STERILISASI DAN PEMBUATAN MEDIA

A) Sterilisasi
a. Definisi Umum
Sterilisasi merupakan suatu cara atau teknik yang dilakukan untuk
mendapatkan suatu kondisi bebas mikroorganisme atau setiap proses yang dilakukan
baik secara fisika, kimia, dan mekanik untuk membunuh semua bentuk kehidupan
terutama mikroorganisme (Lukluyah et al, 2019).
Bahan, alat dan meja kerja yang akan digunakan dalam praktek di
laboratorium harus melalui tahap sterilisasi terlebih dahulu, hal ini bertujuan supaya
pekerjaan dikerjakan secara aseptis atau terbebas dari mikroba pencemar yang tidak
diinginkan (Murtius, 2018).
Adanya pertumbuhan mikroorganisme menunjukkan bahwa pertumbuhan
bakteri masih berlangsung dan tidak sempurnanya proses sterilisasi, artinya sudah
terjadi kontaminasi di dalamnya dan pengujian atau pekerjaan yang dilakukan tidak
valid . Jika sterilisasi berlangsung sempurna, maka spora bakteri yang merupakan
bentuk paling resisten dari kehidupan mikroorganisme (Lukluyah et al, 2019).

b. Jenis Sterilisasi
Menurut Murtius (2018), jenis-jenis strelisasi sebagai berikut :
A. Sterilisasi secara Fisis
1) Pemanasan
(a) Sterilisasi Kering (Panas Kering)
Beberapa cara yang dapat dilakukan pada sterilisasi kering adalah :
 Pemijaran
Pemijaran merupakan suatu kegiatan membakar langsung alat-
alat seperti ujung ose, ujung pinset, ujung spatula yang berbahan
logam. Pemijaran dilakukan sampai alat-alat tersebut berwarna merah
pijar. Gambar pemijaran seperti gambar berikut.
 Flaming (Jilatan Api)
Alat-alat seperti kaca objek, cawan petri yang telah berisi
media, mulut erlenmeyer yang berisi media dan jarum cukup
dilakukan jilatan api atau melewatkan alat tersebut pada nyala api
bunsen. Artinya alat-alat tersebut hanya mengalami jilatan api dan
tidak sampai memijar.

 Udara Panas
Umumnya sterilisasi kering dilakukan dengan cara ini, dimana
alat yang digunakan adalah oven. Suhu yang biasa digunakan 160-
180˚C selama 1-2 jam. Sterilisasi kering dengan oven ini baik
dilakukan terhadap alat-alat kering yang terbuat dari kaca, seperti:
cawan petri, tabung reaksi, botol sampel, pipet, alat suntik kaca,
pinset, gunting, bahan-bahan yang tidak tembus uap seperti gliserin,
minyak, vaselin, bubuk, dan atau apa saja yang tidak menjadi rusak,
menyala, hangus atau menguap pada suhu tinggi.
Penyusupan panas ke dalam bahan pada metode ini
berlangsung sangat lambat, oleh karena itu pada saat sterilisasi harus
dalam lapisan tipis dan jumlah yang sedikit, harus dilindungi dalam
 wadah tertutup dengan cara membungkus atau menyumbat untuk
mencegah kontaminasi setelah dikeluarkan dari oven. Untuk
menjamin efektivitas proses sterilisasi perlu diperhatikan muatan
(jumlah alat yang dimasukkan kedalam oven) agar tersedia cukup
ruangan untuk bergeraknya aliran udara panas. Oven yang digunakan
untuk sterilisasi seperti gambar berikut.

(b) Sterilisasi Basah (Panas Basah)

Sterilisasi basah dapat dilakukan dengan beberapa cara, diantaranya:
 Uap Mengalir
Merupakan sterilisasi dengan menggunakan uap pada suhu
100˚C yang dialirkan pada benda yang disterilkan secara berulang-
ulang (tiga sampai empat kali beberapa menit) dengan selang waktu
24 jam. Atau sterilisasi dengan uap mengalir ini juga disebut dengan
sterilisasi bertingkat atau tyndalisasi. Cara ini dikenalkan oleh John
Tyndall (1820-1893). Keuntungan cara ini ialah tidak membutuhkan
alat khusus. Namun gelatin, susu, dan karbohidrat, karena bahan-
bahan tersebut akan mengalami hidrolisis bila dipakai suhu yang lebih
tinggi atau waktu yang lebih lama.

