Enzymatic biodiesel production by hydroesterification using waste cooking oil as feedstock

Matheus J. Costa, Milena R.L. Silva, Eric E.A. Ferreira, Ana Karine F. Carvalho, Rodrigo C. Basso, Ernandes B. Pereira,
Heizir F. de Castro, Adriano A. Mendes, Daniela B. Hirata

Abstrak

Produksi biodiesel diselidiki dengan hidroesterifikasi menggunakan katalisis enzimatik dalam reaksi hidrolisis dan
esterifikasi. Minyak kedelai yang dihasilkan dari proses penggorengan makanan (WCO) digunakan sebagai bahan baku.
Lipase dari Geotrichum candidum diproduksi dengan fermentasi terendam dan digunakan tanpa pemurnian sebelumnya
sebagai biokatalis dalam hidrolisis WCO, yang dioptimalkan menggunakan desain faktorial. Hidrolisis lengkap WCO
(44,1% fraksi massa) diperoleh setelah 80 menit reaksi pada 40 ◦C, dilakukan dalam sistem bebas pengemulsi tanpa
buffer (40◦C dan 900 rpm). Pada langkah selanjutnya, FFA yang diperoleh dari reaksi hidrolisis diesterifikasi (40 ◦C, 200
rpm) menggunakan etanol sebagai acyl-acceptor (1:1.5) dan Pseudomonas fluorescenslipase (PFL) diimobilisasi pada
styrene-divinylbenzene (SDB) sebagai biokatalis (15% m/v). Biokatalis ini didaur ulang selama 6 siklus tanpa kehilangan
aktivitas yang signifikan. Komposisi biodiesel ditemukan dengan kromatografi gas, dan resonansi magnetik inti proton
(1H NMR) dan Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) digunakan untuk memverifikasi kualitas dan kemurnian
biodiesel. Biodiesel enzimatik mencapai kandungan FAEE 94.1 ± 0,5% dan tidak ada jejak monoasigliserol (MAG),
diasilgliserol (DAG), triasilgliserol (TAG) atau gliserol bebas yang diamati, menunjukkan bahwa rute hidroesterifikasi
menghasilkan biodiesel berkualitas tinggi, meskipun fakta bahwa WCO digunakan sebagai bahan baku.

1. Perkenalan

Perkembangan teknologi masyarakat modern yang merajalela telah mendesak peningkatan pembangkit energi, oleh
karena itu pencarian sumber energi yang lebih bersih dan terbarukan menjadi perlu untuk menghindari bencana
perubahan iklim di planet ini, yang telah dikaitkan dengan emisi gas yang besar ke atmosfer dari penggunaan bahan
bakar fosil yang ekstensif [1,2].

Di Brasil, produksi energi dari sumber tak terbarukan masih dominan. Pembangkitannya dari sumber tidak
terbarukan seperti minyak, gas alam, antara lain, menyumbang 57,1% pada tahun 2017 berbeda dengan 42,9% energi
yang dihasilkan menggunakan sumber terbarukan, seperti tenaga air, biomassa tebu, di antara sumber terbarukan
lainnya [3]. Diesel, yang berasal dari minyak, telah banyak digunakan sebagai bahan bakar pada mesin kendaraan. Pada
periode yang sama, itu menyumbang 44% dari semua energi yang dikonsumsi di sektor transportasi Brasil [3]. Oleh
karena itu, cukup menarik untuk menggantinya dengan biofuel, misalnya biodiesel, agar sangat mempengaruhi matriks
energi Brasil.

Biodiesel adalah biofuel yang dihasilkan dari sumber biomassa terbarukan, biodegradable dan kurang beracun dari
solar dan dapat digunakan dalam mesin pembakaran internal sebagai pengganti diesel tanpa modifikasi mekanis [4].
Selain itu, keuntungan signifikan lainnya yang diperoleh dari penggantian solar dengan biodiesel adalah: biodiesel
mencapai kinerja yang lebih baik dalam proses pembakaran mesin karena pengurangan emisi karbon monoksida dan
partikel yang dihasilkan dari pembakaran hidrokarbon yang tidak sempurna; titik didihnya jauh lebih tinggi (150◦C), yang
membuatnya kurang mudah berubah dan lebih aman untuk diangkut dan disimpan; ia memiliki sifat pelumas yang
mengurangi keausan mekanis mesin, sehingga memperpanjang umur operasionalnya [4].

Saat ini, unit produksi biodiesel industri Brasil mempekerjakan hampir seluruh rute transesterifikasi menggunakan
katalis dasar, sedangkan minyak kedelai olahan menyumbang 65% dari semua bahan baku yang digunakan untuk
produksi biodiesel [3]. Dalam rute ini, minyak kedelai yang digunakan sebagai bahan baku harus disuling karena
sejumlah kecil FFA (>2,5%) [1,5–8] atau/ dan air [7,8] dalam minyak mentah atau limbah dapat menghasilkan reaksi
dengan katalis dasar, terutama NaOH atau KOH, sehingga membentuk sabun, menetralkan katalis, mengurangi jumlah
biodiesel yang dikonversi dan selanjutnya menghambat pemurniannya [6–8]. Penggunaan minyak sulingan sebagai
bahan baku menyumbang hingga 80% dari total biaya produksi biodiesel, yang merupakan variabel penting dalam
proses ini [7,8].

Penggunaan WCO sebagai bahan baku untuk produksi biodiesel membuat proses ini menarik secara ekonomis,
karena memiliki nilai biaya yang lebih rendah, selain untuk menghindari persaingan langsung dengan minyak nabati
yang dapat digunakan untuk konsumsi manusia, seperti minyak kedelai, bunga matahari atau canola dan juga minyak
nabati. membantu pelestarian lingkungan dengan menetapkan tempat pembuangan yang sesuai untuk WCO [8].
Namun, umumnya WCO memiliki kadar FFA dan air di atas yang direkomendasikan untuk digunakan langsung dalam
reaksi transesterifikasi katalis basa, sehingga minyak ini memerlukan perlakuan awal untuk menghindari masalah
tersebut [1,5–8].

Meskipun penghilangan kelebihan air dan FFA sebelum transesterifikasi dapat dilakukan untuk meningkatkan
kinerja reaksi dan kualitas biodiesel, langkah-langkah pra-perlakuan cenderung meningkatkan biaya produksi biodiesel,
sehingga strategi lain telah diusulkan untuk menggunakan WCO sebagai bahan baku. [8]. Dalam konteks ini,
hidroesterifikasi akhir-akhir ini menarik perhatian besar karena memungkinkan untuk menghasilkan biodiesel
berkualitas tinggi.8,11,20,22], tidak perlu menyiapkan bahan baku terlebih dahulu dan, selain itu gliserol yang diperoleh
jauh lebih murni daripada yang dihasilkan dari reaksi transesterifikasi katalis basa klasik [1,6, 11].

