Laporan Praktikum Enzimologi PJP Dr.

Popi Asri Kurniatin

Pertemuan ke 2 Asisten Mustika Luthfia
Tanggal 27 Agustus 2021 Nama Rahmah Fauziah
Waktu 08-00-11.00 NIM/Kel G84190034/K6

UJI SKRINING UNTUK ENZIM SELULASE

PENDAHULUAN

Enzim selulase atau enzim yang dikenal dengan nama sistematik β–1.4 glukan–
4–glukano hidrolase adalah enzim yang dapat menghidrolisis selulosa dengan memutus
ikatan glikosidik β–1.4 dalam selulosa, selodektrin, selobiosa, dan turunan selulosa
lainnya menjadi gula sederhana atau glukosa. Sistem pemecahan selulosa menjadi
glukosa terdiri atas tiga jenis enzim selulase yaitu endo–β–1.4–glukanase, ekso–β–1.4–
glukanase, dan β–glukosidase (Aryani 2012). Enzim selulase dapat diklasifikasikan
berdasarkan spesifisitas terhadap substrat, mekanisme reaksi atau kemiripan
strukturnya (Sharma et al. 2016).
Enzim selulase dapat diproduksi oleh tumbuhan dan berbagai mikroorganisme
termasuk Actinomycetes, bakteri, dan jamur. Enzim ini juga dilaporkan dapat
diproduksi oleh beberapa hewan seperti sapi, rayap, dan udang karang (Nababan et al.
2019). Secara enzimatis, proses mendegradasi selulosa menjadi glukosa melibatkan
kompleks enzim selulosa spesifik, yaitu endo–β–1.4–glukanase, ekso–β–1.4–
glukanase, dan β–glukosidase. Menurut Purkan et al. (2015), endo-1,4- β-glukanase
bekerja dengan memotong secara acak pada sisi internal dari rantai selulosa dan
menghasilkan oligosakarida dengan panjang rantai yang bervariasi, sehingga
dihasilkan ujung rantai baru. Ekso-1,4-β-glukanase memotong ujung rantai selulosa
menghasilkan molekul selobiosa, sedangkan β-1.4-glukosidase memotong molekul
selobiosa menjadi dua molekul glukosa.
Kompleks selulase digunakan secara komersial dalam pengolahan kopi.
Selulase digunakan secara luas dalam industri tekstil, deterjen, pulp, kertas, dan
terkadang digunakan pula dalam industri farmasi. Enzim selulase juga dapat digunakan
dalam fermentasi biomassa menjadi biofuel, walaupun proses ini sifatnya masih
eksperimental. Selain dalam bidang pangan dan industri, pemanfaatan enzim selulase
dari bakteri dapat memberikan solusi dalam masalah pencemaran yakni mengurangi
jumlah limbah selulosa seperti timbunan daun di area pembuangan akhir, limbah
pertanian, rumput laut di tepi pantai serta dapat menjadi nilai tambah terhadap
pemanfaatan limbah menjadi olahan pupuk organik (Murtiyaningsih dan Hazmi 2017).
Uji kualitatif enzim adalah uji yang dilakukan untuk menentukan ada tidaknya
enzim target yang dihasilkan oleh sumber tertentu (Fadhli et al. 2019). Metode
kualitatif dalam pengujian ini sangat beragam bergantung jenis enzim, lokasi enzim,
substrat dan reaksinya. Uji kualitatif penting untuk dilakukan untuk memastikan enzim
yang telah diperoleh sesuai dengan enzim yang ingin digunakan untuk pengujian lebih
lanjut seperti uji kuantitatif. Uji kuantitatif adalah uji yang dilakukan dengan
menghitung atau mengukur enzim menggunakan alat-alat yang ada di laboratorium,
seperti mengukur absorbansi menggunakan spektrofotometer. Uji kuantitatif
memerlukan perlakuan yang lebih intensif dibanding uji kualitatif dan membutuhkan
ketelitian yang tinggi karena jika terjadi kesalahan akan berpengaruh kepada data hasil
penelitian (Saidah 2014). Praktikum ini bertujuan agar praktikan terampil melakukan
pengujian kualitatif terhadap enzim.

