singlet oksigen
 Vitamin E radikal dapat diregenerasi oleh vitamin C
 Sumber utama : sayuran, biji-
biji-bijian, minyak kacang-
kacang-kacangan
 RDA : 15 IU

Vitamin E
laboratory and animal studies
 Vitamin E  the oxidation of LDL-
LDL-C
 inhibit smooth-
smooth-muscle cell growth
 inhibit platelet adhesion
 improves endothelial function
 reduced the number and severity of atherosclerotic
lesions in rabbits fed high-
high-fat diets

Clin Cardiol 1993;16:I16-18

4
 11/8/2007

Vitamin C
 merupakan antioksidan utama pada medium polar
(darah, cairan interstitial dan sitosol)
 bekerja mendonorkan atom H pada radikal,
mendeaktifasi anion superoksida dan singlet oksigen,
meregenerasi radikal vitamin E.
 Namun dapat menjadi prooksidan dalam reduksi Fe3+
menjadi Fe2+ (reaksi Fenton)
 Sumber : buah dan sayur
 RDA : 60 mg

Vitamin C
 a water-
water-soluble vitamin
 found in many fruits and vegetables
 a less potent antioxidant than vit E
 associated with lower LDL-
LDL-C, higher HDL
HDL--C,
and lower BP
 inhibits platelet aggregation
 recommended daily allowance 60 mg

Tokoferol mendonorkan atom H-nya kepada radikal lipid peroksida

(LOO*). Radikal tokoferol yang terbentuk diregenerasi oleh vitamin
C (asam askorbat).

5
 11/8/2007

Karotenoid
 Berada di dalam darah dan membran
 Karotenoid dan vitamin A bekerja mendeaktifasi singlet
oksigen dan meredam SOA lain.
 Kemampuan mendeaktifasi singlet oksigen lebih besar
dibandingkan asam askorbat maupun tokoferol

Beta--carotene
Beta
 A plant-
plant-derived nutrient
 contained in yellow and orange vegetables and
fruits, and leafy green vegetables
 provides up to half of dietary vit A
 recommended daily allowance is 5,000 IU

Mineral--mineral
Mineral
Zn, Cu, Mn  kofaktor enzim Superoxide Dismutases (SOD)

Zinc/copper superoxide dismutase

 Mitochondria
 Superoxide (O2-
(O2-) to O2 and water
Manganese superoxide dismutase
 Mitochondia and cytosol
 Superoxide to O2 and water

Se  kofaktor Glutathione peroxidase (GPx)

 Mitochondia
 Peroxides to water

6
 11/8/2007

Antioksidan non gizi

Golongan Contoh senyawa
Karotenoid Likopen, lutein, astaxantin

Bioflavonoid Genistein, diadzein, quercetin

Fitosterol Sitosterol, stigmasterol, oryzanol

Tannin Katekin dan komponen polifenol lainnya

Klorofil Klorofil--a dan klorofilin

Klorofil

Terpenoid Limonin dan limonene

Senyawa allylic Diallyl sulfida dan disulfida

Indoles Indole--3-carbinol
Indole

7
 11/8/2007

METODE EVALUASI ANTIOKSIDAN

Pengujian kapasitas antioksidan suatu senyawa dilakukan secara
bertahap sebagai berikut :
 Uji in vitro menggunakan reaksi kimia, misalnya metil-
metil-
linoleat, DPPH
 Uji in vitro menggunakan materi biologis, misalnya mengukur
viabilitas sel (teknik kultur sel), pembentukan dien
terkonjugasi dan kadar TBARS dari isolat LDL, dan lain-
lain-lain
 Uji in vivo pada model hewan percobaan, misalnya aktifitas
enzim antioksidan, kadar TBARS
 Uji in vivo pada manusia

Pengujian in vitro menggunakan reaksi kimia

DPPH atau ABTS

 DPPH dan ABTS merupakan senyawa radikal yang relatif

stabil.
 DPPH berwarna ungu, namun apabila DPPH tereduksi oleh

suatu antioksidan akan mengakibatkan penurunan intensitas

warna ungu (memudar).
 Semakin besar selisih absorbansi dibandingkan kontrol (tanpa

penambahan antioksidan) menunjukkan semakin tingginya

aktivitas antioksidan senyawa uji.

Pengujian in vitro menggunakan reaksi

kimia
Dien Terkonjugasi
 Oksidasi asam lemak tidak jenuh mengubah ikatan rangkap menjadi

konfigurasi dien terkonjugasi atau konfigurasi trien terkonjugasi.