Hidroesterifikasi dapat dijelaskan secara singkat dalam dua langkah: reaksi hidrolisis diikuti oleh reaksi esterifikasi.
Pada langkah pertama, semua WCO dihidrolisis sehingga memicu reaksi kimia antara WCO dengan air, sehingga
melepaskan asam lemak bebas dan gliserol, terlepas dari kandungan asam dan air awalnya.8–10]. Pada akhir reaksi
hidrolisis, FFA yang dihasilkan diesterifikasi dengan alkohol rantai pendek untuk menghasilkan biodiesel dan air.8].

Rute hidroesterifikasi juga dapat menjadi proses yang ramah lingkungan dengan menggunakan lipase sebagai katalis
dalam satu atau kedua langkah reaksi. Lipase memiliki beberapa keunggulan dibandingkan katalis kimia seperti
selektivitas yang tinggi, spesifisitas yang tinggi, kondisi operasi yang ringan dan kemurnian produk yang tinggi.12].
Selanjutnya, proses yang dikatalisis oleh lipase dianggap sebagai proses alami dan ada keuntungan lain yang perlu
disebutkan: tidak ada produksi bersama, dan oleh karena itu tidak perlu langkah tambahan untuk pemurnian biodiesel
[13]. Namun, tingginya biaya lipase masih menjadi kendala utama untuk eksploitasi penuh mereka [7,14–16,19]

Karya ini mengevaluasi produksi biodiesel dengan rute hidroesterifikasi menggunakan WCO sebagai bahan baku dan
lipase sebagai biokatalis di kedua langkah – reaksi hidrolisis dan esterifikasi . Pertama, WCO dihidrolisis sepenuhnya dan
kemudian FFA yang dihasilkan dipisahkan dari fase air (larutan gliserol) dan diesterifikasi menggunakan etanol. Dalam
kedua langkah, katalis enzimatik digunakan: GCL-I (ekstrak kasar) yang dihasilkan oleh fermentasi terendam digunakan
dalam langkah hidrolisis dan lipase komersial dariPseudomonas fluorescens(PFL), diimobilisasi pada
stirenadivinilbenzena (SDB) melalui adsorpsi fisik, digunakan dalam langkah esterifikasi.

GCL-I (ekstrak kasar) dipilih untuk reaksi hidrolisis karena produksinya yang murah dan aktivitas katalitik yang tinggi
dalam hidrolisis beberapa minyak.17]. Untuk reaksi esterifikasi, PFL dipilih karena aktivitas katalitiknya yang tinggi dalam
reaksi yang dilakukan dalam media tidak berair.18]. Etanol dipilih sebagai akseptor asil karena kurang beracun
dibandingkan metanol dan sangat tersedia di Brasil, di mana ia diproduksi dari sumber terbarukan [9].

Beberapa penelitian telah melaporkan produksi biodiesel dengan hidroesterifikasi menggunakan minyak asam dan
katalisis enzimatik.6,9–11,13,20–24], namun hanya setengah dari mereka yang menggunakan katalisis enzimatik dalam
kedua reaksi hidroesterifikasi [9–11,20,23]. Ini adalah studi pertama tentang produksi FFA dengan hidrolisis WCO
menggunakan GCL-I sebagai biokatalis dan reaksi esterifikasi yang dikatalisis oleh PFL amobil.

2. Bahan dan Metode

2.1 Bahan

Minyak kedelai goreng bekas (WCO) dari penggorengan makanan dikumpulkan dari restoran di Universitas Federal
Alfenas (Minas Gerais, Brasil). Lipase dari Pseudomonas fluorecens dibeli dari Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Resin
poli-(stirena-divinilbenzena) (Diaion HP 20) dibeli dari Supelco (Bellefonte, PA, USA). Memiliki luas permukaan 500
m2/g, ukuran partikel rata-rata 250–850 m dan ukuran pori rata-rata 260 (Informasi teknis Supelco). Minyak zaitun
(Carbonell) dibeli di pasar lokal (Alfenas, MG, Brazil). Gum Arabic diperoleh dari Synth® (Sao Paulo, SP, Brasil). Semua
reagen kimia dan pelarut organik lainnya memiliki tingkat analitik yang diperoleh dari Synth® (Sao Paulo, SP, Brasil).

2.2 Produksi Lipase

Produksi GCL-I dengan fermentasi terendam sebelumnya dijelaskan oleh Castro et al. [17]. Setelah 48 jam
fermentasi, kaldu disaring di bawah vakum dan supernatan yang dihasilkan mengandung GCL-I (22,91 U/mL aktivitas),
disebut sebagai ekstrak kasar. Aktivitas hidrolitik ekstrak kasar GCL-I diuji dengan hidrolisis emulsi minyak zaitun yang
sebelumnya juga dijelaskan oleh Castro et al. [17]

2.3 Karakterisasi WCO

WCO disaring untuk menghilangkan kotoran padat yang dihasilkan dari proses penggorengan makanan, dan
parameter berikut dianalisis menggunakan metodologi resmi oleh American Oil Chemist's Society (AOCS): peroksida
[25], saponifikasi [26], yodium [27] dan nilai asam [28], kandungan air [29] dan viskositas. Semua tes dilakukan dalam
rangkap tiga. Untuk analisis viskositas (40◦C), digunakan viskometer Brookfield. Komposisi asam lemak WCO ditentukan
dengan analisis metil ester [30].

2.4 Langkah Hidrolisis : Optimalisasi hidrolisis enzimatik untuk produksi FFA

Reaksi hidrolisis WCO dilakukan dalam reaktor kaca berjaket (kapasitas 200 mL) dengan pengaduk mekanik pada
kecepatan konstan 900 rpm dan 40 ◦C. Sistem yang mengandung 100 g campuran reaksi hanya terdiri dari WCO, air
suling dan ekstrak kasar GCL-I. Jumlah WCO dan GCL-I dalam campuran reaksi ditentukan sesuai dengan central
composite rotatable design (CCRD) untuk dua variabel independen: fraksi massa WCO (15,9 – 44,1%) dan konsentrasi
lipase (1,75 – 4,85 U/g campuran reaksi). Persentase hidrolisis enzimatik yang diperoleh setelah 40 menit reaksi dipilih
sebagai variabel respons. Hasil dianalisis pada tingkat kepercayaan 95% menggunakan software Statistica 5.0. Untuk
memvalidasi optimasi oleh CCRD, pengujian baru dilakukan dalam rangkap tiga pada 40◦C dengan massa fraksi WCO
44,1% dan konsentrasi lipase 4,85 U/g campuran reaksi.

