ESAI BIOLOGIS

BIOLIGICAL ASSAYS
Disain dan Analisis Bioesei

Urip Harahap

PROGRAM MAGISTER ILMU FARMASI

FAKULTAS FARMASI USU
2021
TTM-1
 OBJEKTIF:
Setelah mengikuti kuliah ini mahasiswa mampu:
Menjelaskan esai dan prinsip dasar esei biologis
Mendiskusikan keuntungan relatif esei biologis dibandingkan
dengan metoda fisika dan kimia
Menggambarkan problema utama jika dikaitkan dengan penggunaan
hewan atau jaringan hewan dalam esei biologi
Menjelaskan standar yang digunakan dalam esei biologi dalam term yang
umum
Menggambarkan makna aktivitas biologi
Menjelaskan efek yang diperoleh dalam esei biologi pada hewan
atau jaringan
Mendiskusikan aspek disain eksperimen esei biologi
Memahami teknik-teknik esei biologis baik dalam menguji bahan alam yang
belum pernah diketahui kahsiatnya secara farmakologis (kualitatif) dan
bahan atau obat yang telah ditehui aktivitas biologinya (kuantitatif).
 ASSAY
▪ Assay adalah prosedur investigasi
(analisis) dalam laboratorium (medicine),
farmakologi, biologi lingkungan, dan biologi
molekuler untuk menilai secara kualitatif
atau mengukur secara kuantitatif
keberadaan atau jumlah atau aktivitas
fungsional suatu entitas target (analit) bisa
berupa obat atau senyawa biokimia atau
sampel organik
Type of assay
https://www.slideshare.net/FarazaJaved/biological-assay

CHEMICAL ASSAY
▪ It is the study of the separation, identification, and quantification of
the chemical components of natural and artificial materials ▪
Spectrophomotetry, Spectrofluomtery, Chromatohraphy
IMMUNOASSAY
TYPES OF ASSAY BIOLOGICAL ASSAY
▪ Suatu teknik yang memanfaatkan pengikatan antara ▪ Prosedur pengujian biologi untuk memperkirakan konsentrasi bahan
antigen dan homologh antibodi untuk obat farmakologis dalam produk yang diformulasikan atau material bulk
mengidentifikasi dan mengukur antigen atau ▪ Potensi spesifik obat diberikan pada hewan atau relawan manusia,
respon obattersebut dibandingkan dengan standar
antibodispesifik dalam sampel
https://www.slideshare.net/FarazaJaved/biological-assay

MICROBIAL ASSAYS
▪ Microbiological assay: qualitative or quantitative dtermination of chemical compound
from a simple or even complex material with use of microorgnisms ▪ Used to
determine the potency of a drug in animal or man and monitoring and controlling
antimicrobial chemotherapy
▪ Many antimicrobial agents , wich inhibit the growth of microorganisms (antibiotics) or
are essential for their growth

Keuntungan:
▪ Simpel, spesifik, ruang/tempat, material dan waktu yang dibutuhkan minimal
▪ Relatif murah
▪ Convenionent method
Keterbatasan
▪ Memerlukan teknis yang trampil
▪ Perlu kalibrasi yang tepat
▪ Less reproducible
▪ Chances of greater error
▪ Tidak digunakan jika tersedia uji kimia atau fisika yang baik

BIOESAI
▪ Estimation of concentration or potency of a
substance by measurement o biological respons it
produces • i.e Observation of pharmacological effects
on ❖ Living tissues, or cells
❖ Microorganisms
❖ Animals
• Also known as BioStandardiztion

What is Bioassay?
▪ Bioassay: singkatan untuk BIOLOGICAL ASSAYS (pengujian
biologis) dan merupakan jenis eksperimen ilmiah.
▪ Bioassay lazimnya dilakukan untuk mengukur efek suatu zat pada
organisme hidup.
▪ Bioassay mungkin bersifat kualitatif atau kuantitatif.
▪ Bioassay kualitatif digunakan untuk menilai efek fisik suatu zat yang
mungkin tidak dikuantifikasi, seperti perkembangan atau deformitas
yang tidak normal. ▪ Bioassay kuantitatif melibatkan estimasi
konsentrasi atau potensi suatu zat dengan mengukur respons biologis
yang dihasilkannya.
▪ Bioassay kuantitatif biasanya dianalisis menggunakan metode biostatistik

