I.

Tujuan Percobaan

- Mengerjakan satu metode penentuan cara kerja antibiotika

- Melihat perubahan konsentrasi terhadap sifat bakterisid dan bakteriostatik

II. Tinjauan Pustaka

Antibiotika dikenal sebagai agen antimikroba, adalah obat yang melawan infeksi yang
disebabkan oleh bakteri. Pada tahun 1927, Alexander Fleming menemukan antibiotika
pertama yaitu penisilin. Setelah penggunaan antibiotika pertama di tahun 1940-an, mereka
mengubah perawatan medis dan secara dramatis mengurangi penyakit dan kematian dari
penyakit menular. Istilah "antibiotik" awalnya dikenal sebagai senyawa alami yang dihasilkan
oleh jamur atau mikroorganisme lain yang membunuh bakteri penyebab penyakit pada
manusia atau hewan. Beberapa antibiotika merupakan senyawa sintetis (tidak dihasilkan oleh
mikroorganisme) yang juga dapat membunuh atau menghambat pertumbuhan bakteri. Secara
teknis, istilah "agen antibakteri" mengacu pada kedua senyawa alami dan sintetis, akan tetapi
banyak orang menggunakan kata "antibiotika" untuk merujuk kepada keduanya. Meskipun
antibiotika memiliki banyak manfaat, tetapi penggunaannya telah berkontribusi tehadap
terjadinya resistensi (Katzung, 2007).

Berdasarkan toksisitas selektif ada antibakteri yang bersifat batkeriostatik dan

bakterisid. Kelompok yang pertama menghambat pertumbuhan atau perkembangan bakteri,
kelompok yang kedua bekerja mematikan bakteri. Bakterisid merupakan antibiotika yang
mempengaruhi pembentukan dinding sel atau permeabilitas membran, sedang bakteriostatik
adalah antibiotik yang bekerja pada sintesa protein. Antibakteri tertentu aktivitasnya dapat
meningkat dari bakteriostatik menjadi bakterisid bila kadar antibakterinya ditingkatkan
melebihi KHM (Setiabudy, 1995)

KHM atau Konsentrasi Hambat Minimum (MIC/Minimum Inhibitory Concentration)

adalah kadar minimal yang digunakan untuk menghambat pertumbuhan bakteri sedangkan
konsentrasi terendah dari antibiotik yang membunuh 99,9% inokulum bakteri disebut Kadar
Bunuh Minimal (KBM) (Brander, 1991).

Antibiotika dapat digolongkan berdasarkan aktivitas, cara kerja maupun struktur

kimianya. Berdasarkan aktivitasnya, antibiotika dibagi menjadi dua golongan besar, yaitu
(Ganiswara, 1995; Lllmann, Mohr, Hein & Bieger, 2005):
 a. Antibiotika kerja luas (broad spectrum), yaitu agen yang dapat menghambat
pertumbuhan dan mematikan bakteri gram positif maupun bakteri gramnegatif.
Golongan ini diharapkan dapat menghambat pertumbuhan dan mematikan sebagian
besar bakteri. Yang termasuk golongan ini adalah tetrasiklin dan derivatnya,
kloramfenikol, ampisilin, sefalosporin, carbapenem dan lain-lain.

b. Antibiotika kerja sempit (narrow spectrum) adalah golongan ini hanya aktif terhadap
beberapa bakteri saja. Yang termasuk golongan ini adalah penisilina, streptomisin,
neomisin, basitrasin.

Penggolongan antibiotika berdasarkan cara kerjanya pada bakteri adalah sebagai berikut
(Ganiswara, 1995; Lllmann, Mohr, Hein & Bieger, 2005):

a. Antibiotika yang bekerja dengan menghambat sintesis dinding sel bakteri, misalnya
penisilin, sefalosporin, carbapenem, basitrasin, vankomisin, sikloserin.

b. Antibiotika yang mengganggu keutuhan membran sel mikroba, yang termasuk

kelompok ini adalah polimiksin, golongan polien serta berbagai antibakteri
kemoterapetik.

c. Antibiotika yang bekerja dengan menghambat sintesa protein, yang termasuk

golongan ini adalah kloramfenikol, eritromisin, linkomisin, tetrasiklin dan antibiotika
golongan aminoglikosida.

d. Antibiotika yang bekerja melalui penghambatan sintesis asam nukleat bakteri, yang
termasuk golongan ini adalah asam nalidiksat, rifampisin, sulfonamid, trimetoprim.

e. Antibiotika yang menghambat metabolisme sel mikroba, yang termasuk dalam

kelompok ini adalah sulfonamid, trimetoprim, asam p-aminosalisilat (PAS) dan
sulfon.