2.5 Pengaruh pemuatan protein awal lipase dari Pseudomonas fluorescens (PFL)

Pengaruh pemuatan protein awal mulai dari 2 sampai 40 mg/g dari dukungan amobil dievaluasi. Dalam rangkaian
percobaan ini, PFL diimobilisasi pada SDB melalui adsorpsi fisik dengan aktivasi antarmuka . Imobilisasi dilakukan dengan
menggunakan 20 mL larutan enzim (5 mM natrium fosfat pada pH 7,0) dan 1 g pendukung pada 25◦C dan 200 rpm
selama 12 jam, yang sesuai dengan waktu yang dibutuhkan untuk mencapai kesetimbangan dalam semua tes yang
dilakukan dalam rangkap tiga. Parameter imobilisasi [31], dan juga aktivitas hidrolitik PFL bebas dan turunannya
ditentukan [18]

2.6 Langkah esterifikasi: Esterifikasi enzimatik untuk produksi biodiesel

FFA yang dihasilkan pada tahap hidroesterifikasi dicuci dua kali dengan air suling dan dipisahkan dari gliserol dengan
dekantasi. Setelah itu dikeringkan menggunakan Na2SO4 untuk menghilangkan sisa air, dan kemudian FFA digunakan
dalam langkah esterifikasi. Etanol digunakan sebagai akseptor asil dan PFL diimobilisasi pada SDB, (persiapan dengan
pemuatan protein awal 30 mg/g pendukung) yang digunakan sebagai biokatalis. Pengaruh konsentrasi molar FFA, rasio
molar FFA dan etanol dan konsentrasi PFL juga diselidiki untuk produksi biodiesel enzimatik.

Dalam rangkaian percobaan ini, semua uji esterifikasi enzimatik dilakukan dalam botol kaca bertutup ulir dengan
kapasitas 50 mL yang berisi 10 mL campuran reaksi. Mereka diinkubasi dalam water bath shaker termostatik pada suhu
40 .◦C dengan pengadukan 200 rpm. Pada interval waktu yang ditentukan, sampel 0,1 mL diambil dari media reaksi dan
dianalisis dengan kromatografi gas.30]. Semua tes dilakukan dalam rangkap tiga.

2.6.1 Pengaruh Konsentrasi molar FFA

Tiga konsentrasi molar yang berbeda dari FFA (100 mM, 500 mM dan 1000 mM) dalam media reaksi yang
mengandung n-heksana dan pengujian dalam media reaksi bebas pelarut dilakukan. Untuk semua pengujian ini, FFA dan
etanol digunakan dalam rasio molar stoikiometri (1:1), dan konsentrasi biokatalis 10% m/v media reaksi digunakan.
Sampel diambil selama 6 jam reaksi, dan persentase konversi ester dianalisis.

2.6.2 Pengaruh rasio molar FFA dan etanol

Pengaruh rasio molar yang berbeda antara FFA dan etanol (1:1, 1:1.5; 1:3) dalam media reaksi yang mengandung n-
heksana dievaluasi dengan mempertahankan konsentrasi biokatalis pada 10% m/v media reaksi. Sampel diambil selama
12 jam reaksi dan persentase konversi ester dianalisis.

2.6.3 Pengaruh konsentrasi biokatalis

Pengaruh konsentrasi biokatalis terhadap reaksi esterifikasi dievaluasi dengan memvariasikannya dari 10 sampai
20% (m/v media reaksi). Reaksi dilakukan dalam rasio molar FFA:etanol 1:1,5 menggunakan n-heksana dalam media
reaksi. Sampel diambil alih dan 48 jam reaksi dan persentase konversi ester dianalisis.

2.7 Penggunaan Kembali Biokatalis

Konsentrasi biokatalis 15% (m/v media reaksi) dipilih dengan pembebanan awal 30 mg PFL ke 1 g SDB selama 6
siklus berturut-turut masing-masing 9 jam dalam reaksi esterifikasi untuk sintesis biodiesel. Kondisi reaksi esterifikasi
adalah: konsentrasi FFA 1000 mM, rasio molar FFA:etanol 1:1,5 dalam media reaksi dengan n-heksana, 200 rpm dan 40
rpm.◦C. Pada akhir setiap siklus, biokatalis ditarik dari campuran reaksi, dicuci dengan heksana dingin (20 mL) untuk
menghilangkan molekul reaktan atau produk yang tertahan di lingkungan mikronya, disaring di bawah vakum dan
kemudian dimasukkan kembali ke dalam campuran reaksi yang baru.

2.8 Metode Analitis

2.8.1 Penentuan Hidrolisis ensimatik WCO

Sampel (1 g campuran reaksi) dikeluarkan dari reaktor dan dipindahkan ke labu yang berisi larutan 10 mL etanol dan
aseton (1:1) dititrasi dengan larutan NaOH 20 mM menggunakan indikator fenolftalein. Semua reaksi dilakukan dalam
rangkap tiga. Persentase dari hidrolisis dihitung seperti yang dijelaskan oleh Rooney dan Weatherley [32 ]. FFA yang
dibebaskan melalui hidrolisis enzimatik dicuci dengan air suling dan dipisahkan dari campuran reaksi dengan dekantasi.
Kemudian, mereka dipisahkan dan dimurnikan dari mono dan di-gliserol seperti yang dijelaskan sebelumnya oleh Castro
et al. [17], menggunakan metodologi yang diadaptasi dari Borgstrom [33], dan Belfrage dan Vaughan [34]. Setelah itu,
FFA diubah menjadi metil ester (derivatisasi) dan dianalisis dengan kromatografi gas.

2.8.2 Analisis Kromatografi Gas (GC)

Metil ester asam lemak/Fatty acid methyl esters (FAME) dan etil ester asam lemak/fatty acid ethyl esters (FAEE)
dianalisis menggunakan sistem kromatografi gas dengan detektor FID (Agilent 7890 GC) dan kolom kapiler Thermo
Scientific-TR-BD (panjang 30 m, diameter dalam 0,25 mm dan ketebalan film 0,25 m), menurut EN 14103 [30]. Suhu
detektor dan injektor keduanya 260◦C; suhu oven diprogram ke 45◦C selama 2 menit; diikuti oleh 7◦C / mnt jalan ke
250◦C dan ditahan selama 7 menit pada suhu 250◦C; nitrogen digunakan sebagai gas pembawa (1,5 mL/menit), dan
volume injeksi 1,0 L digunakan. Standar FAME berasal dari Supelco® (GLC-10; GLC-30; GLC-100).

2.8.3 Analisis Resonansi Magnetik Proton Nuklir (1H NMR)

FAEE dianalisis oleh NMR dalam spektrometer Mercury 300 MHz Varian. FAEE dilarutkan dalam deuterated
chloroform (CDCl3) menggunakan 0,3% tetramethylsilane (TMS) sebagai standar internal. Hasil konversi FFA menjadi
ester ditentukan menurut metode yang diusulkan oleh Paiva et al. [35].

2.8.4 Analisis High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

Analisis gliserida dilakukan dalam kromatografi cair Agilent 1200 Series (Agilent Technologies, USA) yang dilengkapi
dengan Evaporative Light Scattering Detector dan kolom Gemini C-18 (5 m, 150 x 4,6 mm, 110 ) pada 40 ◦C dengan
mengikuti metodologi yang dijelaskan oleh Andrade et al. [36]

2.8.5 Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR)

Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) digunakan untuk menyelidiki senyawa yang terbentuk dari reaksi
esterifikasi. Spektrum IR direkam dalam Perkin Elmer Spectrum GX, spektrometer, menggunakan pelet KBr, dalam
kisaran 4.000–400 cm-1.

