Cara Isolasi senyawa dari

bahan alam dengan penunjuk

bioassay dan pemurnian hasil
isolasi serta pengembangan
dan penemuan obat baru
Kelompok 2 :
-Dewi Amalia
-Febby Ananda Putri
-Hardiansyah
 ISOLASI SENYAWA

 Isolasi adalah cara- cara atau teknik untuk mendapatkan

senyawa tunggal dan murni dari senyawa yang bercampur
 Bioassay adaah analisis atau pengukuran dari suatu zat
untuk menentukan keberadaan dan dampaknya. Biasanya
yang diuji adalah efek obat dan kadar hormon
o
 Isolasi Bahan Alam

Kelompok bahan alam berupa lipid, protein, karbohidrat, alkaloid, flavonoid, terpenoid dan sebagainya.
Biasanya yang berasal dari metabolit dari tumbuhan.

Isolasi Bahan Alam dapat dilakukan berdasarkan sifat bahan alam tersebut :
- Isolasi cara fisis
- Isolasi cara kimia
r
Isolasi cara fisis

Isolasi atau pemisahan senyawa tunggal secara fisik dapat dilakukan dengan memperhatikan
takanan uap, perbedaan kelarutan dari bahan alam dalam pelarut.

Teknik untuk pemisahan/ektraksi ini dapat menggunakan dengan cara panas atau dingin.
• Teknik dengan cara panas
 Soxhlet
 Refluks
 Destilasi uap
 Infusa
• Teknik dengan cara dingin
 Maserasi
 Perkolasi
Isolasi cara kimia

Isolasi cara kimia berdasarkan sifat kimia atau kereaktifan bahan alam terhadap preaksi
tertentu.
Bahan alam diisolasi melalui reaksi kimia dan dipisahkan dari senyawa lain yang tidak
bereaksi.
Bioassay
Bioassay adalah suatu analisis atau pengukuran dari suatu zat untuk menentukan
keberadaaan dan dampaknya. Pengujiaan bioassay biasa dilakukan pada efek obat dan
kadar hormon. Bioassay dibagi atas 2 klasifikasi
1. Bioassay kualitatif
2. Bioassay kuantitatif
Klasifikasi Bioassay
Bioassay Kualitatif
Bioassay kualitatif merupakan cara pemeriksaan kualitatif obat/sediaan obat
atau wadah obat (alat-alat infuse, injeksi) dengan memanfaatkan fenomena
biologis yang timbul. Termasuk dalam bioassay kualitatif diantaranya:
1. Uji pirogen
2. Uji sterilitas
3. Uji mikrobia
1. Uji Pirogenitas
Uji pirogenitas yaitu: uji yang dilakukan untuk mengetahui apakah suatu sediaan Uji Steril
bebas pirogen atau tidak
- Cara pengujian: dengan mengukur peningkatan suhu badan kelinci yang
disebabkan penyuntikan intravena sediaan uji steril
- Hewan percobaan: kelinci (syarat: seminggu sebelum pengujian tidak
menunjukkan penurunan bobot badan)
Hewan percobaan tidak dapat digunakan jika:
a. Tiga hari sebelumnya dipakai untuk pengujian pirogenitas, hasil negative
b. Tiga minggu sebelumnya digunakan untuk pengujian pirogenitas sediaan uji tidak
memenuhi syarat
c. Telah digunakan kapan saja untuk pengujian pirogenitas tetapi respon rata-rata kelompok
kelinci melebihi 1,2°
2. Uji Sterilitas
Maksud Uji: untuk menetapkan ada tidaknya bakteri, ragilyeast yang hidup
dalam sediaan zat yang diperiksa - Jumlah sampel: kecuali dinyatakan lain
digunakan jumlah sampel seperti tertera dalam tabel
2. Uji Sterilitas
Sediaan Uji: dibuat menggunakan zat uji sejumlah tertera pada table di
bawah atau sisa pada membran penyaring 450 nm yang diperoteh sebagai
berikut:
1. Zat uji berupa larutan atau cairan (> 10 ml) disaring lebih dahulu dengan penyaring membran
2. Zat uji berupa serbuk: dilarutkan atau menggunakan pelarut steril yang cocok
3. Larutan atau suspensi minyak: dikocok dahulu yang cocok, disaring melalui penyaring
membrane
2. Uji Sterilitas
Medium Perbenihan ( Ada dalam daftar Farmakope Edisi III)
Kuman Indikator
1. B. aerob : -
-Bacillus substillis DKBS
-Sarcina lutea DKSL
2. B. anaerob :
- Bacteoroides vulgatus DKBV
- Clostridium sporogenes DKCS
3. Ragi/yeast dan jamur:
- Candida albicans DKCA
Uji Pendahuluan: (Fl ed. III)
- uji fertilitas medium perbenihan
- uji efektifitas medium perbenihan
- Penafsiran Hasil: Zat uji dinyatakan memenuhi syarat stenlitas, jika pada masing-masing tabung tidak terdapat
pertumbuhan jasad renik
3. Uji Mikrobial (Uji batas Bacterioloqical test)
-Uji dilakukan untuk: menetapkan banyaknya mikroba (jasad renik) aerob hidup yang
terdapat dalam zat atau untuk menyatakan zat bebas cemaran jasad renik tertentu.
- Pengujian meliputi:
a. Perhitungan banyaknya mikroba aerob: dihitung jumlah koloni pertumbuhan bakteri tiap
gram atau ml sediaan yang diuji
b. Pengujian bebas jasad renik meliputi:
- uji bebas Staphyllococcus dan Pseudomonas
1. uji koagulasi (untuk Staphyllococcus aureus)
2. uji oksidase (untuk Pseudomonas aeruginosa)
3. uji bebas Salmonella dan Escherichia coil
Sediaan Uji dinyatakan bebas, jika tiap cawan uji tidak menunjukkan tanda-tanda seperti
tertera pada persyaratan Farmakope Indonesia ed. III)
Klasifikasi Bioassay
Bioassay Kuantitatif
Bioassay kuantitatif merupakan cara penetapan potensi obat dengan
mengamati efek biologis. Efek bIogis mi digolongkan dalam dua bagian
besar yaitu respon farmakotogis (respon yang terjadi atau mempengaruhi
satu system tertentu pada tubuh organisme) dan respon biologis (respon
terjadi atau mempengaruhi pada seluruh tubuh organisme).
 Pengembangan dan
Penemuan Obat Baru
 Pengembangan dan
Penemuan Obat Baru

