Aktivitas In Vitro Allicin Tersendiri Dan Dalam Kombinasi

Dengan Obat Antijamur Terhadap Microsporum canis Yang

Diisolasi Dari Penderita Tinea Capitis

Metode checkerboard broth berdasarkan dokumen The Clinical and Laboratory Standards
Institute M38-A3 digunakan dalam penelitian ini untuk mengevaluasi aktivitas in vitro allicin
tersendiri dan dalam kombinasi dengan obat antijamur (griseofulvin, fluconazole,
itraconazole dan terbinafine) terhadap Microsporum canis yang diisolasi dari pasien dengan
tinea capitis. Ketika allicin digunakan tersendiri, hanya efek anti-M.canis lemah yang
ditemukan. MIC50, MIC90 dan rata-rata geometris (GM) terbinafine adalah yang terendah di
antara senyawa yang diuji. Sinergisme diamati untuk kombinasi allicin dengan itraconazole
dan terbinafine. Hanya indifference yang diamati untuk kombinasi allicin dengan griseofulvin
dan fluconazole. Studi kami mengilustrasikan sinergisme allicin dalam kombinasi dengan
itraconazole dan terbinafine, yang dapat menjadi referensi untuk pengobatan tinea capitis
akibat Microsporum canis.

PENDAHULUAN

Tinea capitis adalah dermatofitosis umum pada kulit kepala dan folikel rambut. Sebuah studi
sebelumnya tentang epidemiologi tinea capitis pada anak-anak menunjukkan bahwa
Microsporum canis adalah patogen yang paling umum di sebagian besar wilayah China.

Griseofulvin, terbinafine, fluconazole dan itraconazole adalah obat antijamur yang paling
umum digunakan untuk tinea capitis. Namun, resistensi terhadap obat antijamur muncul di
Microsporum canis. Strain Microsporum canis yang resisten griseofulvin dengan minimum
inhibitory concentration (MIC) tinggi diisolasi dari tinea capitis bandel yang diobati dengan
griseofulvin. Baru-baru ini, strain Microsporum canis yang resisten terhadap terbinafine
diisolasi dari seekor kucing yang gagal dengan pengobatan terbinafine topikal. MIC in vitro
azoles yang tinggi juga telah dicatat di Microsporum canis. Untuk mengatasi mikosis yang
resistan terhadap obat, kombinasi obat antijamur tradisional dengan agen non-antijamur
telah diusulkan sebagai strategi pengobatan yang menjanjikan.
Allicin, senyawa sulfur dari bawang putih, telah terbukti memiliki aktivitas melawan
Candida, Cryptococcus, Trichophyton, Epidermophyton, dan Microsporum. Meskipun allicin
dan fluconazole sinergis in vitro terhadap Candida albicans, belum ada penelitian yang
dilakukan pada aktivitas in vitro allicin dalam kombinasi dengan obat antijamur terhadap
Microsporum canis.

Dalam penelitian ini, aktivitas antijamur in vitro allicin tersendiri atau dalam kombinasi
dinilai terhadap 30 strain Microsporum canis klinis. Hasilnya akan membantu kami
mengevaluasi potensi terapeutik allicin dalam kombinasi dengan obat antijamur terhadap
tinea capitis.

BAHAN DAN METODE

Mikroorganisme

Sebanyak 30 strain Microsporum canis diuji. Mereka semua pulih dari rambut pasien dengan
tinea capitis di The Outpatient Clinic of Dermatology (Beijing Children’s Hospital, Capital
Medical University). Setiap isolat disimpan dalam glycerol 10% pada suhu −80 C. Candida
parapsilosis (ATCC 22019) dan Trichophyton interdigitale (ATCC MYA 4439) dipilih sebagai
kontrol kualitas.