3. Hasil dan Diskusi

3.1 Karakterisasi WCO

Sifat fisik dan kimia WCO ditentukan dengan menggunakan metode standar dan nilai yang diperoleh dibandingkan
dengan yang digunakan sebagai standar untuk minyak kedelai yang dipasarkan sebagai minyak nabati (Tabel 1 ).
Degradasi minyak kedelai yang digunakan untuk menggoreng makanan terjadi selama penggunaannya, dan beberapa
polimer, dimer, trigliserida teroksidasi, seperti digliserida dan asam lemak bebas terbentuk.8]. Dengan demikian,
perbedaan yang diamati antara WCO dan minyak kedelai yang dapat dimakan untuk asam, yodium dan nilai saponifikasi
disebabkan oleh proses degradasi ini (lihat Tabel 1).
 Meskipun bahan baku dengan keasaman dan kadar air yang tinggi tidak direkomendasikan untuk produksi biodiesel
melalui transesterifikasi dengan katalis basa, jika rute hidroesterifikasi dipilih, FFA atau kadar air yang tinggi dalam
bahan baku tidak akan menjadi masalah, karena reaksi hidrolisis akan menjadi yang pertama. langkah melalui rute ini
dengan adanya air untuk menghasilkan FFA, sehingga memungkinkan penggunaan WCO atau minyak asam lainnya
sebagai bahan baku [1,8].

3.2 Langkah hidrolisis : Optimalisasi enzimatik untuk produksi FFA

CCRD dengan dua variabel digunakan untuk mengoptimalkan hidrolisis enzimatik WCO pada suhu 40 ◦C dan
900rpm. Variabelnya adalah: fraksi massa WCO (%) dan konsentrasi lipase (GCL-I) (U/g campuran reaksi). Persentase FFA
yang diperoleh (% hidrolisis) setelah 40 menit reaksi ditunjukkan pada Tabel 2.

Persentase hidrolisis tertinggi (98,36%) diperoleh pada pengujian 3, di mana campuran reaksi 20% fraksi massa WCO
dan 4,4 (U/ g campuran reaksi) konsentrasi lipase digunakan. Persentase hidrolisis terendah (12,15%) diperoleh pada
pengujian 7, yang sesuai dengan konsentrasi enzim terendah (1,7 U/campuran reaksi) yang digunakan dalam CCRD.
Hasil hidrolisis enzimatik terbaik kedua (81,47%) dicapai pada uji 8, sedangkan konsentrasi lipase tertinggi digunakan
pada CCRD (4,85 U/campuran reaksi). Hasil saat ini dengan jelas menunjukkan bahwa GCL-I mampu menghidrolisis WCO
dalam jumlah besar (98,36%) dalam waktu reaksi yang singkat (40 menit). Cavalcanti-Oliveira dkk. [6] melaporkan
bahwa lipase dari Thermomyces lanuginosusmembutuhkan waktu 48 jam untuk menghidrolisis 89% minyak kedelai
dalam media reaksi yang kondisinya serupa dengan yang digunakan dalam pekerjaan ini; air suling, enzim bebas (2,3%
v/v media reaksi).

Hal ini dapat dijelaskan dengan spesifisitas substrat GCL-I [38]. GCL-I memiliki selektivitas terhadap asam lemak
rantai panjang tak jenuh dan dengan demikian dapat dengan cepat menghidrolisis ikatan ester yang dibentuk oleh asam
oleat dan linoleat, yang merupakan komponen utama WCO [17,31,39]. Jadi, ketika digunakan dalam hidrolisis WCO, ada
waktu reaksi yang lebih singkat jika dibandingkan dengan lipase lain, yang tidak menunjukkan spesifisitas tersebut [6,
11,22].
 Hasil ini juga digunakan untuk memperkirakan koefisien regresi dan interaksinya dengan hidrolisis enzimatik WCO
pada tingkat kepercayaan 95%, sehingga diperoleh parameter signifikan berikut: koefisien kuadrat (x 21) untuk fraksi
massa WCO, koefisien linier (x2) untuk konsentrasi lipase dan koefisien interaksi (x 1⋅.x2) antara fraksi massa WCO dan
konsentrasi lipase. Koefisien yang tidak signifikan secara statistik dikeluarkan dari model dan dikirim ke residual,
sehingga dihitung ulang sekali lagi dan nilai baru diberikan untuk konstruksi model regresi polinomial orde kedua
(Persamaan (1)).

Hydrolysis (%) = 44.26 + 14.41x12 + 19.76x2 − 13.13x1x2 (1)

Analisis varians (ANOVA) (Tabel 3) menunjukkan bahwa dihitung F-Value (16,24) lebih tinggi dari table F-Value (4,35)
dan juga koefisien determinasi yang baik (R2) dari 0,87 diperoleh. Kesalahan murni rendah (3,45), sehingga
menunjukkan reproduktifitas yang baik dari data eksperimen.

Analisis permukaan respons (Gambar 1a) menunjukkan bahwa hidrolisis penuh WCO diharapkan ketika ada
konsentrasi enzim yang tinggi (di atas 4,4 U/g reaksi campuran) dan fraksi massa WCO rendah (16 dan 20%), yang sesuai
dengan hasil yang diperoleh.

Selain itu, persentase hidrolisis 74,47% dicapai hanya dalam 40 menit untuk campuran reaksi yang mengandung
44,1% fraksi massa WCO. Jadi, untuk memvalidasi optimasi dengan CCRD, pengujian baru dilakukan dalam rangkap tiga
menggunakan fraksi massa tertinggi WCO (44,1%) dan konsentrasi GCL-I (4,4 U/g campuran reaksi) pada 40◦C.

Gambar 1b menunjukkan perjalanan waktu hidrolisis enzimatik WCO yang dikatalisis oleh GCL-I. Hidrolisis penuh
WCO dicapai dalam 80 menit reaksi, yang masih lebih pendek dari waktu yang dibutuhkan oleh lipase lain dalam reaksi
hidrolisis serupa, seperti yang dibahas sebelumnya. Talukder dkk. [22] melaporkan hidrolisis WCO 100% menggunakan
lipase dariCandida rugosasetelah 10 jam reaksi untuk media reaksi yang terdiri dari WCO dan air suling dengan
perbandingan masing-masing 1:1 (v/v).

FFA yang dihasilkan dari tahap hidrolisis diekstraksi dan diderivatisasi sehingga dapat dianalisis dengan kromatografi
gas. Komposisi FAME yang diperoleh dianggap 100% (nilai FAME kurang dari 1% tidak dipertimbangkan) (Gambar 2.). Itu
juga dibandingkan dengan komposisi awal FAME WCO.