 Penggodogan dalam Air

Penggodogan dilakukan untuk mematikan mikroorganisme
yang tidak berspora. Penggodogan dalam air mendidih atau mencapai
 suhu 100˚C, hanya selama 5 menit biasanya sudah cukup mensterilkan
untuk peralatan rumah tangga, asalkan air benar-benar kontak secara
langsung dengan alat tersebut, tidak hanya bagian luar atau permukaan
saja tetapi sampai ke bagian dalam. Akan tetapi sterilisasi dengan cara
ini dapat dilakukan dengan waktu yang lebih lama, tergantung tingkat
kontaminasi alat yang disterilkan. Keadaan steril yang tidak dapat
dicapai dengan penggodogan dalam air panas selama 1 jam dapat
dilanjutkan dengan uap mengalir. Penggodogan dapat dilakukan
dengan waterbath. Gambar waterbath seperti gambar berikut.

 Uap Bertekanan
Autoklaf merupakan alat yang digunakan dalam sterilisasi
menggunakan uap dalam tekanan. Dalam autoklaf uap berada dalam
keadaan jenuh, dan peningkatan tekanan mengakibatkan suhu yang
tercapai menjadi lebih tinggi. Sterilisasi cara ini menggunakan suhu
121˚C selama 15-20 menit dengan tekanan 1 atm. Tekanan yang lebih
besar akan dibutuhkan pada tempat-tempat yang lebih tinggi dari
permukaan laut. Udara yang berada dalam autoklaf harus dikeluarkan
semuanya untuk memperoleh suhu yang diinginkan (121˚C).
Alat dan bahan yang disterilkan dengan cara ini akan dilewati
oleh uap panas selama proses sterilisasi berlangsung. Sehingga bahan-
bahan yang disterilkan dengan cara ini harus yang bersifat permeabel
terhadap uap panas dan tidak rusak pada suhu 110-121˚C. Panas
lembab sangat efektif untuk mensterilkan bahan dan alat meskipun
pada suhu yang tidak terlalu tinggi, karena ketika uap air
berkondensasi pada bahan dan alat yang disterilkan, dilepaskan panas
sebanyak 686 kalori per gram uap air pada suhu 121˚C. Sterilisasi cara
ini efektif untuk semua mikroorganisme, baik vegetatif maupun spora.
Beberapa hal yang menjadi prinsip pada sterilisasi dengan
autoklaf adalah: 1) Sterilisasi bergantung pada uap, sehingga udara
harus benar-benar dikosongkan dari sterilisator. 2) Semua bagian
bahan yang disterilkan harus benar-benar dilalui oleh uap panas,
sehingga labu kosong dan tabung sebaiknya diletakkan dengan posisi
tidur agar udara tidak terperangkap di dasarnya. 3) Bahan-bahan yang
berpori atau yang berbentuk cair harus permeabel tehadap uap. 4)
Suhu harus mencapai 121˚C dan dipertahankan selama 15-20 menit.
Gambar autoklaf terdapat pada gambar berikut.
  Penyinaran
Sterilisasi secara fisis dapat juga dilakukan dengan penyinaran
sinar UV (ultra violet). Biasanya safety cabinet akan dilengkapi
dengan lampu UV guna mensterilkan permukaan interior safety
cabinet tersebut, atau untuk mencegah kontaminasi selama proses
penurunan suhu media atau alat-alat yang baru dikeluarkan dari oven
atau autoklave sebelum digunakan. Selain itu lampu UV juga bisa
dipasang dalam sebuah ruangan untuk mensterilkan ruangan.

B. Sterilisasi Kimiawi
Sterilisasi dengan menggunakan metode kimia dilakukan dengan
menggunakan agen-agen kimia. Untuk beberapa sterilisasi benda atau alat, banyak
digunakan pula desinfektan. Sterilisasi kimia ini dapat lebih selektif dibandingkan
dengan metode fisik, sehingga dikenal berbagai substansi kimia yang bertindak
sebagai bakterisida, sporosida, virisida dan fungisida (Lukluyah et al, 2019).
Biasanya digunakan senyawa desinfektan antara lain: 1) Peralatan besar
dengan menggunakan HCl, HgCl2, Formalin, Phenol, Chlorin dan alkohol. 2)
Lingkungan dengan menggunakan pestisida dan antiseptis. 3) Media dengan Na
Thiosulfat. Biasanya yang paling banyak digunakan adalah alkohol, baik untuk
menstrilkan alat, tangan pekerja ataupun meja kerja (Murtius, 2018).
Formaldehida dan metil bromide merupakan contoh agen-agen kimia yang
cukup banyak digunakan untuk aplikasi sterilisasi dengan metode kimia.
Formaldehida merupakan agen kimia berupa cairan yang larut air tak berwarna,
membuat pedih atau iritasi terhadap mata dan membrane mucous, digunakan
terutama untuk pengendalian fungi. Metil bromide merupakan agen kimia berupa
gas (fumigasi), bersifat letal terhadap manusia dan hewan tetapi tidak berbahaya
untuk tanaman, digunakan untuk pengendalian nematode, fungi, insekta, dan juga
benih rumput-rumputan (Lukluyah et al, 2019).