Penggolongan antibiotika berdasarkan gugus kimianya sebagai berikut

(Katzung, 2007)

a. Senyawa Beta-laktam dan Penghambat Sintesis Dinding Sel Lainnya Mekanisme aksi
penisilin dan antibiotika yang mempunyai struktur mirip dengan -laktam adalah
menghambat pertumbuhan bakteri melalui pengaruhnya terhadap sintesis dinding sel.
 Dinding sel ini tidak ditemukan pada sel-sel tubuh manusia dan hewan, antara lain:
golongan penisilin, sefalosporin dan sefamisin serta betalaktam lainnya.

b. Kloramfenikol, Tetrasiklin, Makrolida, Clindamisin dan Streptogramin Golongan

agen ini berperan dalam penghambatan sintesis protein bakteri dengan cara mengikat
dan mengganggu ribosom, antara lain: kloramfenikol, tetrasiklin, makrolida,
klindamisin, streptogramin, oksazolidinon.

c. Aminoglikosida Golongan Aminoglikosida, antara lain: streptomisin, neomisin,

kanamisin, amikasin, gentamisin, tobramisin, sisomicin, etilmicin, dan lain-lain.

d. Sulfonamida, Trimethoprim, dan Quinolones Sulfonamida, aktivitas antibiotika secara

kompetitif menghambat sintesis dihidropteroat. Antibiotika golongan Sulfonamida,
antara lain Sulfasitin, sulfisoksazole, sulfamethizole, sulfadiazine, sulfamethoksazole,
sulfapiridin, sulfadoxine dan golongan pirimidin adalah trimethoprim. Trimethoprim
dan kombinasi trimetoprim-sulfametoksazol menghambat bakteri melalui jalur asam
dihidrofolat reduktase dan menghambat aktivitas reduktase asam dihidrofolik
protozoa, sehingga menghasilkan efek sinergis. Fluoroquinolon adalah quinolone
yang mempunyai mekanisme menghambat sintesis DNA bakteri pada topoisomerase
II (DNA girase) dan topoisomerase IV. Golongan obat ini adalah asam nalidiksat,
asam oksolinat, sinoksasin, siprofloksasin, levofloksasin, slinafloksasin, enoksasin,
gatifloksasin, lomefloksasin, moxifloksasin, norfloksasin, ofloksasin, sparfloksasin
dan trovafloksasin dan lain-lain.

III. Alat dan Bahan

Alat

- Inkubatator kocok

- Spektrofotometer

- Vortex

- Pinset

- Cawan petri
 - Tabung reaksi

- Jarum ose

- Pipet eppendorf

Bahan

- Mikroba uji: E. Coli

- Antibiotika: Tetrasiklin dan Ampisilin Na

- Medium: Air kaldu

- Kapas berlemak

- Alumunium foil

IV. Prosedur Percobaan

Persiapan praktikum oleh mahasiswa : satu hari sebelum praktikum

a. Sterilisasi alat dan media pertumbuhan bakteri

Disterilisasi alat dan media pertumbuhan bakteri dilakukan dengan cara panas lembab
menggunakan autuklaf pada suhu 121C selama 15 menit. Dan untuk alat-alat tertentu
seperti jarum ose dapat disterilkan dengan cara difiksasi pada nyal api bunsen.
b. Penyiapan media pertumbuhan bakteri
Nutrien agar (NA) dibuat dengan dilarutkan 23 gram serbuk NA dalam air suling
steril sebanyak 1000 ml. Nutrien borth (NB) dibuat dengan dilarutkan 8 gram serbuk
NB dalam air suling steril sebanyak 1000 ml. Kemudian masing-masing dipanaskan
hingga larut dalam labu erlenmeyer, disumbat dengan kapas berlemak dan ditutup
dengan alumunium foil lalu disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121C selama 15
menit.
c. Penyiapan bakteri uji
Tiap bakteri uji yaitu E. Coli dan S. Aureus dibiakan pada media pertumbuhan nutrien
agar (NA) miring dan inkubasi pada suhu 37 selama 24 jam.
d. Penyiapan perhitungan konsentrasi antibiotik
Disiapkan perhitungan untuk pengenceran tetrasiklin pada konsentrasi 50,100,200,
300, dan 400 g/ml. Tetrasiklin yang tersedia kapsul tetrasiklin yang mengandung
tetrasiklin 500 mg.(dilihat kelarutan tetrasiklin)

Hari praktikum
a. Pensuspensian bakteri
Pensuspensian bakteri uji dilakukan dengan mengumpulkan biakan yang terdapat
pada permukaan media agar miring ke dalam 50 ml larutan NaCl fisiologis atau
aquades atau medium cair (NB) steril. Kemudian diatur transmitan inokulum
bakteri dengan alat spektrofotometer pada panjang gelombang 530 nm, sebesar
25% dengan penambahan medium cair.
b. Pembuatan larutan antibiotika
Disiapkan antibiotika tetrasiklin dengan konsentrasi 50,100,200,300, dan 400
/ml.