Mengenai FAME yang dihasilkan dari hidrolisis enzimatik WCO identik dengan komposisi awal WCO, sehingga
menunjukkan bahwa hidrolisis sepenuhnya tercapai setelah 80 menit reaksi dan juga menunjukkan bahwa langkah
hidrolisis dari rute hidroesterifikasi sepenuhnya dioptimalkan oleh CCRD

3.3 Pengaruh pemuatan protein awal lipase dari Pseudomonas fluorescens (PFL)

Untuk reaksi esterifikasi, dengan adanya pelarut organik, penggunaan enzim amobil menghindari agregasi dan
akibatnya kehilangan aktivitasnya. [18].

Pengaruh pemuatan protein awal pada sifat katalitik biokatalis yang bervariasi dari 2 hingga 40 mg/g pendukung
dievaluasi untuk memilih biokatalis terbaik untuk langkah esterifikasi (data tidak ditampilkan). PFL diimobilisasi pada
SDB melalui adsorpsi fisik pada 25◦C, pH 7,0 dan kekuatan ion rendah (5 mM) selama 12 jam. Imobilisasi 2,00 hingga
11,97 mg / g dukungan dan aktivitas hidrolitik 71,82±2.42 sampai 398.81±2,57 U/g diamati untuk turunan yang
disiapkan. Kejenuhan dukungan tercapai pada 30 mg pemuatan protein awal, menghasilkan hasil imobilisasi
39,90±0,70% dan protein amobil 11,97±0,11 mg/g dukungan. Oleh karena itu, biokatalis ini dipilih untuk tahap
esterifikasi selanjutnya.
 3.4 Langkah esterifikasi: Esterifikasi enzimatik untuk produksi biodiesel

FFA yang dihasilkan pada langkah hidroesterifikasi dicuci dengan air suling dan dipisahkan dari gliserol dengan
dekantasi. Kemudian, mereka digunakan dalam langkah esterifikasi dengan menggunakan etanol sebagai akseptor asil
dan biokatalis heterogen yang disiapkan – PFL diamobilisasi pada partikel SDB. Dalam rangkaian percobaan ini, efek
konsentrasi molar FFA, rasio molar FFA dan etanol dan konsentrasi PFL diselidiki untuk produksi biodiesel enzimatik (etil
ester).

3.4.1 Pengaruh konsentrasi molar FFA

Tiga konsentrasi molar yang berbeda dari FFA (100 mM, 500 mM dan 1000 mM) dalam media reaksi yang
mengandung n-heksana dan juga pengujian dengan media reaksi bebas pelarut dilakukan menggunakan FFA dan etanol
dalam rasio molar stoikiometri (1:1) pada 40 ◦C dan 200 rpm ( Gambar 3a).

Untuk kedua konsentrasi molar FFA 100 mM dan 500 mM, konversi lebih dari 80% dicapai hanya dalam satu jam
reaksi. Pengujian ini terkait dengan konsentrasi molar FFA yang lebih rendah, sehingga konversi yang tinggi diharapkan
dalam waktu reaksi yang lebih singkat, karena ada difusi molekul reagen yang lebih baik ke dalam lingkungan mikro
internal biokatalis karena penurunan viskositas dalam media reaksi oleh konsentrasi FFA yang lebih rendah dan
penggunaan pelarut organik [40]. Ketika konsentrasi molar FFA meningkat menjadi 1000 mM, persentase konversi
biodiesel menurun selama jam pertama reaksi, mungkin karena peningkatan viskositas dalam media reaksi, seperti yang
diharapkan. Oleh karena itu, karena media menjadi kurang kental karena pembentukan etil ester, terjadi peningkatan
persentase konversi, mencapai konversi 80% setelah 3 jam reaksi.
 Adapun pengujian dengan media reaksi bebas pelarut, biokatalis belum mencapai efisiensi yang sama seperti pada
pengujian sebelumnya, bahkan setelah waktu reaksi yang lama (29% setelah 6 jam), sehingga menunjukkan bahwa
menggunakan pelarut (n-heksana) adalah penting karena menurunkan viskositas media reaksi dan memungkinkan difusi
molekul reaksi yang lebih baik, akibatnya persentase etil ester yang tinggi dicapai dalam waktu singkat. Menurut
Mendes dkk. [18] kehadiran pelarut non-polar dalam media reaksi seperti n-heksana tidak mempengaruhi aktivitas dan
stabilitas PFL, karena tetap menjadi lapisan hidrasi esensial yang terikat pada struktur PFL. Gambar 3b menunjukkan
komposisi ekivalen asam lemak etil ester (FAEE) yang diperoleh dari tiga uji esterifikasi (100 mM, 500 mM dan 1000
mM) di mana ditemukan hampir 80% persentase konversi. Untuk pengujian ini, komposisi FAEE serupa dan, dengan
demikian pengujian yang mencapai konsentrasi molar FFA tertinggi (1000 mM dan reaksi 3 jam) dipilih untuk studi lebih
lanjut.

3.4.2 Pengaruh rasio molar FFA dan etanol

Esterifikasi adalah proses reversibel dan dengan demikian etanol yang berlebihan menggeser kesetimbangan reaksi
ke arah pembentukan ester.{9]. Namun, konsentrasi awal alkohol yang tinggi harus dihindari karena dapat
menyebabkan inaktivasi lipase. Oleh karena itu, pengaruh rasio molar yang berbeda antara FFA dan etanol (1:1, 1:1.5;
1:3) dievaluasi, mempertahankan konsentrasi biokatalis pada 10% m/v media reaksi.

Persentase konversi etil ester tertinggi (90,7±1,2%) diperoleh dari uji esterifikasi yang dilakukan dalam rasio molar
1:1,5 (FFA:etanol) setelah 12 jam reaksi (Gambar 4a). Untuk pengujian yang dilakukan dalam rasio molar stoikiometri
(1:1), sebuah 78,0 ± Konversi 2,0% diperoleh, sedangkan itu 88,1±2,2% dalam rasio molar 1:3 setelah 12 jam. Perbedaan
ini dapat dijelaskan dengan jumlah alkohol yang tersedia dalam media reaksi untuk setiap pengujian. Jumlah alkohol
yang lebih besar dari yang dibutuhkan untuk rasio molar stoikiometri sebenarnya meningkatkan konversi etil ester dan
dengan demikian rasio molar 1:1.5 FFA:etanol dipilih untuk penelitian lebih lanjut.

Gambar 4b menunjukkan laju awal yang ditentukan dari kemiringan konsumsi FFA versus waktu reaksi. Pengujian
yang dilakukan dalam rasio molar 1:1,5 (FFA:etanol) menunjukkan laju awal tertinggi 4,97 mM/menit, sehingga
menguatkan hasil yang disebutkan di atas.