• Bioassay memiliki dua peran utama dalam isolasi senyawa aktif

dari bahan alam, yaitu Uji skrining dan ujin monitoring.
• Uji skrining digunakan untuk mendeteksi keberadaan senyawa
aktif dalam ekstrak,
• sementara uji monitoring digunakan untuk menelusuri konstituen
aktif selama proses isolasi.
• Jumlah dan tingkat aktivitas kandungan senyawa dalam bahan
alam tergantung pada lingkungan, proses pengumpulan, dan
penyimpanan. Perlu diingat bahwa kondisi lingkungan akan
berpengaruh pada variasi kandungan senyawa. Hal ini berguna
dalam uji skrining dan uji monitoring.
 Pengembangan dan
Penemuan Obat Baru

• Uji skrining dapat diklasifikasikan menjadi bioassay umum dan

spesifik.
• Uji skrining luas bisa digunakan untuk mendeteksi aktivitas secara
umum dan sskrinig speisifik untuk uji aktivitas terhadap penyakit
tertentu atau organisme tertentu. Kedua jenis uji ini didasarkan
pada respon organ, sel kultur, jaringan, enzim.
 Uji Skrining Organisme

Organisme yang digunakan dalam uji skrining biasanya mikroorganisme, hewan dan manusia. Dua
biaoassay yang paling umum digunakan adalah uji letalitas udang (Brine Shrimp Lethality Test,
BSLT) dan uji penghambatan tumor empedu. BSLT menggunakan udang dari jenis Artemis salina.
Tes ini biasnaya dilakukan dengan cara menambahkan ekstrak dalam konstrasi yang berbeda
kedalam 5m air garam berisi 10 udang. Jumlah udang yang masih hidup dan yang mati dihhotung
setelah 24 jam dan hasilnya dinyatakan sebagai LC50 atau nilai LD50, dosis yang dibutuhkan untuk
membunuh 50 persen.
Uji skrining yang paling sederhana adalah dengan menggunakan mikroorganisme seperti bakteri,
virus, jamur dan amuba. Uji ini biasanya didasarkan pada penghambatan pertumbuhan
mikroorganisme dalam agar oleh ekstrak dan dibandingkan kontrol. Uji ini bisa dilakukan dengan
menggunakan cawan petri atau plat mirkotiter (96-well plate). Kerugian penggunaan organisme
adalah spesies sama dan dapat menghasilkan response terhadap obat yang berbedea. Hal ini dapat
diatasi dengan pengulangan pengujian untuk mendapatkan data yang layak secara statistik. Masalah
etika menjadikan penggunaan mamalia dalam skrining mendai mahal dan tidak memungkinakn
 Uji Dengan Sel Kultur

Saat ini sell mamalia bisa di isolasi dan ditumbukan dalam media kultur.
Sel mamalia biasanya mempunyai reseptor unik yang bisa digunakan
dalam uji skrining.
Uji ini biasanya didasarkan pada interaksi kadungan senyawa aktif
terhadap reseptor dan juga kemampuan penghambatan terhadap reseptor.
Sell bisa diproduksi di dalam plat mikrotiter yang bisa digunakan dalam
HTS. Ekstrak dengan seri konsentrasi bisa digunakan dan reagen
diperlukan untuk menghasilkan warna, fluoresensi, luminesence atau
radioaktivitas yang dikorelasikan dengan reseptor atau metabolit yang
diproduski oleh sell
 Uji Dengan Enzin