Semua strain diidentifikasi secara mikroskopis dan dengan sekuensing molekuler dari
wilayah internal transcribed spacer (ITS). DNA genom dari setiap strain diekstraksi dengan
menggunakan kit Ekstraksi DNA Genomik Jamur Biospin (Bioer Technology Ltd; Hubei,
China) sesuai dengan instruksi pabriknya. DNA yang diekstraksi dielusi dengan 100 μl air
sulingan, dan 1 μl DNA yang diekstraksi digunakan untuk polymerase chain reaction (PCR).
Wilayah ITS diamplifikasi menggunakan primer ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′) dan
ITS4 (5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′). Setiap campuran PCR mengandung 1 μl DNA jamur
yang diekstraksi, masing-masing 0,08 μM primer, dan 12,5 μl 2 × Taq PCR MasterMix
(Tiangen Biotech Ltd; Beijing, China) dalam 25 μl volume reaksi. Siklus PCR terdiri dari
denaturasi awal pada 95◦C selama 5 menit, diikuti oleh 35 siklus 95◦C selama 30 detik, 58◦C
selama 30 detik, dan 72◦C selama 1 menit, diikuti dengan extension akhir pada 72◦C selama
10 menit dan pendinginan hingga 4◦C. Produk amplicon kemudian diurutkan oleh Tian Yi Hui
Yuan Company (Beijing, China). Urutan yang diperoleh dibandingkan dengan yang ada di
basis data DNA GenBank (//blast.ncbi.nlm.nih.gov/). Urutan yang diperoleh telah disimpan
di GenBank dengan nomor aksesi berikut: MT163398-MT163427.
Bahan kimia

Semua obat diperoleh dari Harvey Biotech Ltd., (Beijing, Cina) dan dilarutkan dalam
dimethyl sulfoxide (DMSO). Konsentrasi larutan persediaan adalah sebagai berikut: 12,8
mg/mL untuk allicin; 6,4 mg/mL untuk fluconazole; 1,6 mg/mL untuk itraconazole,
griseofulvin dan terbinafine. Obat-obatan dianalisis dalam rentang konsentrasi akhir berikut:
2–128μg/mL untuk allicin; 0,015–8 μg/mL untuk itraconazole dan griseofulvin; 0,125– 64
μg/mL untuk fluconazole; dan 0,001–0,5 μg/mL untuk terbinafine. Konsentrasi akhir DMSO
tidak melebihi 1% di test wells.

Uji Mikrodilusi Checkerboard

Pengujian dilakukan sesuai dengan metode mikrodilusi checkerboard broth berdasarkan

dokumen The Clinical and Laboratory Standards Institute M38-A3. Secara singkat, semua
strain yang terdaftar dalam penelitian kami tumbuh selama 14 hari pada potato dextrose
agar pada suhu 28◦C, dan suspensi conidial disiapkan dengan menggores permukaan koloni
jamur secara perlahan ke dalam sterile physiological saline. Fragmen hyphae yang berat
didiamkan selama 5 menit pada suhu kamar dan bagian atas, suspensi conidial digunakan
sebagai inoculum. Uji kepekaan kemudian dilakukan dalam medium RPMI 1.640 (Gibco, AS)
yang ditambah dengan 0,3 g/l L-glutamine tetapi tanpa sodium bicarbonate dan ditahan
hingga pH 7,0 dengan 0,165 M asam 4-morpholinopropanesulfonic (Amresco, AS).
Konsentrasi akhir dari suspensi yang didifusikan dalam the wells disesuaikan menjadi ~1–3 ×
10^3 CFU/mL, sebagaimana ditentukan dengan hemocytometer. Pencairan serial 2 kali lipat
dari 50 μl masing-masing obat A (allicin) dan B (fluconazole, itraconazole, griseofulvin atau
terbinafine) dibagikan sepanjang arah vertikal dan horizontal untuk menghasilkan 100 μl per
well dalam pelat microtiter 96 well. Seratus mikroliter suspensi inoculum yang telah
dicairkan dimasukkan ke dalam masing-masing well. Pelat diinkubasi pada suhu 35◦C selama
4-5 hari. MIC ditentukan sebagai konsentrasi terendah yang menghasilkan pengurangan
kekeruhan 100% dengan pengamatan visual dengan cermin cekung bila dibandingkan
dengan kontrol drug-free. Semua percobaan dilakukan dalam ulangan pada hari yang
berbeda.

Analisis Interaksi Obat

Interaksi kombinasi obat dievaluasi berdasarkan the fractional inhibitory concentration

index (FICI), yang merupakan jumlah dari MIC dari masing-masing obat dalam kombinasi
dibagi dengan MIC dari obat yang digunakan tersendiri. Interaksi obat didefinisikan sebagai
berikut: FICI ≤0.5, sinergisme; FICI >0,5 dan ≤4,0, indifference; dan FICI >4.0, antagonisme.
HASIL

Hasil uji kepekaan in vitro strain Microsporum canis terhadap obat antijamur saja tercantum
dalam Tabel 1, 2. Ketika allicin digunakan tersendiri, hanya efek anti-M.canis lemah yang
ditemukan (MICs, 16-128; GM, 46.313μg/ml). Kami juga menemukan bahwa MIC 50, MIC90
dan rata-rata geometris (GM) dari terbinafine adalah yang terendah. Di antara azole yang
diuji, fluconazole memiliki MIC50, MIC90 dan GM yang lebih tinggi daripada itraconazole.