C. Sterilisasi Mekanik
Sterilisasi secara mekanik dengan menggunakan saringan berpori yang sangat
kecil, biasanya berkisar (0.22 - 0.45 mikron), sehingga mikroba tertahan pada
saringan tersebut. Alat yang dikenal dengan mikrofilter tersebut berkerja dengan
gaya sentrifugasi atau pompa vakum. Dimana pada sterilisasi ini: bakteri tertahan
disaringan, virus tidak dapat tersaring, dan digunakan untuk bahan yang tidak
tahan panas dan mudah menguap, seperti vitamin, larutan enzim dan antibiotic.
Mikrofilter dapat dilihat pada gambar.
Macam-macam mikrofilter :
1. Non-disposable filtration apparatus
- Disedot dengan pompa vakum
- Volume 20-1000 ml
2. Disposable filter cup unit
- Disedot dengan pompa vakum
- Volume 15-1000 ml
3. Disposable filtration unit dengan botol penyimpan
- Disedot dengan pompa vakum
- Volume 15-1000 ml
4. Syringe filters
- Ditekan seperti jarum suntik
- Volume 1-20 ml
5. Spin filters
- Ditekan dengan gaya setrifugasi
- Volume kurang dari 1 ml

(Gambar Non-disposable filtration apparatus)

c. Langkah Kerja
A. Persiapan melakukan sterilisasi alat
1. Siapkan semua alat yang akan digunakan pada saat kerja.
2. Bungkuslah semua alat (yang terbuat dari gelas kaca dan yang tahan terhadap
pemanasan) menggunakan kertas sampul coklat, beberapa alat menggunakan
aluminium foil dan kemudian ikat kencang menggunakan karet.
3. Masukan semua alat yang sudah terbungkus rapat ke dalam autoklaf.
4. Nyalakan autoklaf dan lakukan proses sterilisasi (dengan suhu 121ºC ,
tekanan 2 atm , selama 15 menit).
5. Setelah selesai proses sterilisasi, keluarkan semua alat dan letakkan di tempat
yang bersih (ingat, keluarkan alat apabila suhu di autoklaf sudah
menunjukkan angka nol 0).
6. Jangan membuka pembungkus jika alat tersebut belum akan digunakan
(bungkus dibuka hanya apabila alat tersebut akan digunakan. Hal ini
dilakukan sebagai upaya untuk meminimalisir terjadinya kontaminasi
terhadap alat-alat yang sudah steril).
(Lukluyah et al, 2019)

B. Mikrofilter (Non-disposable filtration apparatus):

1. Sterilkan saringan, membran penyaring, dan wadah penampung (erlenmeyer)
2. Rakit alat-alat sesuai ketentuannya secara aseptis, isi corong dengan larutan
yang akan disterilkan
3. Hubungkan katup erlenmeyer dengan pompa vakum lalu hidupkan pompa
4. Setelah larutan melewati membran dan tertampung dierlenmeyer seluruhnya,
lalu tutup erlenmeyer dengan kapas atau aluminium foil.
(Murtius, 2018)

C. Autoklaf Konvensional
1. Siapkan autoklaf
2. Tuang air ke dalam tubuh sterilisator hingga 2/3 dasar keranjang
3. Tata alat dan media yang akan di sterilisasi didalam tabung sehingga tersedia
ruangan untuk pergerakan uap air.
4. Tutup sterilisator dengan cara mempertemukan lubang baut, sambil diputar
untuk lebih rapat
 5. Buka klep pengatur pengamanan, hidupkan api atau listrik
6. Bila uap mulai keluar (bunyi mendesis), tutup klep pengaman, tekanan
didalam akan naik dan baca pada alat ukur tekanan sampai 1 Atm (121˚C)
7. Jika sudah tercapai, pertahankan selama 15 menit dengan cara membuka klep
pengukur tekanan untuk mengurangi panas
8. Pada akhir proses, matikan api dan tunggu tekanan hingga nol, suhu dibawah
100˚C
9. Keluarkan keranjang serta alat dan bahan dari dalam sterilisator
(Murtius, 2018)