Uji ini digunakan untuk menentukan apakah ekstrak mengkativasi atau

menghambat enzim. Informasi ini dapat dihubungkan dengan tipe
aktivitas dari komponen senyawa dalam ekstrak. Sebagai contoh, aktivasi
enzim trypsin dapat menunjukkan kemampuan pembersihan luka nekrosis,
ulser dan bases sedangkan aktivitas penghambatan dapat menunjukkan
aktivitas antitrobosis, anti-inflamasi dan anti-fertitilas.
Uji ini bisanya berupa uji kuantitaif yang didasarkan pada konversi
substrat ke produk oleh enzim. Produk dideteksi dengan berbagai metode
(radioativitas, fluoresen, UV-vis). Hasil reaksi dibandingkan dengan
kontrol negatif untuk menunjkkan apakah ekstrak meneyebabkan aktivasi
atau inhibisi enzim
 Jaringan terisolasi

Jaringan terisolasi yang klasik adalah pengukuran kontraksi atau

pengahambatan kontraksi, misalnya usus Guinia-pig yang ditempatkan
dalam bath yang berisi nutrien dan ekstrak. Jaringan terisolasi bisanya
sangat sensistif dan berbagai jenis jaringan sudah digunakan dalam
berbagai uji. Namun variasi respon jaringan terisolasi berkaitan dnegan
kebutuhan konsentrasi ekstrak yang besar. Selain itu, uji ini juga hanya
memberikan informasi awal dimana uji klinis yang memadahi terhadap
senyawa murni sangat diperlukan.
Uji Monitoring
uji skrining yang sebelumnya bisa digunakan dalam uji monitoring untuk melacak
senyawa aktif dalam ekstrak dalam proses isolasinya.
Dalam uji monitoring dilakukan :
1. Perubahan aktivitas karena dekomposi
Dekomposisi senyawa aktif bisa terjadi karena kondisi kimia fisika selam frakasinasi
atau dikarenakan oleh ketidak stabilan dari senywa aktif itu sendiri. Dekomposisi
biasnaya terjadi karena oksidasi, hidroslis dan polimerisasi. Salah satu penyebab
dekomposiis dalam proses frkasinasi adalah karena frkasinasi dilakaun dalam
kondisis yang keras (misal panas tinggi). Hal ini dapat diatasadi dengan menjaga
kondisi yang lunak selama proses, misalnya tempertur rendah, keasaman atau
kebasaan disekitar pH normal dan penghilangan pelarut dengan Freeze drying atau
distilasi dengan vakum
Uji Monitoring
2. Aktivitas berubah karena perubahan aktivitas sinergisme
Senergi muncul ketika campuran dari dua atu lebih senyawa mempunyai
aktvitas yang lebih tinggi daibanding dangan aktivitas individual. Akibatnya,
ketika salah satu komponen campuran hilang (dalam proses frkasinasi) maka
aktivitas biologisnya akan menurun secara signifikan.
Sebagai contoh, aktivitas thlidomide (obat myeloma) akan meningkat
aktivitasnya jika diberikan bersama dengan dexamethason dimana
dezametason sendiri tidak mempunyai aktivitas terhadap myloma
Uji Monitoring
3. Perubahan aktivitas karena hilang selama proses fraksinasi
Senyawa aktif bisa tertahan dalam poses fraksinasi. Sebagai contoh,
senyawa aktif terikat kuat atau terikat secara permanen dalam fasa stasioner
kromatografi. Sehingga, selama proses kromatografi, senyawa aktif akan
hilang atau tidak muncul dalam frkasi produk kromatografi. Selain itu,
pengunaan distilasi dan sublimasi untuk meningkatkan konsentrasi fraksi
dapat mengakibtakan terbentuknya kodestilat atau kosublimat yang dapat
mengakibatkan senyawa aktif hilang selama distilasi atau sublimasi
Pemurnian dan Elusidasi
Senyawa aktif yang diisolasi perlu dimurnikan dan dielusidasi struktur
molekulnya. Jika senyawa aktif mempunya potensi komersial, maka
sintesis senyawa analog dan studi SAR dan QSAR diperlukan. Namun,
jika sumber alam secara komersial bisa menghasilkan senyawa aktif yang
cukup maka dapat menghindari proses produksi melalui sintesis beaya
tinggi, apalagi dengan kompleksitas stereokimia dari senyawa aktif.
Misalnya, senyawa antikanker vincristine, etoposid dan Taxol telah
disintesis, senyawa ini memiliki atom carbon kiral yang lebih ekonomis
bila diproduksi dengan proses ektraksi dari bahan lama dibanding dengan
sintesis
THANK YOU