Hasil untuk setiap kombinasi obat tercantum dalam Tabel 1, 3. Sinergisme diamati dalam
kombinasi berikut: allicin + itraconazole (86,7%) dan allicin + terbinafine (80%) (Tabel 1, 3).
Ketika sinergisme diamati, pengurangan rata-rata itraconazole adalah 8 kali lipat (sekitar 4
hingga 32 kali lipat), sedangkan pengurangan rata-rata terbinafine adalah 16 kali lipat
(sekitar 4 hingga 32 kali lipat) (Tabel 1). Hanya indifference yang diamati pada kombinasi
berikut: allicin + griseofulvin dan allicin + fluconazole (Tabel 1, 3).

DISKUSI

Meskipun banyak obat antijamur sintetik tersedia untuk dermatofitosis, terjadinya resistensi
atau efek samping toksik dapat menyebabkan kegagalan pengobatan. Dengan demikian,
strategi terapi baru diperlukan. Perbaikan efikasi obat antijamur sintetik dan pengurangan
toksisitas dapat dicapai dengan menggunakan terapi kombinasi dengan obat antijamur
alami. Studi sebelumnya telah menunjukkan efek essential oils herbal dan sinergismenya
dengan ketoconazole terhadap Trichophyton spp. Dalam penelitian ini, kami menyelidiki
aktivitas antijamur in vitro allicin tersendiri dan dalam kombinasi dengan empat agen
antijamur (griseofulvin, fluconazole, itraconazole, dan terbinafine) terhadap isolat klinis
Microsporum canis.

Griseofulvin adalah antijamur sistemik pertama yang diperkenalkan untuk dermatofitosis.

Namun, penggunaannya telah digantikan oleh itraconazole dan terbinafine pada jenis
dermatofitosis lainnya. Griseofulvin bekerja dengan menghancurkan struktur spindle mitosis
dan menghambat sintesis asam nukleat. Meskipun strain Microsporum canis yang resisten
griseofulvin telah didokumentasikan dalam penelitian yang berbeda, tidak ada strain
resisten griseofulvin yang terdeteksi dalam penelitian kami. Dalam penelitian ini, MIC 50 dan
MIC90 dari griseofulvin adalah 0,5 dan 1μg/mL, yang konsisten dengan penelitian
sebelumnya dari Iran. Meskipun antagonisme tidak diamati untuk kombinasi allicin dan
griseofulvin, sinergisme juga tidak diamati. Kombinasi mereka pada pengobatan mungkin
tidak cocok.

TABEL 1. Interaksi in vitro allicin dengan griseofulvin, fluconazole, itraconazole, dan

terbinafine terhadap strain Microsporum canis.
TABEL 2 | MIC obat allicin dan antijamur diuji tersendiri terhadap strain Microsporum canis
(μg/mL).
TABEL 3 | Rentang MIC dari kombinasi obat, rentang FICI dan rasio sinergis dari strain
Microsporum canis yang diuji (μg/mL).

Azoles bekerja pada biosintesis ergosterol dengan menghambat 14α-demetilasi lanosterol,

yang menyebabkan perubahan permeabilitas membran jamur dan sintesis dinding sel jamur
yang rusak. Dalam penelitian kami, fluconazole memiliki MIC 50, MIC90 dan GM yang lebih
tinggi daripada itraconazole, menunjukkan bahwa yang terakhir mungkin lebih unggul untuk
pengobatan tinea capitis. Hasil ini konsisten dengan penelitian sebelumnya dari Iran. Efek
sinergis in vitro allicin dan fluconazole telah diamati terhadap C. albicans. Menariknya,
kombinasi ini indifferent terhadap Microsporum canis, yang mungkin karena perbedaan
spesies. Selain itu, penelitian sebelumnya dari Malaysia juga menunjukkan bahwa allicin
yang dikombinasikan dengan fluconazole menunjukkan interaksi yang tidak berbeda
terhadap Microsporum canis. Allicin memang menunjukkan efek sinergis dalam kombinasi
dengan itraconazole terhadap Microsporum canis (86,7%).