Penentuan bekterisid-bakteriostatik suatu antibiotika pada konsentrasi tertentu

1. Disiapkan air kaldu dalam 5 tabung reaksi (Tb1u s.d Tb5u) masing-masing sebanyak
7,5 ml. Ke dalam Tb1u s.d Tb5u ditambahakan suspensi bakteri sebanyak 3 tetes (0,15
ml).
2. Didinkubasi semua tabung pada inkubator kocok pada 37C selama 30 menit (t1/2 jam)
3. Setelah 30 menit, diukur A pada Tb1u (t0)
4. Pada 4 tabung lainnya (Tb2u s.d Tb5u) ditambahkan 0,5 ml antibiotik dengan satu
konsentrasi tertentu. Setelah penambahan antibiotika, Tb2u s.d Tb5u, diinkubasi.
5. Selanjutnya diukur nilai A tiap 30 menit, sbb :
6. Setelah 30 menit, diukur A pada Tb2u (t 1 jam). Tb3u s.d Tb5u terus diinkubasi.
7. Setelah 30 menit, diukur A pada Tb3u (t1 jam). Tb4u s.d Tb5u terus diinkubasi.
8. Setelah 30 menit, diukur A pada Tb5u (t2 jam). terus diinkubasi.
9. Setelah 30 menit, diukur A pada Tb5u (t2 jam).
V. Data Pengamatan

Perhitungan pengenceran Amipisilin Na 300 g/ml

1. 1 = 2. 2

1. 400g/ml= 10 . 300 g/ml

V1=7,5 ml

Pertumbuhan bakteri pada waktu pengukuran tiap 30 menit dengan pemberian

antibiotika Ampisilin Na

KELOMPOK ABSORBAN

T1 T2 T3 T4 T5

Kelompok 1 0,619 0,656 0,527 0,556 0,441

(Kontrol)

Kelompok 2 (Ampisilin 0,305 0,329 0,376 0,463 0,361

50 g/ml)

Kelompok 3 0,358 0,298 0,277 0,425 0,239

(Ampisilin 100 g/ml)

Kelompok 4 0,548 0,395 0,397 0,397 0,410

(Ampisilin 200 g/ml)

Kelompok 5 0,490 0,463 0,589 0,282 0,328

(Ampisilin 300 g/ml)

Kelompok 6 0,547 0,361 0,440 0,477 0,437

(Ampisilin 400 g/ml)

Kelompok 7 0,483 0,572 0,477 0,431 0,462

 (Ampisilin 25 g/ml)

Grafik
Pertumbuhan Bakteri Normal
0
t1 t2 t3 t4 t5
-0.05

-0.1

-0.15

-0.2

-0.25

-0.3

-0.35

-0.4

Kontrol

Grafik
Pertumbuhan Bakteri di Pengaruhi Oleh
Ampisilin Na
0
t1 t2 t3 t4 t5
-0.1

-0.2

-0.3

-0.4

-0.5

-0.6

-0.7

Kelompok 2 Kelompok 3 Kelompok 4

Kelompok 5 Kelompok 6 Kelompok 7
 Pertumbuhan bakteri pada waktu pengukuran tiap 30 menit dengan pemberian
antibiotika Tetrasiklin HCl

KELOMPOK ABSORBAN

T1 T2 T3 T4 T5

Kelompok 1 0,617 0,515 0,515 0,560 0,519

(Kontrol)

Kelompok 2 0,372 0,389 0,279 0,285 0,268

(Tetrasiklin 50 g/ml)

Kelompok 3 0,398 0,490 0,501 0,476 0,480

(Tetrasiklin 100 g/ml)

Kelompok 4 0,576 0,521 0,504 0,524 0,507

(Tetrasiklin200 g/ml)

Kelompok 5 0,348 0,314 0,342 0,300 0,304

(Tetrasiklin 300 g/ml)

Kelompok 6 0,536 0,486 0,481 0,506 0,517

(Tetrasiklin 400 g/ml)