What is Bioassay?
• Bioassay adalah penggunaan organisme hidup untuk menguji
keberadaan suatu senyawa atau untuk menentukan jumlah senyawa
 yang ada dalam sampel. Organisme yang digunakan sensitif
terhadap senyawa yang akan dilakukan pengujian.

• Dengan demikian, efek yang diamati biasanya adalah kematian atau

kesehatan organisme uji yang memburuk. Bergantung pada
organisme uji, sampel tanah, udara, atau cairan dapat diuji.

What is Bioassay?
• Contoh: sejarah klasik dari bioassay adalah penggunaan
burung kenari oleh para penambang di abad yang lalu,
karena kenari lebih sensitif ketimbang manusia
terhadap
gas berbahaya seperti metan. Burung kenari bereaksi
dengan cepat bahkan sejumlah kecil gas saja. Ini memberi
 kesempatan penambang untuk melarikan diri.
• Beberapa spesies tanaman juga dapat digunakan
untuk
melakukan bioassay di dalam air. Namun, yang lebih
umum, organisme uji adalah organisme bersel
tunggal
seperti alga, kutu air (khususnya spesies yang disebut
Daphnia magna.
Water flea, any member of
the crustacean order Anomopoda (class
Branchiopoda),

Principles of Bioassay
▪ Bioassay didefinisikan sebagai estimasi atau penentuan konsentrasi atau potensi zat fisik,
kimia atau biologi dengan cara mengukur dan membandingkan magnitud respon bahan
uji dengan standar (pada sistem biologis yang sesuai pada kondisi standar)
▪ Bioassay: perangkat (tool) yang dapat mengestimasi dan menemukan senyawa aktif dan
 merupakan cara yang penting sebab sensitive dan spesifik dan diaplikasi dalam farmakologi. ▪
Metode kimia adalah metode yang sangat kompleks, karena membutuhkan dosis dan
komposisi kimia yang tinggi menunjukkan tindakan farmakologis obat (bahan uji) (expl. Uji
kimia in vitro analite penghambat α-glucosidase)

Estimasi atau Determinasi Biologis besar respons bahan uji

Agen: Fisik Mengukur dan dengan standar pada
Kimia membandingkan sistem biologis sesuai
dengan kondisi standar

Metode kimia: metode yang sangat kompleks, Bioassay: instrumen yang dapat digunakan untuk
memerlukan dosis kimia tinggi dalam ujinya dan mengestimasi dan penemuan zat aktif biologis dan
komposisi kimia tersebut yang menunjukkan aplikasinya penting karena secara farmakologi memiliki
tindakan farmakologis sensitivitas dan memeiliki spesifisifitas
Bioassays are essential in the development of new drugs, and
monitoring pollutants in the environment. Environmental
bioassays are generally a broad-range survey of toxicity, and a
toxicity identification evaluation is conducted to determine what
the relevant toxicants are.
The use of bioassays include:
1. measurement of the pharmacological activity of new or chemically
undefined substances 2. investigation of the function of endogenous
mediators
3. determination of the side-effect profile, including the degree of drug toxicity
4. measurement of the concentration of known substances (alternatives to
the use of whole animals have made this use obsolete)
5. Assessing the amount of pollutants being released by a particular source, such
as wastewater or urban runoff.
Metode untuk mengukur efek obat sangat diperlukan agar kita
dapat membandingkan sifat-sifat zat yang berbeda, atau substans
yang sama pada circumstance yang berbeda, persyaratan ini
dipenuhi oleh teknik bioassay, yang didefinisikan sebagai estimasi
konsentrasi atau potensi suatu bahan dengan cara megukur
respons biologisnya pada living systems
BIOESAI DALAM PERSPEKTIF TOKSIKOLOGI
 LINGKUNGAN