Terbinafine menghambat enzim squalene epoxidase, menghambat sintesis 2,3-

oxidosqualene dan dengan demikian menyebabkan akumulasi squalene dan penipisan
ergosterol. Terbinafine memiliki MIC50 terendah (0,03μg/mL), MIC90 (0,06μg/mL) dan GM
(0,026μg/mL) di antara obat yang diuji terhadap Microsporum canis dalam penelitian kami.
Sebuah studi sebelumnya dari Iran juga menunjukkan aktivitas antijamur in vitro terbinafine
yang tinggi terhadap Microsporum canis. Namun kurang bermanfaat dalam pengobatan
tinea capitis akibat Microsporum canis. MICs terbinafine terhadap Microsporum canis bisa
lebih tinggi dari konsentrasi maksimum yang dilaporkan pada rambut, menyebabkan
kegagalan pengobatan. MICs terbinafine dalam kombinasi dengan allicin menurun secara
signifikan dibandingkan dengan terbinafine saja, menunjukkan bahwa kombinasi mereka
dapat meningkatkan pengobatan terbinafine di tinea capitis karena Microsporum canis.

Mekanisme antijamur allicin yang sebenarnya belum sepenuhnya dipahami. Ini dapat
menyebabkan oksidasi glutathione yang menghasilkan pergeseran potensial cellular redox,
menginduksi apoptosis sel jamur. Studi transcriptome lain mengungkapkan bahwa allicin
melemahkan ekspresi gen yang mengkode enzim metabolisme asam amino, penyerapan zat
besi, rantai pernapasan, metabolisme thiamine, dan degradasi protein proteasomal sel
jamur. MIC50 dan MIC90 allicin adalah 32 dan 128μg/mL dalam penelitian ini. Namun,
penelitian sebelumnya menunjukkan MIC50 sebesar 0,098 μg/mL dan MIC90 sebesar 0,195
μg/mL, yang jelas lebih rendah. Yamada dan Azuma menemukan MIC Trichophyton,
Epidermophyton, dan Microsporum serendah 0,78–6,2μg/mL. Studi lain sebelumnya
melaporkan MIC yang lebih tinggi (16-32 μg / mL) dari Trichophyton ke allicin, yang
konsisten dengan penelitian kami. Perbedaan serupa juga diamati pada C. albicans. Studi
sebelumnya menunjukkan bahwa rentang MIC allicin untuk strain C. albicans yang diuji
adalah 0,025–12,5 μg/mL. Namun, studi lain menunjukkan rentang MIC yang sangat tinggi
(64–512μg/mL) dari allicin ke strain C. albicans. Perbedaan tersebut mungkin disebabkan
oleh perbedaan sumber obat, strain yang diuji dan uji kepekaan antijamur. Allicin tersendiri
tidak memiliki aktivitas antijamur yang kuat, sedangkan aktivitas antijamur sinergis allicin
dengan itraconazole dan terbinafine. Allicin dapat menjadi terapi tambahan untuk terapi
itraconazole dan terbinafine tradisional pada tinea capitis yang disebabkan oleh
Microsporum canis untuk mengurangi jalannya pengobatan atau dosis obat.

Sebagai kesimpulan, kami menggambarkan kerentanan antijamur Microsporum canis

terhadap allicin, fluconazole, itraconazole, terbinafine dan griseofulvin dan menyelidiki
aktivitas antijamur gabungan allicin dengan obat antijamur. Keterbatasan utama dari
penelitian ini adalah bahwa strain resisten tidak diuji. Studi kami mengungkapkan bahwa
kombinasi allicin dengan itraconazole dan terbinafine dapat mewakili perspektif yang
menarik untuk pengembangan strategi manajemen baru untuk tinea capitis karena
Microsporum canis. Studi in vivo lebih lanjut diperlukan untuk memvalidasi temuan kami.
PERNYATAAN KETERSEDIAAN DATA

Kumpulan data yang disajikan dalam penelitian ini dapat ditemukan di repositori online.
Nama repositori/repositori dan nomor aksesi dapat ditemukan di artikel/materi tambahan.

KONTRIBUSI PENULIS

YZ dan YX berkontribusi pada konsepsi dan desain penelitian. YZ dan JC merekrut pasien dan
mengumpulkan data. YZ menulis draf pertama naskah. Semua penulis berkontribusi pada
artikel dan menyetujui versi yang dikirimkan.