Kelompok 7 0,509 0,302 0,325 0,290 0,317

(Tetrasiklin 25 g/ml)
 Grafik
Pertumbuhan Bakteri Normal
0
t1 t2 t3 t4 t5
-0.05

-0.1

-0.15

-0.2

-0.25

-0.3

-0.35

Kontrol

Grafik
Pertumbuhan Bakteri di Pengaruhi Oleh
Tetrasiklin HCl
0
t1 t2 t3 t4 t5
-0.1

-0.2

-0.3

-0.4

-0.5

-0.6

-0.7

Kelompok 2 Kelompok 3 Kelompok 4

Kelompok 5 Kelompok 6 Kelompok 7

VI. Pembahasan
Suatu antibiotika memiliki tipe kerja yang berbeda satu sama lainnya, tergantung dari
mekanisme kerja antibiotika tersebut terhadap bakteri target. Antibiotika dapat dibedakan
berdasarkan tipe kerjanya yaitu bakterisid dan bakteriostatik. Suatu antibiotika apakah bertipe
bakterisid atau bakteriostatik dapat dilihat berdasarkan mekanisme kerjanya atau dapat pula
karena dosisnya.
Dalam percobaan kali ini dilakukan penentuan cara kerja antibiotika yaitu penetapan
sifat bakterid - bakteriostatik dengan menggunakan metode turbidimetri. Pada metode
turbidimetri dilakukan pengukuran kekeruhan kultur cair bakteri. Kekeruhan diukur dengan
alat spektrofotometer pada panjang gelombang 530 nm. Menurut Volk (1993), pada metode
turbidimetri pertumbuhan bakteri dapat ditentukan dari perubahan yang terjadi sebelum dan
setelah inkubasi, yang dilakukan dengan mengukur serapan secara spektrofotometer.
Pertumbuhan bakteri ditunjukkan dengan peningkatan jumlah sel bakteri, yang
mengakibatkan meningkatnya kekeruhan. Kekeruhan yang terjadi berbanding lurus dengan
serapan.

Pada penentuan sifat bakteriostatik dan bakterisid dengan metode turbidimetri yang
dilakukan pada percobaan digunakan Ampisilin dan Tetrasiklin sebagai antibiotik yang diuji.

Ampisilin merupakan derivate penisilin yang merupakan kelompok antibiotic laktam

yang memiliki spektrum antimikroba yang luas. Ampisilin efektif terhadap mikroba Gram
positif dan Gram negative dan merupakan salah satu antibiotika jenis bakterisid. Menurut
Wattimena (1987), mekanisme kerja ampisilin yaitu menghambat sintesis dinding sel bakteri
dengan cara menghambat pembentukan mukopeptida, karena sintesis dinding sel terganggu
maka bakteri tersebut tidak mampu mengatasi perbedaan tekanan osmosa di luar dan di
dalam sel yang mengakibatkan bakteri mati.

Tetrasiklin merupakan antibiotik berspektrum luas yang memiliki kerja bakteriostatik

dengan menghambat sintesis protein, menghambat pengikatan aminoasil tRNA pada akseptor
ribosom 30 S. Senyawa ini bersifat bakteriostatik terhadap berbagai bakteri Gram positif dan
Gram negatif, termasuk anaerob.

Pada percobaan dilakukan penentuan dengan metode turbidimetri, bakteri dibiakkan

dalam medium Nutrient Broth kemudian ke dalamnya ditambahkan sejumlah antibiotik yang
akan ditentukan sifatnya. Penggunaan media berupa air kaldu atau Nutrient Broth ialah agar
dapat diukur kekeruhannya. Bakteri yang digunakan dalam praktikum kali ini adalah
Escherichia coli. Penggunaan E. coli sebagai bakteri yang diujikan ialah karena E. coli
merupakan salah satu bakteri gram negatf yang paling banyak berhubungan dengan manusia
di lingkungan.
 Pertumbuhan bakteri dalam media berisi antibiotik diamati dengan mengukur
absorbansi cairan (berisi bakteri, medium dan larutan antibiotik) setelah sebelumnya
diinkubasikan. Besarnya absorbansi menyatakan pertumbuhan bakteri pada medium. Makin
besar absorbansi maka makin banyak pula bakteri yang terdapat dalam medium. Setelah
ditambahkan antibiotik pada tabung berisi bakteri dalam medium kemudian diamati
pertumbuhan dan hambatan pertumbuhan bakteri oleh adanya antibiotik. Hasil yang
didapatkan berupa absorbansi kemudian diubah menjadi bentuk logaritmanya dan diplotkan
terhadap waktu. Hasil tersebut akan berupa kurva, dan dari kurva tersebut dapat ditentukan
sifat dari antibiotik uji.

