Isolasi Strain Bakteri Penghasil Poligalakturonase

dari Buah Tomat ( Lycopersicon esculentum Mill.)

KELOMPOK 5 :
AMALIA NUR AINI.B 22330704
FITRIYATI 22330720
HECA ZULEKA 22330710
KUMALA SRININGSIH 22330707
 TOMAT
(LYCOPERSICON ESCULENTUM MILL.)
Tomat merupakan sumber
nutrisi penting dan memiliki
kandungan zat yang
diperlukan oleh manusia
dalam proses pertumbuhan
dan perkembangan . Buah
tomat sangat rentan
terhadap serangan mikroba
karena variasi besar dalam
komponen kimianya seperti
pH dan Kadar air yang
membuatnya lebih rentan
terhadap perkembangbiakan
mikroba dalam waktu singkat.
 Enzim Poligalakturonase (PG)

Enzim poligalakturonase berperan sangat penting

dalam pembukaan dinding sel tanaman, sehingga
menyebabkan infeksi pada tanaman inang .Enzim
seperti poligalakturonase memainkan peran penting
dalam kerusakan buah-buahan. Faktor lingkungan
utama yang mempengaruhi aktivitas
poligalakturonase adalah pH dan suhu.

Buah tomat sangat rentan terhadap serangan mikroba

karena variasi besar dalam komponen kimianya seperti
pH dan kadar air yang membuatnya lebih rentan
terhadap perkembangbiakan mikroba dalam waktu
singkat.
 1. koleksi sampel
2. isolasi stain bakteri
3. idetifikasi stain bakteri
4. pemilihan bakteri poligalakturonase
5. persiapan inokulum standar untuk
produksi enzim
METODE 6.
7.
ekstrasi enzim poligalakturonase
uji poligalakturonase
PENELITIAN 8. pengendapan amonium sulfat
9. pengaruh suhu pada
10. pengaruh pH
11. Pengaruh konsentrasi
12. pengaruh waktu pemanasan
13. Ekstraksi dan katarterisasi
14. penentuan berat molekul pg PEC 15
 Pengambilan
Sampel
200 buah tomat → pasar Iju, di
Area Pemerintah Daerah Ado-Odo
di Negara Bagian Ogun, Nigeria
→ Laboratorium Mikrobiologi di
Universitas Covenant →100 buah
(AT) disimpan pada suhu kamar
→100 buah (CT) disimpan pada
lemari es sebagai kontrol.
Pencacahan Populasi Bakteri

Jumlah bakteri total untuk buah tomat

yang disimpan di lemari es memiliki
kisaran jumlah bakteri 1,0 × 10 4  – 3,0 ×
10 6  cfu/g dan 2,0 × 10 4  – 2,0 × 10
14  cfu/g dari buah-buahan yang
disimpan pada suhu kamar
Identifikasi Isolat/stain Bakteri
 Koloni bakteri terpilih diidentifikasi
menggunakan teknik morfologi dan biokimia dasar
mikrobiologi dengan bantuan skema taksonomi
Bergey's Manual of Determinative Bacteriology.

Isolat bakteri murni yang teridentifikasi adalah

Aeromonas sp., Bacillus sp., Citrobacter sp.,
Klebsiella sp., Enterobacter sp., Staphylococcus sp.,
Lactobacillus sp., dan Micrococcus sp.
Penyaringan Isolat
Bakteri Pectinolytic
Isolat bakteri yang diperoleh dari tomat yang
disimpan pada suhu kamar dan di lemari es
disaring untuk produksi poligalakturonase.

Isolat kode B5 dipilih untuk penelitian lebih

lanjut berdasarkan kemampuan untuk
menghasilkan zona hidrolisis yang lebih besar
berukuran 60 mm
 Poligalakturonase yang dihasilkan isolat bakteri kode B5 yang
diisolasi dari buah-buahan yang disimpan pada suhu kamar pada
hari ke-5 memiliki aktivitas total 0,911 unit/ml, kandungan protein
0,600 mg/ml, aktivitas spesifik 1,518 unit/mg protein, dan rendemen
72%. setelah pengendapan amonium sulfat.
 Pengaruh Suhu pada
Polygalakturonase PEC B5 Substratnya adalah pektin 0,1% (b/v)
dalam buffer fosfat sitrat 0,1 M (pH 4,5).
Media yang mengandung 1 ml substrat
dan 0,5 ml poligalakturonase diinkubasi
pada suhu yang berbeda dari 20°C-45°
C. Setelah 3 jam inkubasi pada setiap
suhu, aktivitas poligalakturonase
ditentukan.

Suhu inkubasi mempengaruhi aktivitas

poligalakturonase sangat meningkatkan
aktivitas PEC B5 dengan peningkatan
suhu inkubasi. Peningkatan lebih lanjut
di luar suhu optimal mengurangi
aktivitas enzim. Suhu optimum untuk
PEC B5 adalah 35°C.
 Pengaruh pH pada
Polygalacturonase PEC B5

Substratnya adalah pektin 0,1% (b/v) dalam buffer

fosfat sitrat 0,1 M dengan nilai pH yang bervariasi
mulai dari pH 2,0–4,5. Medium yang mengandung 1
ml pektin dan 0,5 ml poligalakturonase diinkubasi
pada suhu 35°C selama 3 jam, dan aktivitasnya
ditentukan