METODE

Alat dan bahan yang digunakan berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh
Murtiyaningsih dan Hazmi (2017) mengenai isolasi dan uji aktivitas enzim selulase,
antara lain spektrofotometer, sentrifuge, gelas ukur, cuvette, vortex, mikropipet, pH
meter, shaker, laminar airflow cabinet, autoklaf, neraca analitik, waterbath, jarum ose,
erlenmeyer, mikrotip, cawan petri, kapas, tabung reaksi, kelereng, batang pengaduk,
botol, lampu spiritus. Bahan-bahan yang digunakan adalah sampel tanah sampah,
media CMC (Carboxymethyl Cellulose) 1%, garam fisiologis, akuades, indikator
congo red 1%, pereaksi DNS (3,5- dinitrosaliclic acid), alkohol 70%, spiritus, larutan
standar glukosa, larutan standar BSA untuk pengukuran kadar protein dan larutan
Bradford.
Berdasarkan metode yang dilakukan oleh Murtiyaningsih dan Hazmi (2017),
prosedur pengujian skrining enzim selulase diawali dengan mengisolasi sebanyak 10
gram sampel tanah yang kemudian dilarutkan dalam 90 mL larutan garam fisiologis
(NaCl 0,85%) lalu divortex sehingga diperoleh pengenceran 10-1. Pengenceran terus
dilakukan secara berseri sampai pengenceran 10-5 dengan tujuan memperkecil atau
mengurangi jumlah mikroba yang tersuspensi dalam cairan. Setelah itu, isolat bakteri
ditambahkan pada medium CMC (Carboxymethyl Cellulose) 1%, lalu diinkubasi pada
suhu 37oC selama 48 jam. Indikator congo red 0,1% ditambahkan pada kultur dan
didiamkan selama 15 menit. Larutan kemudian dibuang dan dibilas dengan NaCl 0,2
M selama 15 menit sebanyak tiga kali. Selanjutnya, dilakukan inkubasi pada suhu 40oC
selama 48 jam untuk menyempurnakan pembentukan zona bening, kemudian diamati
zona bening yang terbentuk. Isolat bakteri yang mampu menguraikan CMC
ditunjukkan dengan terbentuknya zona bening di sekitar koloni, sedangkan bagian yang
tidak terhidirolisis akan berwarna gelap.

HASIL DAN DISKUSI

Pengujian enzim selulase pada uji kualitatif dapat menggunakan sel hidup berupa
bakteri selulolitik dari tanah sampah. Isolasi bakteri selulolitik dilakukan dengan
menggunakan media selektif Carboxy Methyl Cellulose 1% (CMC 1%) dengan metode
spread plate dan indikator congo red. Indikator congo red akan berikatan dengan
polisakarida yang memiliki ikatan beta-1,4 glikosidik yang jika dihidrolisis, ikatan
glikosidik tersebut akan putus dan menghasilkan zona bening yang menandakan
adanya aktivitas selulase. Pengujian enzim selulase pada uji kualitatif dapat
menggunakan sel hidup dan crude enzyme. Crude enzyme berarti ekstrak berupa
protein yang mengandung enzim, sedangkan sel hidup berarti bahwa enzim berasal dari
sel itu sendiri. Masing-masing mempunyai kelebihan dan kekurangan.
Kelebihan sel hidup pada uji kualitatif dengan menggunakan metode skrining
enzim pada sel hidup agar plate yaitu lebih sederhana dan mudah dalam
penggunaannya, relatif murah karena penggunaan sel hidup yang mudah tumbuh dan
berkembang biak, sehingga dapat memperbanyak mikroorganisme terlebih dahulu,
kemudian menguji keberadaan enzim. Selain itu, dapat mengatur proses penyaringan
sehingga dapat memilih koloni yang mengekspresikan enzim aktif yang benar-benar
dapat tumbuh dalam media, sehingga sel yang tidak memproduksi enzim tidak perlu
digunakan. Kekurangan sel hidup pada uji kualitatif dengan metode skrining enzim
pada sel hidup agar plate yaitu harus menyesuaikan lingkungan hidup enzim yang
ingin diisolasi, kurangnya proses kloning, mudah terkontaminasi, dan enzim yang
dihasilkan sekitar zona bening terkadang tidak mendapatkan hasil yang bulat (Llano
dan Tan 2018). Crude enzyme memiliki kekurangan yaitu harus dipisahkan terlebih
dahulu antara enzim yang diinginkan dengan enzim lain menggunakan sentrifus.
Kelebihan crude enzyme yaitu dapat dengan langsung dilihat keberadaanya.
Sebanyak 4 isolat bakteri yang memiliki morfologi berbeda telah berhasil
diisolasi dari tanah sampah. Keempat isolat tersebut tumbuh pada media CMC dengan
konsentrasi pengenceran 10-3 berupa TBUD (terlalu banyak untuk dihitung), sedangkan
untuk pengenceran 10-4 dan 10-5 didapatkan berupa koloni tunggal. Bakteri yang
berhasil diisolasi dari tanah tersebut diduga bakteri selulolitik karena mampu tumbuh
pada media CMC yang merupakan media selektif bagi bakteri pendegradasi selulosa.
Analisis yang dilakukan pada enzim selulase yaitu dengan menggunakan
spektrofotometer yang digunakan untuk menentukan kurva pertumbuhan dengan
membuat plot antara waktu. Pembuatan kurva standar glukosa dilakukan dengan
membuat larutan stok glukosa, 1 gram (1000 mg) glukosa dilarutkan dalam 100 ml
H2O steril. Sebanyak 0.1 mL larutan glukosa dengan konsentrasi 1 mg/ml ditambahkan
dengan 1.9 mL H2O, kemudian ditambahkan dengan 2 ml DNS (3,5-Dinitro salicylic
acid) dan dihomogenkan dengan vortex. Campuran diinkubasi pada suhu 100oC selama
15 menit. Setelah dingin, kemudian dilakukan pengukuran absorbansi menggunakan
spektrofotometer pada panjang gelompang 540 nm. Menurut saya, metode skrining
untuk mencari sumber enzim baru yang paling cepat adalah metode agar plate, karena
untuk mencari sumber enzim baru kita biasanya memakai sel hidup. Metode agar plate
lebih sederhana dan mudah dalam penggunaannya, sel hidup yang mudah tumbuh dan
berkembang biak, sehingga dapat memperbanyak mikroorganisme terlebih dahulu.