3.4.3 Pengaruh Konsentrasi Biokatalis

Untuk mengidentifikasi konsentrasi biokatalis minimum yang diperlukan untuk memaksimalkan sintesis biodiesel,
pengaruh konsentrasi biokatalis terhadap reaksi esterifikasi dievaluasi, yang berkisar antara 10 sampai 20% (m / v media
reaksi). Peningkatan konsentrasi biokatalis dari 10 menjadi 20% memungkinkan konversi biodiesel yang sedikit lebih
tinggi dari 89,1±1,2 hingga 94.3±1,1% setelah 9 jam reaksi.

Hasil (Gambar 5a) menyarankan bahwa reaksi esterifikasi menggunakan 15 dan 20% konsentrasi biokatalis
mencapai kesetimbangan kimia setelah 9 jam. BerdasarkanGambar 5b, nilai laju awal untuk kedua kondisi percobaan
sangat mirip (masing-masing 13,63 dan 14,20 mM/mnt) dan tidak ada konversi biodiesel yang secara signifikan lebih
tinggi yang diamati, sehingga konsentrasi 15% (m/v media reaksi) dipilih untuk uji kegunaan ulang.
 3.5 Penggunaan Kembali biokatalis

Pengaruh penggunaan kembali biokatalis secara langsung mempengaruhi kelangsungan hidup proses enzimatik
setelah mengurangi biaya biokatalis per kilogram produk, sehingga menjadi faktor yang sangat penting untuk
dipertimbangkan untuk produk yang memiliki nilai biaya pasar rendah dan rata-rata, seperti biodiesel [41].

Dalam penelitian ini, PFL yang diimobilisasi pada SDB (pemuatan protein awal dari dukungan 30 mg/g) pada
konsentrasi 15% (m/v media reaksi) digunakan selama 6 siklus berturut-turut masing-masing selama 9 jam untuk
sintesis biodiesel. Kondisi reaksi esterifikasi adalah: konsentrasi FFA 1000 mM, rasio molar FFA:ethanol 1:1,5 dalam
media reaksi dengan n-heksana, pada 200 rpm dan 40◦C.

Biokatalis mencapai sekitar 98% dari aktivitas awal setelah 6 siklus berturut-turut (Gambar 6) masing-masing 9 jam,
menunjukkan interaksi dukungan enzim yang kuat (PFL-SDB) dan juga penghilangan reaktan residu atau molekul produk
yang efisien selama langkah pencucian dan pengeringan, yang dapat mempercepat kemungkinan desorpsi molekul PFL
dari permukaan pendukung. Oleh karena itu, hasil yang diperoleh dalam pekerjaan ini menunjukkan bahwa PFL pada
imobilisasi SDB adalah strategi yang baik untuk menyiapkan biokatalis yang kuat.

3.6 Karakterisasi biodiesel yang diperoleh

Karakterisasi biodiesel yang diperoleh pada siklus pertama uji stabilitas operasional dilakukan dengan spektrum
proton NMR, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 7. Daerah antara 4,10 dan 4,20 ppm dari Spektrum 1H NMR
menunjukkan kuartet yang dikaitkan dengan hidrogen yang terkait dengan gugus -metilen dari etil ester rantai panjang,
yang merupakan karakteristik dari biodiesel [42].
 Tidak ada sinyal karakteristik untuk -metilen hidrogen mengenai MAG (3,80-3,85 ppm), DAG (3,70-3,75 ppm) dan
TAG (4,1-4,4 ppm) yang diamati [42], sehingga menunjukkan tidak ada mono-, di- atau triasilgliserol yang dicampur
dengan FAEE. Hasil ini sudah diharapkan karena WCO terhidrolisis sepenuhnya dan bahkan ada beberapa residu akhir
reaksi hidrolisis. Teknik ini berkorelasi baik dengan analisis HPLC dari sampel yang sama. Kuantifikasi gliserida sisa
dengan HPLC menegaskan bahwa sampel biodiesel tidak memiliki jejak konsentrasi MAG, DAG atau TAG.

Fourier Transform Infrared spectroscopy (FTIR) juga digunakan dalam pekerjaan ini untuk mengevaluasi kualitas
FAEE dengan mengidentifikasi gugus fungsi dan pita yang sesuai dengan regangan dan getaran dalam sampel biodiesel
dan bahan baku. Tidak ada upaya yang dilakukan untuk mengukur hasil esterifikasi menggunakan metodologi ini.
Sebaliknya, kualitas etil ester dinilai dengan FTIR dan dikorelasikan dengan data analitik lainnya untuk memeriksa silang
hasilnya.Gambar 8menunjukkan pita serapan di daerah 1750 cm-1, sesuai dengan deformasi aksial karbonil (–C = O),
1170 cm-1 terkait dengan deformasi aksial ester (C–O–C) dan 722 cm-1dikaitkan dengan grup –(CH 2)n [43]

4. Kesimpulan

Biodiesel yang dihasilkan dengan hidroesterifikasi menggunakan WCO dan katalisis enzimatik untuk reaksi
sekuensial hidrolisis dan esterifikasi menunjukkan viskositas dan kemurnian yang baik.

Penggunaan GCL-I dalam hidrolisis WCO dan optimalisasinya menggunakan CCRD memungkinkan konversi WCO
penuh dalam waktu singkat, yaitu hanya 80 menit, dilakukan dalam sistem bebas pengemulsi tanpa buffer, hanya terdiri
dari limbah minyak, air dan enzim, sehingga menghilangkan kebutuhan langkah pemurnian FFA dan mengurangi biaya
proses. Waktu reaksi ini dianggap lebih pendek daripada yang lain yang dilaporkan dalam literatur untuk hidrolisis
enzimatik yang dilakukan dalam kondisi serupa, tetapi menggunakan lipase lain.6, 11,22]. Selain itu, WCO yang
digunakan sebagai bahan baku tidak memerlukan perlakuan pendahuluan khusus; hanya penyaringan sederhana yang
dilakukan untuk menghilangkan kotoran padat dari proses penggorengan.

Pada langkah esterifikasi, imobilisasi PFL pada SDB memberikan stabilitas dan aktivitas yang baik untuk lipase, yang
memungkinkannya digunakan kembali dalam 6 siklus berturut-turut masing-masing 9 jam, tanpa kehilangan konversi
FFA menjadi biodiesel yang signifikan. Selanjutnya, biokatalis yang disiapkan tetap aktif untuk konsentrasi molar yang
berbeda dari FFA dan juga untuk proporsi etanol yang berbeda yang dievaluasi.

Selain itu, keasaman dan kadar air yang tinggi dalam WCO tidak mempengaruhi kualitas biodiesel yang dihasilkan,
sehingga menunjukkan bahwa hidroesterifikasi adalah rute yang sangat menjanjikan di mana limbah atau minyak
mentah dapat digunakan sebagai bahan baku tanpa memerlukan langkah pemurnian tambahan.

