HUMAN

GLUCAGON
 R Rahmah N. / 10714005
C Christian / 10714007
Kelompok
H Hisana H. / 10714015
A A. Bayu S. / 10714023 7
Y Yelian A. / 10714041
 F Felicia P.L. / 10714058
D Dwi Wahyu R. / 10714061 Kelompok
R Rifa Fitriani / 10714078
7
L Laisa N.R. / 10714023
 SIFAT &
KARAKTERISTIK
1
glukagon adalah polipeptida yang mengandung 29
residu asam amino
 Karakteristik
• Serbuk putih sampai hampir putih.
2
Deskripsi • Tidak larut dalam air, namun larut pada pH kurang dari 3 atau lebih dari 9.5

• C153H225N43O49S
RM

• 3.483
BM

• Eschericia coli
Host
3 Protein
terdenaturasi
Protein
terdeamidasi

Bentuk Protein
modifikasi teragregasi
Produk
4
 Eli Lilly and
Company
Produsen 5

Injeksi
T = 20°- 25°C
Rekonstitusi
HIPOGLIKEMIA
 Hipoglikemia
1 • Hipoglikemia  Kadar gula dalam darah menurun
• Kerja tubuh normal:
Kadar glikosa menurun terjadi pelepasan hormon neuroendokrin (hormon
antiinsulin) stimulasi sistem saraf otonomgejala neurogenik dan
neuroglikopenik
• Salah satu hormon antiinsulin adalah glukagon, berfungsi untuk meningkatkan
produksi glukosa endogen dengan meningkatkan proses glikoneogenesis hepatik
dan glukoneogenesis (Briscoe dan Davis, 2006).
• Kadar glukosa kurang muncul gejala hipoglikemia
• Gejala hipoglikemia
 Autonomic symptoms : kadar glukosa yang menurun
 Neuroglycopenic symptoms : kekurangan glukosa neuronal pada otak
(Briscoe dan Davis, 2006).
Penggunaan Human Glucagon
 Sediaan berupa injeksi
2
 Konsentrasi : <1 mg/mL atau 1 unit/mL
 Sudah direkonstitusi harus digunakan dengan segera.
 Sediaan harus jernihdan memiliki konsistensi seperti air.
 Pasien dengan BB>20 kg
Rute : injeksi subkutan, intramuscular dan intravena
Dosis : 0,5 mg atau dosisi yang setara dengan 20 to 30 μg/kg.
 Penggunaan lain : alat diagnosis pada pemeriksaan radiologi lambung,
duodenium, usus kecil, dan kolon saat motilitas intestinal dikurangi.
 EFEK
FARMAKOLOGI
 Glukagon merupakan antihipoglikemia yang dapat meningkatkan
konsentrasi darah dengan menstimulasi glikogenolisis hati.

 Beberapa efek metabolik yang dihasilkan oleh glukagon dalam

berbagai jaringan sama dengan efineprin.

 Sekresi endogen glukagon akan terstimulasi ketika konsentrasi

glukosa rendah atau ketika serum insulin meningkat.
Glukagon menstimulasi pembentukan adenilat siklase, yang
dikatalisis dengan perubahan ATP ke cAMP terutama pada liver
dan jaringan adiposa. Pembentukan cAMP menginisiasi
serangkaian reaksi intraselular termasuk aktivasi fosforilasi, yang
mendorong terjadinya degradasi glikogen menjadi glukosa
 Glukagon memiliki inotropik positif dan efek kronotropik.
 Pada pemberian intravena kepada hewan yang dianastesi,
glukagon menyebabkan penurunan tekanan darah.
 Glukagon juga menunjukkan aktivitas penurunan konsentrasi
nitrogen amino plasma
 Peningkatan ekskresi elektrolit pada ginjal
 Penurunan sintesis protein dan lemak
 Peningkatan kecepatan metabolisme
 Serta setelah pemberian jangka panjang dapat menghasilkan
efek diabetes yang bertahan selama beberapa hari.
 Sistem
Produksi
Karakterisasi Karakterisasi