SIMPULAN

Pengujian enzim selulase secara kualitatif dapat menggunakan sel hidup ataupun
crude enzyme. Pengujian kualitatif bakteri selulolitik dari tanah sampah menggunakan
metode spread plate yang ditambahkan congo red menghasilkan aktivitas enzim
selulase. Analisis instrumen yang dilakukan pada enzim selulase yaitu dengan
menggunakan spektrofotometer yang digunakan untuk menentukan kurva
pertumbuhan dengan membuat plot antara waktu.

DAFTAR PUSTAKA

Aryani SW. 2012. Isolasi dan karakterisasi Ekstrak Kasar Enzim Selulase dari Kapang
Selulolitik (Mucor sp. B2) [Disertasi]. Banyuwangi (ID): Universitas Airlangga.
Fadhli H, Kusdiyantini E, Nurhayati. 2019. Karakterisasi morfologi, biokimia, dan uji
enzimatis isolat khamir buah apel (Malus domestika) yang berpotensi
menghasilkan bioetanol. Biologi Tropika. 2(2):62-73.
Llano LE, Tan C. 2018. High-throughput screening of biomolecules using cell-free
gene expression systems. Synthetic Biology. 3(1): 1-13.
Murtiyaningsih H, Hazmi M. 2017. Isolasi dan uji aktivitas enzim selulase pada bakteri
selulolitik asal tanah sampah. Agritrop. 15(2): 293-308.
Nababan M, Gunam WBI, Wijaya MMI. 2019. Produksi enzim selulase kasar dari
bakteri selulolitik. Jurnal Rekayasa dan Manajemen Agroindustri. 7(2): 190-199.
Purkan, Purnama HD, Sumarsih S. 2015. Produksi enzim selulase dari aspergillus niger
menggunakan sekam padi dan ampas tebu sebagai induser. Jurnal ILMU DASAR.
16(2): 95-102.
Saidah AN. 2014. Isolasi bakteri proteolitik termofilik dari sumber air panas pacet
mojokerto dan pengujian aktivitis enzim protease. Biologi. 1(1):1-10.
Sharma A, Tewari R, Rana SS, Soni R, Soni KS. 2016. Cellulases: classification,
methods of determination and industrial applications. Appl Biochem Biotechnol.
179(1): 1346–1380.
Utami U, istinah D, Barizi A. 2020. Karakterisasi enzim amilase dari bakteri bacillus
megaterium pada variasi suhu, pH, dan konsentrasi substrat. Riset Biologi dan
Aplikasinya. 2(1):21-25.