Referensi

[1] H. Pourzolfaghar, F. Abnisa, WMAW Daud, MK Aroua, Tinjauan proses hidroesterifikasi enzimatik untuk produksi
biodiesel, Renew. Mempertahankan. Energi Rev. 61 (2016) 245–257,https://doi.org/10.1016/j.rser.2016.03.048.
 [2] VS Ferreira-Leitão, MC Cammarota, ECG Aguieiras, LRV de Sá, R. FernandezLafuente, DMG Freire, Protagonisme
Biokatalisis dalam Kimia Hijau dan Manfaat Lingkungannya, Katalis 7 (2017) 1-34, https://doi.org/10.3390/
catal7010009.

[3] Neraca Energi Brasil, Ministério de Minas e Energia, 2018 (diakses 22 September 2019),
http://epe.gov.br/en/publications/publications/brazilian-energ y-balance/ brazilian-energy-balance-2018.

[4] PT Vasudevan, M. Briggs, Produksi biodiesel—kecanggihan dan tantangan saat ini, J. Ind. Microbiol. Bioteknologi.
35 (2008) 421–430,https://doi.org/ 10.1007/ s10295-008-0312-2.

[5] MK Lam, KT Lee, AR Mohamed, Katalisis homogen, heterogen dan enzimatik untuk transesterifikasi minyak asam
lemak bebas tinggi (minyak jelantah) menjadi biodiesel: Review, Biotechnol. Adv. 28 (2010) 500–518,https://doi.org/
10.1016/ j.biotechadv.2010.03.002.

[6] EA Cavalcanti-Oliveira, PR Silva, AP Ramos, DAG Aranda, DMG Freire, Studi hidrolisis minyak kedelai yang
dikatalisis olehThermomyces lanuginosuslipase dan aplikasinya untuk produksi biodiesel melalui hidroesterifikasi,
Enzym. Res. 2011 (2011) 1–8,https://doi.org/10.4061/2011/618692.

[7] LP Christopher, H. Kumar, VP Zambare, biodiesel enzimatik: Tantangan dan peluang, Appl. Energi 119 (2014)
497–520,https://doi.org/10.1016/j. energi.2014.01.017.

[8] CDM Araújo, CC Andrade, ES Silva, FA Dupas, Produksi biodiesel dari minyak goreng bekas: Review, Renew.
Mempertahankan. Energi Rev. 27 (2013) 445–452, https://doi.org/10.1016/j.rser.2013.06.014.

[9] EKG Aguieiras, ED Cavalcanti-Oliveira, AM Castro, MAP Langone, DM G. Freire, produksi Biodiesel dariAcrocomia
aculeataminyak asam dengan proses hidroesterifikasi (enzim/enzim): Penggunaan lipase nabati dan padatan
terfermentasi sebagai biokatalis berbiaya rendah, Fuel 135 (2014) 315–321,https://doi.org/10.1016/j. bahan
bakar.2014.06.069.

[10] MCP Zenevicz, A. Jacques, D. Oliveira, A. Furigo Jr., A. Valério, VJ Oliveira, Strategi enzimatik dua langkah untuk
menghasilkan etil ester menggunakan minyak goreng sebagai substrat, Ind. Crops. Melecut. 108 (2017)
52–55,https://doi.org/10.1016/j. indcrop.2017.06.018.

[11] V. Vescovi, MJ Rojas, A. Baraldo Jr., DC Botta, FAM Santana, JP Costa, M. S. Machado, VK Honda, RLC Giordano,
PW Tardioli, Lipase-mengkatalisis produksi biodiesel dengan hidrolisis minyak jelantah diikuti dengan esterifikasi asam
lemak bebas, J. Am. Kimia Minyak. Perkumpulan 93 (2016) 1615–1624, https://doi.org/ 10.1007/s11746-016-2901-y.

[12] S. Hama, H. Noda, A. Kondo, Bagaimana teknologi lipase berkontribusi pada evolusi produksi biodiesel
menggunakan beberapa bahan baku, Curr. pendapat Bioteknologi. 50 (2018)
57–64,https://doi.org/10.1016/j.copbio.2017.11.001.

[13] JS Sousa, ED Cavalcanti-Oliveira, DAG Aranda, DMG Freire, Aplikasi lipase dari kacang fisik (jarak pagar L.) ke
proses hidroesterifikasi hibrida (enzim/kimia) baru untuk produksi biodiesel, J. Mol. Katalis. B. Enzim. 65 (2010) 133–
137,https:// doi.org/10.1016/j.molcatb.2010.01.003.

[14] S. Hama, A. Kondo, Produksi biodiesel enzimatik: Tinjauan tentang bahan baku potensial dan pengembangan
proses, Bioresour. teknologi. 135 (2013) 386–395, https://doi.org/10.1016/j.biortech.2012.08.014.

[15] R. Sankaran, PL Show, JS Chang, Produksi biodiesel menggunakan lipase amobil: kelayakan dan tantangan,
Biofuels Bioprod. Bioref. 10 (2016) 896–916,https:// doi.org/10.1002/bbb.

[16] CH Tan, PL Show, CW Ooi, EP Ng, JCW Lan, TC Ling, Novel metode pemurnian lipase – review perkembangan
terbaru, Biotechnol. J.10 (2015) 1–14,https:// doi.org/10.1002/biot.201400301.

[17] PF Castro, NC Moreira, MN Esperana, LM Oliveira, AC Badino, OL Tavano, AA Mendes, RC Basso, R. Fernández-
Lafuente, DB Hirata, Produksi lipase tinggi dari Geotrichum candidumdalam waktu singkat menggunakan minyak biji
kapas: optimasi, pemurnian mudah dan karakterisasi spesifisitas, J. Chem. Ind. Res. Pembaruan 3 (2016)
60–69,https://doi.org/10.15377/2409-983X.2016.03.02.1.

[18] AA Mendes, PC Oliveira, AM Velez, RC Giordano, RLC Giordano, H. F. Castro, Evaluasi lipase amobil pada manik-
manik poli-hidroksibutirat untuk mengkatalisis sintesis biodiesel, Int. J.Biol. Makromol. 50 (2012) 503–511,https://
doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2012.01.020.
 [19] NB Carvalho, BT Vidal, AS Barbosa, MM Pereira, S. Matted, LDS Freitas, A. S. Lima, CMF Soares, Imobilisasi lipase
pada silika xerogel yang diolah dengan cairan ionik protik dan aplikasinya dalam produksi biodiesel dari minyak yang
berbeda, Int. J. Mol. Sci. 19 (2018) 1829–1849,https://doi.org/10.3390/ijms19071829.

[20] Y. Watanabe, T. Nagao, Y. Nishida, Y. Takagi, Y. Shimada, Produksi enzimatik metil ester asam lemak dengan
hidrolisis minyak asam diikuti dengan esterifikasi, J. Am. Minyak. Kimia Perkumpulan 84 (2007)
1015–1021,https://doi.org/10.1007/s11746-007-1143- 4.