D. Autoklaf Hirayama
1. Siapkan autoklaf
2. Tuang air ke dalam tubuh sterilisator hingga 2/3 dasar jirigen
3. Hidupkan sterilisator, buka kunci penutup dengan menggeser ke arah kanan,
lalu buka penutup sterilisator
4. Tata alat dan media yang akan di sterilisasi didalam keranjang pada autoklaf
sehingga tersedia ruangan untuk pergerakan uap air.
5. Tutup sterilisator kemudian kunci dengan menggeser kearah kiri
6. Atur suhu dan waktu yang diinginkan (121˚C, 20 menit)
7. Tunggu hingga suhu dan waktu tercapai, kemudian biarkan suhu kembali
turun sekitar dibawah 70˚C atau hingga kunci penutup sterilisator bisa dibuka
8. Buka penutup sterilisator dengan hati-hati, karena uap panas bisa jadi akan
keluar, biarkan hingga memungkin untuk mengeluarkan keranjang dari dalam
sterilisator
9. Keluarkan keranjang serta alat dan bahan dari dalam sterilisator
(Murtius, 2018).

E. Oven
1. Siapkan oven
2. Untuk penggunaan oven, cukup dengan menyetel pada suhu yang diinginkan
(160˚C) set stopwatch selama 2 jam, setelah alat-alat yang akan disterilkan
disusun sedemikian rupa (tetap menyediakan ruang untuk udara panas)
3. Keluarkan alat yang disterilisasi dan masukkan ke dalam desikator sampai
suhu stabil (stabilkan hingga suhu kamar) (Murtius, 2018).
B) Pembuatan Media
a. Definisi Umum
Media merupakan bahan yang terdiri dari zat-zat makanan (nutrient) yang
diperlukan mikroorganisme untuk pertumbuhannya. Sedangkan larutan pengencer
adalah larutan yang digunakan untuk memperkecil jumlah mikroorganisme yang
tersuspensi (Murtius, 2018).
Media dapat memanipulasi tempat tumbuhnya biakan atau menjadikan media
sebagai isolat tempat tumbuhnya, dan sekaligus memanipulasi komposisi media
pertumbuhannya (Martius, 2018). Media selain untuk menumbuhkan mikroba juga
dibutuhkan untuk isolasi & inokulasi mikroba serta untuk uji fisiologi dan biokimia
mikroba. Media yang baik untuk pertumbuhan mikroba adalah yang sesuai dengan
lingkungan pertumbuhan mikroba tersebut, yaitu : susunan makanannya dimana
media harus mengandung air untuk menjaga kelembaban dan untuk pertukaran zat
atau metabolisme, juga mengandung sumber karbon, mineral, vitamin dan gas,
tekanan osmose yaitu harus isotonik, derajat keasaman/pH umumnya netral tapi ada
juga yang alkali, temperatur harus sesuai dan steril (Yusmaniar et al, 2017).
Media terdiri dari bahan dasar, nutrient dan ataupun bahan tambahan
(Murtius, 2018). Media harus mengandung semua kebutuhan untuk pertumbuhan
mikroba, yaitu: sumber energi misalnya gula, sumber nitrogen, juga ion inorganik
essensial dan kebutuhan yang khusus, seperti vitamin. Media pertumbuhan
mengandung unsur makro yang dibutuhkan mikroba seperti karbon (C), Hidrogen
(H), oksigen (O), Nitrogen (N), dan Phospor (P). selain itu media juga mengandung
unsur mikro seperti besi (Fe), dan Magnesium (Mg). Media juga dapat mengandung
bahan tambahan lain seperti indikator phenol red. Sifat media pembenihan yang ideal
adalah mampu memberikan pertumbuhan yang baik jika ditanami kuman, mendorong
pertumbuhan cepat, murah, mudah dibuat kembali, dan mampu memperlihatkan sifat
khas mikroba yang diinginkan (Yusmaniar et al, 2017). Media sebelum digunakan
harus disterilisasi terlebih dahulu, sterilisasi yang digunakan adalah sterilisasi panas
basah (autoklaf) (Murtius, 2018).
b. Jenis Media
1) Media berdasarkan berdasarkan konsistensi atau kepadatannya :
 Medium cair (broth / liquid medium)
Yaitu medium yang tidak mengandung agar, contohnya adalah NB (Nutrient
Broth), LB (Lactose Broth). Medium cair akan memberi kesempatan kepada
bakteri untuk menyebar dan tercampur dengan seluruh nutrient, sehingga
lebih cocok untuk mengoptimalkan pertumbuhan mikroba. Medium cair dapat
juga digunakan untuk mengetahui karakter suatu mikroba berdasarkan
kebutuhan oksigen (Lukluyah et al, 2019).
 Medium setengah padat (semi solid medium)
Yaitu medium yang mengandung agar 0,3-0,4% sehingga menjadi sedikit
kenyal, tidak padat dan tidak begitu cair. Mediumsemi solid dibuat dengan
tujuan agar mikroba dapat menyebar ke seluruh media namun tidak
mengalami pencampuran sempurna jika dilakukan agitasi atau penggoyangan
(Lukluyah et al, 2019).
 Medium padat (solid medium)
Medium semi solid dan solid menggunakan bahan pemadat (seperti amilum,
gelatin, selulosa dan agar-agar). Untuk medium padat / solid, dapat
menggunakan agar-agar dengan kadar 1,5 % - 1,8 % (15 g agar/l liter
aquades). Fungsi medium padat untuk memudahkan penghitungan koloni
mikroba (Lukluyah et al, 2019).