Aktivitas enzim meningkat dengan meningkatnya pH

dan juga menurun ketika nilai pH optimum tercapai.
PH optimum untuk aktivitas poligalakturonase untuk
PEC B5 adalah 4,5
Pengaruh Konsentrasi substrat
pada Polygalacturonase PEC B5
Pengaruh berbagai konsentrasi
substrat ditentukan dengan menggunakan
konsentrasi pektin yang berbeda dalam
buffer fosfat sitrat 0,1 M; 0,05%-0,25%.
Campuran reaksi mengandung 1 ml pektin,
dan 0,5 ml poligalakturonase diinkubasi pada
35°C selama 3 jam. Aktivitas
poligalakturonase ditentukan

Aktivitas poligalakturonase yang

dihasilkan meningkat dengan meningkatnya
konsentrasi substrat. Ini terus meningkat
sampai konsentrasi substrat optimum
tercapai. Konsentrasi substrat optimum
substrat PEC B5 adalah 0,3 mg/ml.
Pengaruh Waktu Pemanasan (80 °C)
Terhadap Stabilitas
Poligalakturonase PEC B5
Pengaruh waktu pemanasan terhadap
stabilitas enzim poligalakturonase
ditentukan. Sampel enzim yang dimurnikan
sebagian dipanaskan pada 80 ° C untuk
periode waktu yang berbeda (0-30 menit),
masing-masing. Medium yang mengandung 1
ml pektin dan 0,5 ml poligalakturonase
diinkubasi pada suhu 35°C selama 3 jam, dan
aktivitas poligalakturonase ditentukan

Aktivitas poligalakturonase pada pemanasan

80°C menurun dengan semakin lama waktu
aplikasi panas. Saat poligalakturonase diberi
perlakuan panas selama 5 menit, aktivitas
poligalakturonase optimal. Aktivitas
poligalakturonase benar-benar tidak aktif
setelah 10 menit pemanasan
 Ekstraksi dan Karakterisasi
Deoxyribonucleic Acid (DNA)
Ekstraksi DNA diamplifikasi menggunakan
pasangan primer
27F-5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′ dan
1492R-5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′ dengan
teknik polymerase chain reaction.

Karakterisasi molekuler strain bakteri penghasil

poligalakturonase dilakukan dengan teknik
sekuensing gen 16S rRNA.

Semua produk PCR dimurnikan dan dikirim ke

Inqaba (Afrika Selatan) untuk sekuensing Sanger,
dan sekuens yang sesuai diidentifikasi menggunakan
ledakan Pusat Informasi Bioteknologi Nasional
(NCBI).

Isolat bakteri dicirikan dengan adanya ukuran

amplikon 1500 bp yang konstan. Kontrol negatif
tidak memiliki ukuran ini . Oleh karena itu, B5, B18,
B27, B34, dan B49 semuanya adalah isolat bakteri.
 Hasil sekuensing gen 16S rRNA mengidentifikasi isolat B5
sebagai Enterobacter tabaci NR146667 dengan kecocokan 79%
dengan record NCBI-blasted.

Isolat bakteri lain B18 dan B27 diidentifikasi sebagai

Enterobacter aerogenes LT703513.1 dengan kemiripan 98% dan
Citrobacter freundii KU570343,1 dengan kemiripan 99% ketika
dicocokkan dengan rekaman NCBI-blasted. Dua isolat terakhir
B34 dan B49 tidak dapat diidentifikasi karena urutannya terlalu
pendek untuk query.

Gel elektroferetik reaksi berantai polimerase dari strain

bakteri yang diisolasi menggunakan pasangan primer 27F dan
1492R. M: Tangga DNA 500 bp. ve: pengendalian bakteri. B5:
mengisolasi kode B5. B18: mengisolasi kode B18. B27: mengisolasi
kode B27. B34: mengisolasi kode B34. B49: mengisolasi kode B49.
 Berat Molekul Polygalacturonase PEC B5

Berat molekul enzim ditentukan dengan membandingkannya dengan penanda berat molekuldan
sampel endapan amonium sulfat dijalankan pada elektroforesis gel natrium dodesil sulfat poliakrilamida
(SDS PAGE). Gel asli yang ditempatkan di atas gel agar pektin kemudian dilakukan pewarnaan zymogram.

SDS Page atau Elektroforesis gel poliakrilamida - Sodium Dodesil Sulfat adalah teknik elektroforesis
gel yang menggunakan poliakrilamida untuk memisahkan protein yang bermuatan berdasarkan berat
molekulnya saja.

➔ Sodium Dodesil Sulfat (SDS) merupakan deterjen ionik yang dapat melarutkan molekul hidrofobik
yang memberikan muatan negatif pada keseluruhan struktur protein.
➔ Cara kerja SDS-PAGE adalah dengan menghambat interaksi hidrofobik dan merusak ikatan hidrogen.
➔ Metode SDS-PAGE digunakan untuk memisahkan protein demi keperluan biokimia, genetika forensik,
dan biologi molekuler

Berat molekul poligalakturonase PEC B5 mentah yang diekstraksi dan poligalakturonase PEC B5
yang dimurnikan sebagian masing-masing adalah 65 kDa dan 50 kDa
 SDS PAGE dari enzim SDS PAGE dari enzim PEC B5
poligalakturonase PEC B5 poligalakturonase yang dimurnikan
mentah. sebagian.
 KESIMPULAN
Penelitian ini menemukan strain bakteri penting yang
diisolasi dari buah tomat ( Lycopersicon esculentum Mill.)
yang memiliki kemampuan memproduksi enzim
poligalakturonase. Sifat ini akan sangat membantu dalam
memproduksi enzim penting dalam industri makanan,
minuman, dan farmasi dengan harga terjangkau.
Thank You