Ekspresi Seleksi

Isolasi Isolasi

Persiapan DNA & Vektor, Ligasi,

Ekspresi Transformasi

Ekspresi Deteksi

Purifikasi Pemurnian
EKSPRESI
Deteksi
Seleksi
Transformasi
Ligasi
Persiapan
DNA sisipan
dan vektor
 Persiapan DNA dan Vektor
Persiapan DNA

Reverse
transcriptase PCR
mRNA
cDNA
matang

Penambahan
Sal I Not I situs restriksi

Sal I Not I Sal I Not I

Persiapan Vektor

• Vektor Ekspresi
• MCS dipotong
dengan enzim
restriksi Sal I
dan Not I
 DNA sisipan
L +
vektor

I
G Enzim ligase

A
Sal I
S Not I

I Vektor Rekombinan
T
R
A
N
S
F
O
R Sel inang
M
A +
S Sel inang : Escherichia coli
Metode : Elektroporasi
I Vektor Rekombinan
S Resistensi antibiotik ampisilin
E Mengandung
plasmid
tumbuh
L rekombinan

E
K Media
S mengandung tidak
tumbuh
antibiotik
I ampisilin
D
E
T
E
K
S
I
EKSPRESI

REGULASI

ILUSTRASI
REGULASI

Berikatan dengan
IPTG Inducer represor

Tidak dapat berikatan Perubahan konformasi

dengan operator represor
Ilustrasi Protein Hasil Ekspresi

N GST Glucagon C

Glucagon mengandung 29 asam amino  29 aa x 110 Da = 3,19 kDa

GST = 26,98 kDa
Bobot total = 3,19 kDa + 26,98 kDa = 30,17 kDa
 Dilakuka
Sel bakteri Sel bakteri
Sel E. coli n proses
dipisahkan dilisis Dilakukan Protein yang
dikultur refolding
dari dengan sentrifugasi terlarut
dengan untuk
pengotor cara fisik, untuk dilanjutkan
sistem membua
dan media kimia, diambil ke proses
continuous t protein
dengan cara maupun supernatan pemurnian
fermentation menjadi
sentrifugasi enzimatik
larut
 Dimurnikan dengan kromatografi afinitas Glutathione Sepharose 4
Fast Flow

 Hasil kromatografi didialisis semalaman, diliofilisasi, dan disimpan

pada suhu -20C

 Digunakan enzim enterokinase untuk memotong protein

 Dimurnikan kembali dengan Glutathione Sepharose 4 Fast Flow

 Didapatkan protein glukagon murni

SDS-PAGE
- Elektroforesis: teknik pemisahan berdasarkan migrasi dari partikel
bermuatan di bawah pengaruh medan listrik

- Digunakan untuk menentukan bobot molekul

- Digunakan metode reducing

- Diputus menggunakan senyawa β-mercaptoetanol

WESTERN BLOT ASSAY
- Digunakan metode Bradford
- Didasarkan pada ikatan yang proporsional antara protein
dan Comassie Blue
- Konsentrasi diukur dengan spektrofotometer UV-visible
- Glukagon dideteksi menggunakan antibodi poliklonal
anti-glucagon dan alkalin fosfatase
Protein Sequencing
- Digunakan metode MALDI-TOF
- Dibutuhkan sampel dalam bentuk matriks Kristal
- Terbuat dari senyawa pembentuk kristal, pelarut organik, dan
senyawa sumber ion
- Senyawa pembentuk kristal: asam α-siano-4-hidroksinamat
Pelarut organik: asetonitril
Senyawa sumber ion: asam trifluoroasetat
Aktivitas Biologi
 Mengukur tingkat glikemik sebelum dan sesudah
diberikan glucagon