 Konfigurasi
Konfigurasi--konfigurasi ini dapat diukur dengan spektrofotometer
UV langsung atau melalui kompleks turunan dengan spektra
absorpsi.
 Untuk pengujian antioksidan suatu senyawa uji, senyawa tersebut

diinkubasi bersama-
bersama-sama dengan asam linoleat, kemudian dioksidasi
oleh CuSO4. Kadar dien terkonjugasi diukur pada 245 nm setiap
interval waktu tertentu sejak penambahan CuSO4 sehingga
membentuk kurva oksidasi. Semakin besar aktivitas antioksidan
ditunjukkan oleh semakin panjangnya fase lag (dalam menit)
oksidasi.

8
 11/8/2007

Pengujian in vitro menggunakan materi biologis

Teknik kultur sel

 Senyawa uji dikultur bersama sel limfosit yang diisolasi dari
hewan atau manusia, kemudian diukur tingkat proliferasi sel
tersebut setelah masa inkubasi tertentu.
 Sebagai pembanding digunakan model yang sama namun
diberi stres oksidatif menggunakan senyawa oksidator
(misalnya H2O2), dan sebagai kontrol adalah model tanpa
penambahan senyawa uji.
 Agar dapat menerima respon/sinyal untuk berproliferasi, sel
harus memiliki membran yang utuh. Adanya oksidasi pada
lipid penyusun struktur membran sel mengakibatkan sel tidak
dapat merespon sinyal sehingga tingkat proliferasi sel
menurun.
 Dengan kultur sel dapat diukur pula kadar TBARS sebagai
indikator peroksidasi lipid.

Pengujian in vitro menggunakan materi biologis

LDL teroksidasi
 Model ini menggunakan LDL yang diisolasi dari
hewan atau manusia.
 Senyawa uji diinkubasi bersama-
bersama-sama dengan LDL,
kemudian dioksidasi oleh CuSO4. Kadar dien
terkonjugasi diukur pada 245 nm setiap interval
waktu tertentu sejak penambahan CuSO4 sehingga
membentuk kurva LDL teroksidasi.
 Semakin besar aktivitas antioksidan ditunjukkan oleh
semakin panjangnya fase lag (dalam menit) oksidasi.
 Sebagai pembanding digunakan model yang sama
namun tanpa penambahan senyawa uji.

Pengujian in vivo
(menggunakan hewan percobaan atau manusia)

 Mula-mula senyawa uji diberikan kepada subyek, kemudian

Mula-
diukur keberadaan beberapa komponen yang terlibat dalam
sistem antioksidan tubuh (vitamin E, glutation, askorbat,
aktivitas enzim antioksidan dan lainnya)
 Indikator lainnya yaitu dari pernafasan (hidrokarbon volatil,
H2O2), dari urin (TBARS, eikosanoids) dan dari darah
(TBARS, LDL teroksidasi, H2O2, glutation dan lainnya).
 Apabila menggunakan hewan percobaan dapat dibandingkan
dengan model yang diberi stres oksidatif.

9
 11/8/2007

Vitamin E (tokoferol)

 Status vitamin E dapat diperkirakan dengan pengukuran kadar tokoferol

dan tokotrienol dalam plasma dan/atau jaringan adipose.
 Tokoferol utama dalam plasma, yaitu α dan , diukur dengan HPLC.
Metode terdahulu yaitu dengan menggunakan GC.
 Untuk setiap 10 kali lipat peningkatan konsumsi α-tokoferol, menghasilkan
peningkatan kadarnya dalam plasma sekitar 2 kali lipat.
 Level -tokoferol dalam plasma lebih tinggi daripada -tokoferol meskipun
asupan -tokoferol lebih tinggi. Hal ini terkait dengan peran protein
pengikat -tokoferol.
 Tokotrienol dan tokoferol lain juga mempunyai fungsi antioksidan yang
penting. Oleh karena itu, estimasi status vitamin E dalam tubuh yang hanya
berdasarkan kadar -tokoferol saja adalah tindakan yang kurang tepat atau
bahkan tidak tepat.