Dari kurva absorban terhadap waktu yang diperoleh dari berbagai konsentrasi antibiotik
ampisilin, dapat disimpulkan berdasarkan mekanisme kerja ampisilin yaitu sebagai
bakterisid, dan kurva normal fase pertumbuhan normal bakteri, bahwa konsentrasi ampisilin
25 g/ml sudah menunjukan cara kerja bakterisid nya dimana pertumbuhan bakteri menurun
pada t2 lalu terus menurun yang menunjukkan fase kematian. Begitu pula pada konsentrasi
400 g/ml dimana pertumbuhan bakteri pada t3 terus menurun. Namun jika dibandingkan
dengan kontrol pertumbuhan normal bakteri percobaan, tidak ada satupun dari berbagai
konsentrasi yang sesuai dengan mekanisme kerja bakterisid. Adapun pada konsentrasi lain,
bentuk kurva cenderung fluktuatif, lalu pertumbuhan yang bahkan meningkat dan tidak
menunjukannya cara kerja bakterisid terhadap siklus hidup sel yaitu fase pertumbuhan-
stationer-mati. Hal ini dapat dikarenakan terukurnya sel bakteri yang mati tetapi tidak lisis,
bakteri yang diujikan sudah lewat masa pertumbuhannya, karena inkubasi bakteri yang terlalu
lama.
Sedangkan pada antibiotik tetrasiklin, dapat disimpulkan berdasarkan mekanisme kerja
tetrasiklin yaitu sebagai bakteristatik, bahwa konsentrasi tetrasiklin 200 g/ml, 300 g/ml,
600 g/ml, dan 25 g/ml sudah menunjukan cara kerja bakteriostatik nya dimana
pertumbuhan bakteri menurun pada t2 lalu selanjutnya bentuk kurva cenderung datar yang
menunjukkan fase tidak aktif bakteri. Adapun pada konsentrasi lain, bentuk kurva cenderung
naik atau pertumbuhan yang bahkan meningkat. Hal ini dapat dikarenakan pengerjaan yang
kurang aseptis dan pengukuran volume suspensi bakteri maupun antibiotik yang kurang tepat.
Selain itu pada saat pengukuran absorbansi pada spektrofotometer, kufet yang digunakan
bersama bergantian hanya dibilas dengan aquades yang tersedia, sehingga kemungkinan
besar ada bakteri yang tertinggal pada kufet dan ikut terukur pada pengukuran absorbansi
selanjutnya. Menurut literatur, tetrasiklin yang merupakan bakteriostatik dapat menjadi
 bakterisid saat konsentrasinya ditingkatkan, namun kurva konsentrasi tertinggi pada
percobaan yaitu 600 g/ml tidak menunjukkan aktifitas bakterisid yang signifikan, dilihat
dari kurva yang cenderung datar.

VII. Kesimpulan

1. Penentuan cara kerja antibiotika bakterisid dan bakteriostatik dapat dilakukan dengan
metode turbidimetri dimana dilakukan pengukuran kekeruhan dengan alat spektrofotometer
dimana absorbansi tinggi menunjukan banyaknya pertumbuhan bakteri.

2. Perubahan konsentrasi dapat mempengaruhi sifat bakterisid dan bakteriostatik antibiotik,

dimana suatu antibiotik bakteriostatik dapat menjadi bakterisid ketika konsentrasi
ditingkatkan, contohnya seperti tetrasiklin.
 Daftar Pustaka

Volk Wesley A dan Wheeler Margaret F. 1993. Mikrobiologi Dasar. Jakarta: Erlangga.

Wattimena, G. A. 1987. Diktat zat Pengatur Tumbuh Tanaman. Bogor: Laboratorium

Kultur Jaringan Tanaman PAU Bioteknologi IPB-Direktorat Jenderal Pendidikan
Tinggi Departemen Pendidikan dan Kebudayaan.

Katzung, B. G. 2007. Basic & Clinical Pharmacology, Tenth Edition. United States : Lange
Medical Publications.
Setiabudy, 1995, Antimikroba Golongan Tetrasiklin Dan Kloramfenikol Dalam Farmakologi
Dan Terapi Edisi IV, Bagian Farmakologi dan Terapi FKUI:Jakarta.
Brander, 1991, Veterinary Applied Pharmacology and Therapeutics, 5th Ed, ELBS,
Ballere Tindall.