[21] WJ Ting, CM Huang, GR Nair, WT Wu, Sebuah proses hibrida enzimatik/asam-katalis untuk produksi biodiesel
dari minyak kedelai, J. Chin. Inst. Kimia Ind. 39 (2008) 203–210,https://doi.org/10.1016/j.jcice.2008.01.004.

[22] Md.MR Talukder, JC Wu, LPL Chua, Konversi minyak jelantah menjadi biodiesel melalui hidrolisis enzimatik
diikuti dengan esterifikasi kimia, Energy Fuel 24 (2010) 2016–2019,https://doi.org/10.1021/ef9011824.

[23] Md.MR Talukder, JC Wu, Ng.M. Fen, YLS Melissa, Katalisis lipase dua langkah untuk produksi biodiesel,
Biochem. Ind. J.49 (2010) 207–212,https://doi.org/ 10.1016/ j.bej.2009.12.015.

[24] D. Soares, AF Pinto, AG Gonçalves, DA Mitchella, N. Krieger, Produksi biodiesel dari minyak asam stok sabun
kedelai dengan hidrolisis dalam air subkritis diikuti oleh esterifikasi yang dikatalisis lipase menggunakan padatan yang
difermentasi dalam reaktor unggun, Biochem . Ind. J.81 (2013) 15–23,https://doi.org/10.1016/j. bej.2013.09.017.

[25]AOCS, Metode resmi Cd 8-53: Nilai peroksida, dalam: D. Firestone (Ed.), Metode resmi dan praktik yang
direkomendasikan AOCS, AOCS Press, Champaign, 1990.

[26]AOCS, Metode Resmi Cd 3-25: Nilai penyabunan, dalam: D. Firestone (Ed.), Metode resmi dan praktik yang
direkomendasikan AOCS, AOCS Press, Champaign, 1990.

[27]AOCS, Metode Resmi 1c-85: Nilai yodium yang dihitung, dalam: D. Firestone (Ed.), Metode resmi dan praktik
yang direkomendasikan dari AOCS, AOCS Press, Champaign, 1990.

[28]AOCS, Metode Resmi Ca 5a-40: Asam lemak bebas, dalam: D. Firestone (Ed.), Metode resmi dan praktik yang
direkomendasikan dari AOCS, AOCS Press, Champaign, 1990.

[29]AOCS, Metode Resmi Ca 2c-25: Metode oven udara dengan bahan yang lembab dan mudah menguap, dalam: D.
Firestone (Ed.), Metode resmi dan praktik yang direkomendasikan AOCS, AOCS Press, Urbana, 2009.

[30]EN 14103, Turunan lemak dan minyak – metil ester asam lemak (FAME) – penentuan kandungan metil ester
ester dan asam linolenat, Komite Eropa untuk Standardisasi, 2020.

[31] MM Ferreira, FLB Santiago, NAG Silva, JHH Luiz, R. Fernandéz-Lafuente, A. A. Mendes, DB Hirata, Berbagai
strategi untuk melumpuhkan lipase dari Geotrichum candidum: Studi kinetik dan termodinamika, Proses Biokimia. 67
(2018) 55–63, https://doi.org/10.1016/j.procbio.2018.01.028.

[32] D. Rooney, LR Weatherley, Pengaruh kondisi reaksi pada hidrolisis katalis lipase dari minyak bunga matahari
oleat tinggi dalam reaktor cair-cair berpengaduk, Proses Biochem. 36 (2001) 947–953,https://doi.org/10.1016/S0032-
9592(01)00130-3.

[33] B. Borgstrom, Investigasi metode pemisahan lipid: pemisahan ester kolesterol, gliserida dan asam lemak bebas,
Acta Physiol. Pindai. 25 (1952) 111–119, https:// doi.org/10.1111/j.1748-1716.1952.tb00863.x.

[34] P. Belfrage, M. Vaughan, Sistem partisi cair-cair sederhana untuk isolasi asam oleat berlabel dari campuran
dengan gliserida, J. Lipid Res. 10 (1969) 341–344.

[35] EJM Paiva, MLCP Silva, JCS Barboza, PC Oliveira, HF De Castro, D. S. Giordani, minyak babassu yang tidak dapat
dimakan sebagai sumber baru untuk produksi energi —survei transesterifikasi kelayakan yang dibantu oleh ultrasound,
Ultrason Sonochem. 20 (2013) 833–838,https://doi.org/10.1016/j.ultsonch.2012.11.003.

[36] GSS Andrade, AKF Carvalho, CM Romero, PC Oliveira, HF De Castro, Mucor circinelloides whole-cells sebagai
biokatalis untuk produksi etil ester berbahan dasar minyak babassu, Bioprocess Biosyst. Ind. 37 (2014) 2539–
2548,https:// doi.org/ 10.1007/s00449-014-1231-4.

[37] Standar Codex untuk Minyak Nabati Bernama, 2019 [diakses 22 September 2019],
http://www.fao.org/3/y2774e/y2774e04.htm#TopOfPage.
 [38] K. Stránsk, M. Zarevúcka, Z. Kejík, Z. Wimmer, M. Macková, K. Demnerová, Spesifisitas substrat,
regioselektivitas dan aktivitas hidrolitik lipase yang diaktifkan dari Geotrikum sp, Biokimia. Ind. J.34 (2007) 209–
216,https://doi.org/ 10.1016/j.bej.2006.12.006.

[39] MM Ferreira, GF Oliveira, RC Basso, AA Mendes, DB Hirata, Optimalisasi produksi asam lemak bebas dengan
hidrolisis enzimatik minyak nabati menggunakan lipase non-komersial dariGeotrichum candidum, Bioproses Biosis. Ind.
42 (2019) 1647– 1659,https://doi.org/10.1007/s00449-019-02161-2.

[40] N. Chaibakhsh, MBA Rahman, S. Abd-Aziz, M. Basri, AB Salleh, RNZR A. Rahman, Sintesis ester adipat yang
dikatalisis lipase dioptimalkan dalam sistem bebas pelarut, J. Ind. Microbiol. Bioteknologi. 36 (2009) 1149–
1155,https://doi.org/ 10.1007/ s10295-009-0596-x.

[41] G. Hills, Industri penggunaan lipase untuk menghasilkan ester asam lemak, Eur. J. Lipid. Sci. teknologi. 105
(2003) 601–607,https://doi.org/10.1002/ejlt.200300853.

[42] IG Rosset, MCH Tavares, EM Assaf, ALM Porto, Katalitik etanollisis minyak kedelai dengan lipase amobil dari
Candida antartika dan 1H NMR dan GC kuantifikasi etil ester (biodiesel) yang dihasilkan, Appl. Katalis. A-Gen. 392 (2011)
136-142,https:// doi.org/10.1016/j.apcata.2010.10.035.

[43] WB Zhang, Review analisis biodiesel dengan spektroskopi inframerah, Renew. Mempertahankan. Energi Rev. 16
(2012) 6048–6058,https://doi.org/10.1016/j. rser.2012.07.003