Selenium (Se)

 Selenium adalah kofaktor enzim antioksidan glutation

peroksidase (Se-
(Se-GSH-
GSH-Px) yang memiliki bentuk yang
beragam.
 Pengukuran status Se dapat dilakukan dengan mengukur kadar
Se plasma menggunakan graphite
graphite--furnace atomic absorption.
absorption.
 Enzim Se-
Se-GSH-
GSH-Px dapat diukur pada plasma, platelet, dan sel
darah merah (eritrosit).
 Se eritrosit adalah indikator status Se jangka panjang yang
baik, namun analisisnya rumit dikarenakan interferensi dari Fe
dan Cu dalam hemolisat. Oleh karena itu tahap digesti basah
menggunakan asam perklorat dan asam nitrit penting
dilakukan dalam analisis Se eritrosit.

Askorbat (vitamin C)
 Analisis askorbat dalam plasma dilakukan dengan menggunakan
metode HPLC yang telah divalidasi.
 Askorbat dalam plasma terdegradasi menjadi produk sekunder
walaupun disimpan pada suhu -70oC apabila tidak distabilkan dengan
asam metafosforat pada saat kolektif.
 Secara in vitro,
vitro, askorbat dapat juga berperan sebagai prooksidan,
karena askorbat mereduksi ion feri menjadi fero dan mempromosikan
terjadinya reaksi Fenton. Secara in vivo,
vivo, peran askorbat sebagai
prooksidan masih kontroversial.

10
 11/8/2007

Karotenoid
 Sebagai indikator status karotenoid dalam plasma umumnya
berdasarkan kadar likopen dan -karoten dalam plasma.
 Pengukuran status karotenoid akan lebih baik jika
berdasarkan pengukuran beberapa karotenoid dibandingkan
hanya satu parameter.
 Pengukuran kompleks karotenoid dalam jaringan biologis
dapat dilakukan dengan menggunakan metode HPLC.
 Meskipun karotenoid bereaksi dengan cepat dengan singlet
oksigen dan juga bekerja efisien menangkap ROS lain secara
in vitro, namun perannya secara in vivo sebagai antioksidan
belum terbukti secara penuh.

Glutation (GSH)
 Salah satu antioksidan larut air yang utama dalam tubuh
manusia adalah tripeptida glutation (GSH), yang berperan
sebagai kofaktor GSH-
GSH-Px dan GSH-GSH-S-transferase.
 Biosintesis GSH memerlukan asam amino sistein dan
metionin, sehingga kekurangan konsumsi asam amino tersebut
berakibat pada defisiensi GSH.
 GSH dapat diukur dalam plasma, eritrosit, dan limfosit.
 Pengukuran kadar GSH dapat dilakukan dengan kolorimetri
dan HPLC. HPLC dapat mengukur baik GSH maupun GSSG
(glutation tereduksi) dalam plasma, sel dan jaringan.

Enzim--enzim Antioksidan
Enzim
 Analisis dilakukan dengan menggunakan sel darah
merah.
 Setelah dihemolisis, enzim antioksidan yang
umumnya diukur adalah aktivitas enzim :
- superoksida dismutase (SOD)
- katalase
- glutation peroksidase (GSH-
(GSH-Px).

11
 11/8/2007

Enzim SOD
 Berfungsi mempercepat dismutasi superoksida (*O2-).
 Untuk analisis enzim ini dibuat sistem yang
menghasilkan radikal superoksida yaitu sistem
xantin/xantin oksidase.
 Superoksida mengoksidasi suatu senyawa (misalnya
ferisitokrom, NBT) sehingga menghasilkan suatu
kromogen, misalnya ferisitokrom teroksidasi yang
dapat diukur pada 430 nm atau formazan pada 560
nm.

Enzim Katalase
 Enzim katalase memecah H2O2 menjadi H2O dan ½
O2.
 Perubahan absorbansi H2O2 pada 240 nm diukur pada
selang waktu tertentu selama waktu tertentu.
 Kemiringan (slope) kurva menggambarkan aktifitas
katalase. Semakin tinggi aktifitas katalase maka
slope semakin rendah.

Enzim Glutation Peroksidase (GSH-

(GSH-Px)
 Enzim Glutation Peroksidase (GSH-
(GSH-Px) berperan
mereduksi hidrogen peroksida (H2O2) maupun lipid
peroksida (LOOH) dengan keberadaan GSH menjadi
GSSG.
 Pengukuran dilakukan dengan mengukur kadar GSH
tersisa. GSH digenerasi dari sistem lain yang
melibatkan glutation reduktase dan NADPH + H+.

12
 11/8/2007

Struktur Flavonoids

TERIMA KASIH

13