2) Media berdasarkan berdasarkan komposisi bahannya :

 Media sintetik/media terdefinisi (synthetic media/defined media)
Adalah media yang seluruh komposisinya diketahui, contohnya adalah media
yang telah diproduksi oleh pabrik yang telah memiliki komposisi media yang
telah rinci dan jelas. Media sintetik digunakan dalam penelitian mengenai uji
metabolisme suatu mikroorganisme. Banyak jenis mikroorganisme
kemoorganotrof heterotrof dapat tumbuh pada media sintetik dengan glukosa
sebagai sumber karbon dan ammonium salt sebagai sumber nitrogen
(Lukluyah et al, 2019 dalam Prescott, 2002).
  Media kompleks (complex media)
Adalah media yang sebagian komposisinya tidak diketahui dengan pasti,
contohnya adalah media yang telah dibuat secara mandiri dengan bahan-
bahan tertentu namun pembuat tidak mengetahui pasti komposisi dari bahan-
bahan tersebut secara pasti dan rinci. Media ini dapat mengandung bahan
yang tidak diketahui pasti komposisinya seperti peptone, meat extract dan
yeast extract. Contoh media kompleks, adalah nutrient broth, tryptic soy broth
dan MacConkey agar (Lukluyah et al, 2019 dalam Prescott, 2002).

3) Media berdasarkan berdasarkan tujuannya :

 Media isolasi
Adalah media umum yang digunakan untuk mengisolasi suatu mikroba
menjadi kultur murni. Media isolasi biasanya mengandung semua kebutuhan
mikroba untuk tumbuh dan tergantung tujuan isolasinya, misalnya Blood agar
atau Chocolate agar, NA, NB, PDA, TEA, PCA (Lukluyah et al, 2019 dalam
Barrow and Feltham, 1993).
 Media selektif (selective or inhibitory media)
Berfungsi untuk menumbuhkan mikroba target atau yang diinginkan dan
menekan pertumbuhan mikroba yang tidak diinginkan (background flora).
Umumnya media selektif menseleksi mikroba target berdasarkan kelompok,
genus atau spesiesnya, misalnya EMBA untuk seleksi E. coli, Baird parker
untuk isolasi S. aureus; MRS untuk bakteri asam laktat (Lukluyah et al, 2019
dalam Barrow and Feltham, 1993).
 Media pengaya (enrichment media)
Media pengaya termasuk media selektif namun lebih berfungsi untuk
memperbanyak mikroba target sehingga saat dilakukan pengkulturan,
mikroba yang tidak diinginkan tidak dalam jumlah besar. Media pengaya
harus dalam bentuk cair dan digunakan di awal tahap analisa. Misalnya untuk
memisahkan bakteri penyakit tifus (Salmonella typhi) dari bahan tinja atau
kotoran manusia .salah satu contoh media pengkaya adalah media baird
parker water (BPW) (Lukluyah et al, 2019 dalam Barrow and Feltham, 1993).
 Media peremajaan kultur (maintenance of cultures media)
 Media peremajaan kultur mengandung nutrisi sehingga mempercepat
pertumbuhan, misalnya Nutrient Agar (NA) (Lukluyah et al, 2019 dalam
Barrow and Feltham, 1993).