 Digunakan protein pembanding glukagon komersial

Persyaratan Farmakope
untuk Human Glucagon
Persyaratan Farmakope Human glucagon
(British Pharmacopoeia 2009)
• Definisi • Susunan Asam amino
merupakan polipeptida
yang memiliki struktur (29 asam
amino) yang sama dengan
hormon yang diproduksi oleh sel
afla pada pankreas manusia.
Glukagon dapat meningkatkan
konsentrasi glukosa dalam darah,
dengan mendorong pemecahan Kesalahan urutan asam amino 
efikasi glukagon menurun
glikogen hati dengan cepat.
• Kadar • Produksi
Human glukagon diproduksi dengan
92,5-105 % (senyawa anhidrat)
metode yang berdasarkan teknologi
DNA rekombinan (rDNA).
<92,5 % : efikasi menurun
Protein dari sel inang : batas
>105 % : tingkat keamanan menurun
disetujui oleh instansi berwenang.

• Karakteristik DNA vektor dari sel inang : batas

disetujui oleh instansi berwenang.
Pemerian : serbuk putih atau hampir putih
Kelarutan : Prakis tidak larut dalam air dan
dalam kebanyakan pelarut organik. Larut
dalam asam mineral encer dan dalam
larutan encer basa hidroksida.
Identifikasi
• Peptide Mapping

Metode kromatografi cair menggunakan enzim α-kimotripsin

Kromatogram dibandingkan dengan kromatogram baku human glucagon

memastikan kebenaran urutan asam amino

Kesalahan urutan asam amino  efikasi glukagon menurun

• Absorbansi Spesifik

Absorbansi Spesifik (276 nm) : 21-25,

untuk verifikasi kuantitatif glukagon

• Deamidasi glukagon
tR glukagon : 10 menit
Metode kromatografi cair
tR terdeamidasi : 15-40 menit

Batas yang terdeamidasi : maksimal 0,5 %

deamidasi dianggap penting karena selain mengubah struktur, deamidasi dapat

menyebabkan perubahan fungsi, stabilitas, dan degradasi protein.
• Protein Terkait
tR glukagon : 20 menit
Metode kromatografi cair
tR carbamoylglukagon : 22 menit

Batas ketidakmurnian total : 2,5 %

Ketidakmurnian akan menurunkan efikasi serta keamanan glukagon

Kadar air : Maksimal 10% ditentukan pada 20 mg

Kadar air yang tinggi dapat menurunkan kestabilan glukagon

Endotoksin bakteri : Kurang dari 10 IU/mg

Keberadaan endotoksin perlu dibatasi karena dapat memicu reaksi inflamasi seperti demam.
Penyimpanan
Dalam wadah kedap udara, terlindung dari cahaya
dan pada temperatur kurang dari -150C.

Untuk menjaga kestabilan glukagon selama proses penyimpanan

 Persyaratan Farmakope /
Badan Regulasi Terkait Produk
1 Persyaratan Monografi Produk Menurut USP 32
• Deskripsi
Injeksi glukagon mengandung glukagon (C153H225N43O49S)
tidak kurang dari 80,0% dan tidak lebih dari 125,0% dari
jumlah yang tertera pada label.
• pH dan kejernihan larutan
• Endotoksin bakteri
• Uji sterilitas
• Uji rekonstitusi
• Persyaratan lain, seperti yang tertera pada bagian injeksi dan
labeling
Penetapan Kadar/Potensi Menurut USP 32
Persiapan mencit Isolasi sel hepatosit
Larutan uji, Larutan
standar, Larutan kontrol
negatif
2
Hepatosit mencit

Kontrol 12,5 25 50 100 200

negatif µU/m µU/m µU/m µU/m µU/m
L L L L L

Glucagon USP Standard

 Hasil dari penetapan potensi ini tidak boleh kurang dari 80,0% dan

Conts tidak lebih dari 125,0% dari jumlah yang tertera pada label. Hasil
analisis juga harus memenuhi syarat confidence interval pada P =
0,95 tidak melebihi 45% dari potensi yang terhitung

Semua persyaratan tersebut, akan mengacu pada keamanan, efikasi,

dan kualitas dari produk.
THANKS