• Bioesai: prosedur untuk menjelaskan (mendeskripsikan),

mengevaluasi, dan memprediksi potensi bahaya bahan
beracun bagi organisme dan ekosistem, serta aspek yang
berhubungan dengan kesehatan.
• Berbagai fenomena kimiawi, fisik, dan biologi mungkin akan
mengubah struktur kimiawinya, oleh karena itu nasib (fate),
respons, dan toksisitasnya bisa uji di laboratorium dan/atau
di alam (natural)

http://www.jstor.org/stable/25041968
 Application of bioassay in
pharmacology
• Determination of drugs potency
• Determine the therapeutic advantage of one drug over
another treatments
• Screening of new agents
• Determination of the pharmacological activities of a new
drug • Establishment of SAR
Comparison between
Bioassay and Chemical assay
• Bioassay is less precise
• In bioassay, active constituent and its structure do not have to
be known
• Bioassay is more sensitive
NOTE!!!:

Biologicals Substances which

cannot be completely characterised
by
physicochemical techniques alone,
and which therefore require the use
 of some form of bioassay.
Merujuk prinsip dasar bioesai,

▪ Membandingkan analit (senyawa/bahan uji) dengan

sediaan standar internasional yang sama selain untuk
mengetahui berapa banyak bahan uji yang diperlukan
untuk menghasilkan efek biologis yang sama seperti
yang dihasilkan oleh standar
BIOESAI DIGITALIS
▪ Prinsip: Potensi sampel uji dibandingkan dengan
 sediaan standar dengan menentukan kerjanya
pada otot jantung
▪ Sediaan Standar dan Satuan (Unit): Sediaan standar
adalah campuran daun digitalis kering dan serbuk
(1 unit = 76 mg)
▪ Persiapan Ekstrak: sejumlah tertentu serbuk
diekstraksi dengan alkohol (dehydrated) dalam
ektraktor selama 6 jam sampai Ekstrak akhir 10 ml
(5 ml alkohol + 5 ml air) per 10 g serbuk digitalis,
0 0
lalu disimpan di antara 5 C dan -5 C
BIOESAI OKSITOSIN

▪ Prinsip: Potensi oksitosin ditentukan dengan

 membandingkan aktivitasnya dengan Sediaan Standar
Oksitosin pada kondisi metode pengujian yang sesuai.
▪ Persiapan Standar: Sediaan standar adalah standar internasional
ke-4 untuk Oksitosin, didirikan pada tahun 1978, terdiri dari
peptida oksitosin sintetis beku-kering dengan albumin manusia
dan asam sitrat (disedakan dalam ampoul yang mengandung 12,5
Unit)
SUBJECT ON BIOASSAYS/ASSAYS
◼ Whole animals
◼ Isolated organs of vertebrates
◼ Lower organisms e.g. fungi, bacteria, insects,
 molluscs, lower plants, etc.
◼ Cultured cells such as cancer cells and tissues of
human or animal organs
◼ Isolated sub-cellular systems, such as enzymes,
receptors, etc
SUBJECT