c. Langah Kerja
Menurut Lukluyah et al (2019), langkah kerja dalam pembuatan media ini ialah
sebagai berikut :
A. Alat dan Bahan
 Alat
1) Autoklaf
2) Timbangan analitik
3) Pembakar bunsen
4) Kompor listrik / penangas air
5) Tabung reaksi dan rak tabung
6) Magnetic stirrer
7) Cawan petri
8) Karet gelang
9) Colony counter
10) Alumunium foil
11) Beaker glass
12) Kapas
13) Batang pengaduk
14) Gelas ukur
15) Erlenmeyer
16) Kertas pembungkus
17) Pipet berukuran / volume
18) Jarum ose
19) Filler (Ruber bulb)
20) Batang penyebar
21) Kertas pH universal
22) Botol kaca
23) Mortar atau pestle
24) Vortex
 Bahan
1) Medium Nutrient Agar (NA)
Beef extract 3 g, peptone 5 g, agar-agar 15 g, aquades 1000 ml, pH 7,2.
2) Medium Potato Dextrose Agar (PDA)
Kentang 200 g, dextrose 20 g, agar-agar 15 g dan aquades 1000 ml

 Cara Kerja
1) Medium Nutrient Agar (NA)
a) Timbanglah semua bahan, masukkan ke dalam erlenmeyer atau
beaker glass atau wadah lain, tambahkan aquades dan aduk dengan
pengaduk gelas sampai larut.
b) Panaskan larutan media tersebut dalam penangas air sampai
homogeny (ditandai dengan tidak ada gumpalan media seikitpun)
sambil sering diaduk-aduk sampai semua agar-agar larut (perhatikan
dengan baik, jangan sampai tumpah karena suhu terlalu panas).
c) Masukkan media yang sudah larut dan homogen tersebut ke dalam
botol kaca , kemudian tutup rapat. Jika tidak menggunakan botol
kaca, bisa menggunakan erlenmeyer. Kemudia tutuplah erlenmeyer
tersebut menggunakan kapas, kemudian dilapisi alumunium foil dan
ikatlah kencang menggunakan karet.
d) Berikan lebel pada botol kaca atau erlenmeyer yang sudah berisi
media.
e) Sterilkan menggunakan autoklaf dengan suhu 121⁰ C selama 15
menit. Jika tidak ada autoklaf, dapat diganti dengan pressure cooker
(panci presto).
f) Bila waktu sterilisasi sudah selesai dan suhu pada autoklaf sudah
menunjukkan angka nol (0), keluarkan media dan letakkan di tempat
yang bersih.
g) Perhatikan media jangan sampai menjendal.
h) Media sudah dapat digunakan (suhu jangan terlalu panas dan jangan
terlalu rendah, suhu optimal pada saat akann digunakan antara 45-
50ºC).
2) Medium Potato Dextrose Agar (PDA)
a) Buang kulit kentang, cuci, lalu potong-potong kecil. Rebus dengan
1000 ml aquades sampai kentang matang, tetapi jangan terlalu lama
memasaknya.
b) Saring air rebusan kentang menggunakan kain saring atau
penyaring teh/santan, dan tambahkan aquades sampai 1000 ml.
c) Tambahkan 20 g dextrose dan 15 g agar-agar, aduk hingga
homogen, masukkan ke dalam penangas air mendidih, ditutup,
sambil sering diaduk-aduk selama 30 menit sampai semua agar-
agar larut.
d) Masukkan media yang sudah larut dan homogen tersebut ke dalam
botol kaca , kemudian tutup rapat. Jika tidak menggunakan botol
kaca, bisa menggunakan erlenmeyer. Kemudian tutuplah
erlenmeyer tersebut menggunakan kapas, kemudian dilapisi
alumunium foil dan ikatlah kencang menggunakan karet.
e) Berikan lebel pada botol kaca atau erlenmeyer yang sudah berisi
media.
f) Sterilkan menggunakan autoklaf dengan suhu 121ºC selama 15
menit. Jika tidak ada autoklaf, dapat diganti dengan pressure cooker
(panci presto).
g) Bila waktu sterilisasi sudah selesai dan suhu pada autoklaf sudah
menunjukkan angka nol (0), keluarkan media dan letakkan di
tempat yang bersih.
h) Perhatikan media jangan sampai menjendal.
i) Media sudah dapat digunakan (suhu jangan terlalu panas dan
jangan terlalu rendah , suhu optimal pada saat akann digunakan
antara 45- 50ºC).