VIROLOGI

IPH 223
Pertemuan ke- 11

Titrasi atau Penghitungan

Fakultas Kedokteran Hewan

INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2023
 Tujuan Pembelajaran
Setelah menyelesaikan topik ini mahasiswa
dapat menjelaskan berbagai metode titrasi
virus
 Penghitungan Virus dapat dilakukan :
• Secara fisika : menggunakan Mikroskop
Elektron
• Secara kimia : HA Test
• Secara biologis : efek yg ditimbulkan pd sel at
jaringan host yg peka. ID50% at LD50%
 Titrasi virus :
• Menghitung jumlah virus secara quantitatif
(Titrasi)
• Titrasi dengan uji HA :
1. Virus yang mampu mengaglutinasi sel darah
merah
2. Virus yang sudah mati maupun masih hidup
Haemagglutination (HA)

virus No virus
Useful for influenza
and togaviruses

5
 Haemagglutination
Dilution
No
2 4 8 16 32 64 128 256 512 1024 virus

titre

6
 Titrasi virus
• Uji infektivitas: menghitungvirus hidup.
• Uji ini dapat menggunakan kultur jaringan
(Tissue culture/ TC), telur tertunas atau hewan
percobaan.
• Ada dua tipe uji infektivitas yang digunakan
untuk menghitung /mentitrasi virus yaitu
secara quantal dan enumeratif ( disebut juga
quantitatif atau focal).
 Titrasi virus :
• Pada respon enumeratif yang dihitung adalah
jumlah partikel virus yang infeksius pada suatu
suspensi virus.
• Pada uji quantal : respon yang diamati adalah
respon positif atau negatif terhadap infeksi
virus, misalnya : inang yang diinfeksi (hewan
percobaan/TET) mati atau tidak, pada TC
terbentuk CPE atau tidak, adan tidaknya tanda-
tanda infeksi (hewan percobaan/TET/TC).
 Respon Enumeratif
• Chorioallantois membran / CAM dari TET atau
kultur jaringan , titer virus pada respon ini
menggunakan satuan pock-forming unit/PFU
(pada CAM) atau plaque- forming unit/PFU
atau focus-forming unit/FFU (pada TC) per
mililiter suspensi
Virus quantitation
(plaques)

plaques
Count plaques
(plaque forming unit/ml)
PFU /ml

10
Reagen (ml) Tabung

1 2 3 4 5

NaCl fis. 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9

Antigen 0,1 0,1 0,1 0,1 01

(ditransfer)

Pengenceran 10 –1 10 –2 10 –3 10 –4 10 –5
Contoh

Media yang digunakan : TET rute

Pengenceran virus yang : 10 –5
digunakan)
Volume inokulasi : 0,1 ml
Jumlah pock yang terbentuk : 13, 10, 16
pada masing-masing TET
Rataan jumlah pock : 13 + 10 + 16 = 13
3
Titer virus : 13 x 10 5 PFU/0,1
ml = 1,3 X10 7
PFU/ml
Media yang digunakan : Kultur jaringan
Pengenceran virus yang : 10 –5
digunakan)
Volume inokulasi : 0,1 ml
Jumlah plaque yang terbentuk : 145, 138, 141
pada masing-masing cawan
Rataan jumlah plaque : 145 + 138 + 141 = 141
3
Titer virus : 141 x 10 5 PFU/0,1 ml
=
1,4 X10 8 PFU/ml
 Virus quantitation (EID50/LD 50)
• Menggunakan telur tertunas sebagai media uji
• Menghitung jumlah virus hidup yang dapat
menginfeksi embrio (EID 50)
• Menghitung jumlah virus hidup yang dapat
menginfeksi embrio (LD 50)
 Infective dan Lethal Dose
• Tergantung dari host yang digunakan derajat
infeksi atau kematianpun berbeda: EID
(Embryo Inf.Dose) ; CID (Chicken Inf.Dose);
Chicken Lethal Dose (CLD); Tissue Culture
Inf.Dose (TCID) dan sebagainya
 Sistem Quantal

• virus diencerkan secara seri kemudian

diinokulasikan pada media yang kita pilih,
tergantung jenis virusnya.
• Setelah masa inkubasi setiap pengenceran
yang diinokulasikan dievaluasi hasilnya masing-
masing yang menunjukan respon positif dan
negatif akibat infeksi virus.
 Sistem Quantal
• Proporsi dari inang yang positif dicatat dan
digunakan untuk menghitung konsentrasi atau
titer dari suspensi virus.
• Suatu unit infektivitas digunakan untuk
mengekspresikan hasil dari respon quantal ini
adalah nilai rataan dosis infektif (ID 50) yang
berarti menunjukan sejumlah suspensi virus
(agen) yang dapat menginfeksi 50% populasi
inang yang digunakan untuk uji.
 Sistem Quantal
• Bila efek yang dinilai adalah kematian
(lethality ) maka unit yang digunakan adalah
LD 50 yang berarti berarti menunjukan
sejumlah suspensi virus (agen) yang dapat
mematikan 50% populasi inang yang
digunakan untuk uji.
• Titer virus ditunjukan dengan jumlah unit
infeksi per mililiter suspensi virus .
 Sistem Quantal
• ID 50 merupakan prosedur yang direkomendasikan untuk
mengukur infektivitas agen.
• Satuan unit infeksi tergantung dari media yang digunakan
misalnya :
Media Satuan
• Embrio (TET) EID 50
• Kultur jaringan (TC) TCID 50
• Hewan / mencit (mouse) MID 50
 Penghitungan titer
• Penghitungan titer virus dilakukan dengan
menghitung endpoint dari pengenceran virus
yang menyebabkan 50% populasi (jumlah
telur /n) yang digunakan.
• Endpoin tidak dapat diukur hanya
berdasarkan data secara langsung, sehingga
digunakan penghitungan secara matematika.
• Ada beberapa cara penghitungan matematika
antara lain metode Reed and Muench dan
metode Spearmen – Kärber.
 Respon Akumulasi
Pengecer Percent
Positif Negatif Postif Negatif Ratio

-7 4 0 10 0 10/10 100

-8 4 1 6 1 6/7 86
50 x
-9 2 3 2 4 2/6 33 Y

-10 0 5 0 9 0/9 0

Keterangan :

Jarak X (% diatas 50%) – (50%)

PD = =
Jarak Y (% diatas 50%) – (% tepat dibawah 50%)

86 - 50 36
= = = 0.7
86 - 33 53
 Penghitungan titer
Sehingga 50% endpoin dapat dihitung dengan rumus :

log dari 50% endpoint = log peng. diatas 50% - (PDx log faktor
pengenceran )
= -8 – (0.7 x 1.0)
= = -8.7
Dengan demikian 50% endpoint adalah pada pengenceran 10–8,7

Sehingga titer virusnya adalah 108,7/0,1 ml atau 109,7 /ml

Cara ini yang digunakan untuk menghitung titer virus pada

vaksin.
Terima kasih atas perhatiannya
dan Sukses selalu