• Bacteria can be used in bioassays. For example, the use of

bacteria to detect and determine the amount
of antibiotics or compounds that might be carcinogens in a
sample has been practiced for decades.
 SUBJECT
• Bioassay bakteri lain sangat berguna yaitu penggunaan bakteri
yang dirancang untuk berfluoresensi (memancarkan cahaya). Jika
bakteri dirusak oleh senyawa beracun yang ada dalam sampel uji,
bakteri gagal berfluoresensi.
• Penurunan fluoresensi populasi bakteri diukur dengan
spektrofotometer. Tingkat penurunan dibandingkan dengan
standar untuk menentukan konsentrasi senyawa beracun
tersebut
ESSENTIAL COMPONENTS OF
BIOASSAYS/ASSAYS
◼ Stimulus (Test sample, drug candidate, potential
agrochemical, etc)
◼ Subject (Animal, Tissues, Cells, Sub-cellular
orgenlles, Biochemicals, etc.)
◼ Response (Response of the subject to various
doses of stimulus)
WHY WE NEED TO
PERFORM BIOASSAY?
◼ Untuk memprediksi beberapa jenis potensi terapi, baik
secara langsung atau dengan analogi dari senyawa uji. ◼
Bioassay: istilah yang umum digunakan untuk uji biologis
dan biasanya jenis percobaan in vitro ◼ Bioassay biasanya
dilakukan untuk mengukur efek senyawa (zat) pada
organisme hidup atau sampel hidup lainnya.

Types of Bioassays?
➢ In Silico Screenings
➢ Non- physiological Assays
➢ Biochemical or Mechanisms-BasedAssays
➢ In Vitro Assays
◼ Assays on Sub-cellular Organelles
◼ Cell based Bioassays
◼ Ex-Vivo Assays
▪ Tissue based Bioassays
 ▪ NMR Based Drug Discovery
▪ In Vivo Bioassays
▪ Animal-based Assays/Preclinical Studies
▪ Human trial/Clinical Trials

IMPORTANCE OF STANDARDS
IN BIOASSAYS/ASSAYS

• The results of the assay/bioassay need to validated by

monitoring the effect of an available known
compound (Standard).
• Without judicious choice of standard and its
reproducible results in an assay system, no screening
can be claimed credible.
 IN VITRO BIOASSAYS

◼ In Vitro: In experimental situation outside the

organisms. Biological or chemical work done
in the test tube( in vitro is Latin for “in glass”)
rather than in living systems
◼ Examples include antifungal, antibacterial,
organ based assays,cellular assays, etc
Examples of In Vitro Bioassays
◼ ActivityAssays
DPPH assay
Xanthine oxidase inhibition assays
Superoxide scavenging assay
Antiglycation assay
◼ Bioassays (cell-based)
DNA Level
Protein Level
RNA Level
Immunology assay
◼ Toxicity Assays
MTT assay
Cancer cell line assays

IN VIVO SCREENINGS OR
PHARMACOLOGICAL SCREENINGS
◼In Vivo: Test performed in a living system
such as antidiabetic assays, CNS assays,
antihypertensive assays, etc.
Examples of In Vivo Bioassays

◼ AnimalToxicity
Acute toxicity
Chronic toxicity
◼ Animals Study
Animal model with induced disease
Animal model with induced injury
 ◼ Pre-ClinicalTrials
◼ ClinicalTrials
INDICATIONS FOR BIOASSAY
• Active principle of drug is unknown
• Active pple cannot be isolated, e.g. insulin,
posterior pituitary extract etc.
• Chemical method is either
– not available
– if available, too complex,
– insensitive to low doses e.g. Histamine can be
bioassayed in microgram conc.
• Unknown Chemical composition, e.g. long acting
thyroid stimulator.
• Chemical composition of drug variable but has
same pharmacological action e.g. cardiac
glycosides isolated from diff sources,
 catecholamines etc.
USES OF BIOASSAY
• The uses of bioassay are:
▪ To measure the pharmacological activity of new or
chemically undefined substances to investigate the function
of endogenous mediators
▪ To measure drug toxicity and unwanted effects.

Bioassays are critical for:

▪ Product development and manufacturing
▪ Ensuring continued quality, safety and efficacy of
biopharmaceutical products
▪ Bioassay plays a key role in the development of new drugs
 REFERENCE
1. https://www.bioassay.de/biological-assays/
2. https://www.sciencedirect.com/topics/agricultural-
and-biological sciences/bioassays
3. https://www.omicsonline.org/bioassay-peer-
reviewed-open-access journals.php
4. RRJOB | Volume 3 | Issue 2 | April - June, 2015