REFERENSI

1. Zhan P, Li D, Wang C, Sun J, Geng C, Xiong Z, et al. Epidemiological changes in tinea

capitis over the sixty years of economic growth in China. Med Mycol. (2015) 53:691–
8. doi: 10.1093/mmy/myv057
2. Khurana A, Sardana K, Chowdhary A. Antifungal resistance in dermatophytes: recent
trends and therapeutic implications. Fungal Genet Biol. (2019) 132:103255. doi:
10.1016/j.fgb.2019.103255
3. Chadeganipour M, Nilipour S, Havaei A. In vitro evaluation of griseofulvin against
clinical isolates of dermatophytes from Isfahan. Mycoses. (2004) 47:503–7. doi:
10.1111/j.1439-0507.2004.01050.x
4. Hsiao YH, Chen C, Han HS, Kano R. The first report of terbinafine resistance
Microsporum canis from a cat. J Vet Med Sci. (2018) 80:898– 900. doi:
10.1292/jvms.17-0680
5. Abastabar M, Jedi A, Guillot J, Ilkit M, Eidi S, Hedayati MT, et al. In vitro activities of
15 antifungal drugs against a large collection of clinical isolates of Microsporum
canis. Mycoses. (2019) 62:1069–78. doi: 10.1111/myc.12986
6. Liu S, Hou Y, Chen X, Gao Y, Li H, Sun S. Combination of fluconazole with non-
antifungal agents: a promising approach to cope with resistant Candida albicans
infections and insight into new antifungal agent discovery. Int J Antimicrob Agents.
(2014) 43:395–402. doi: 10.1016/j.ijantimicag.2013.12.009
7. Yamada Y, Azuma K. Evaluation of the in vitro antifungal activity of allicin. Antimicrob
Agents Chemother. (1977) 11:743–9. doi: 10.1128/AAC.11.4.743
8. GuoN,WuX,YuL,LiuJ,MengR,JinJ,etal.Invitroandin vivo interactions between
fluconazole and allicin against clinical isolates of fluconazole-resistant Candida
 albicans determined by alternative methods. FEMS Immunol Med Microbiol. (2010)
58:193–201. doi: 10.1111/j.1574-695X.2009.00620.x
9. Vitale RG, Afeltra J, Dannaoui E. Antifungal combinations. Methods Mol Med. (2005)
118:143–52. doi: 10.1385/1-59259-943-5:143
10. Clinical and Laboratory Standards Institute. Reference Method for Broth Dilution
Antifungal Susceptibility Testing of Filamentous Fungi. 3rd ed. Wayne, PA: Clinical
and Laboratory Standards Institute (2017).
11. Shin S, Lim S. Antifungal effects of herbal essential oils alone and in combination with
ketoconazole against Trichophyton spp. J Appl Microbiol. (2004) 97:1289–96. doi:
10.1111/j.1365-2672.2004.02417.x
12. Gupta AK, Cooper EA. Update in antifungal therapy of dermatophytosis.
Mycopathologia. (2008) 166:353–67. doi: 10.1007/s11046-008-9109-0
13. Finkelstein E, Amichai B, Grunwald MH. Griseofulvin and its uses. Int J Antimicrob
Agents. (1996) 6:189–94. doi: 10.1016/0924-8579(95)00037-2
14. Aala F, Yusuf UK, Khodavandi A, Jamal F. In vitro antifungal activity of allicin alone
and in combination with two medications against six dermatophytic fungi. Afr J
Microbiol Res. (2010) 4:380–5. doi: 10.5897/AJMR.9000386
15. Arabatzis M, Kyprianou M, Velegraki A, Makri A, Voyatzi A. Microsporum canis
antifungal susceptibilities: concerns regarding their clinical predictability. Int J
Antimicrob Agents. (2010) 36:385–6. doi: 10.1016/j.ijantimicag.2010.06.032

16. Gruhlke MC, Portz D, Stitz M, Anwar A, Schneider T, Jacob C, et al. Allicin disrupts the
cell’s electrochemical potential and induces apoptosis in yeast. Free Radic Biol Med.
(2010) 49:1916–24. doi: 10.1016/j.freeradbiomed.2010.09.019
17. Yu L, Guo N, Meng R, Liu B, Tang X, Jin J, et al. Allicin-induced global gene expression
profile of Saccharomyces cerevisiae. Appl Microbiol Biotechnol. (2010) 88:219–29.
doi: 10.1007/s00253-010-2709-x
18. Pyun MS, Shin S. Antifungal effects of the volatile oils from Allium plants against
Trichophyton species and synergism of the oils with ketoconazole. Phytomedicine.
(2006) 13:394–400. doi: 10.1016/j.phymed.2005.03.011
19. Khodavandi A, Alizadeh F, Harmal NS, Sidik SM, Othman F, Sekawi Z, et al.
Comparison between efficacy of allicin and fluconazole against Candida albicans in
vitro and in a systemic candidiasis mouse model. FEMS Microbiol Lett. (2011)
315:87–93. doi: 10.1111/j.1574-6968.2010.02170.x