Rekayasa Enzim Malat untuk Meningkatkan

Akumulasi Lipid di Chlorella Protothecoides dan

Produksi Langsung Biodiesel dari Mikroalga
Biomassa
Cut Riski (2208203010009)
Mutiara Ramadhani 92208203010001)
Rekayasa Genetika
• Rekayasa genetika adalah upaya untuk melakukan modifikasi molekul genetik
dari suatu organisme sehingga diperoleh sifat yang baru dimiliki
Umumnya rekayasa genetik dilakukan dengan :

1 Memanipulasi gen
2 DNA Rekombinan
3 Kloning gen
4 Genetika modern dengan menggunakan berbagai prosedur
Pengertian Kloning

Kloning adalah teknik membuat keturunan dengan kode

genetik yang sama dengan sel induknya tanpa proses
pembuahan

Tujuan Kloning
• Mengembangkan ilmu pengetahuan, khususnya dalam
bidang bioteknologi modern dan reproduksi
• Memperbanyak dan mengembangkan bibit unggul suatu
organisme
• Mengatasi infertilitas atau ketidaksuburan suatu
organisme
Teknik kloning gen ke bakteri

01 Enzim restriksi 03 Gibson Assembly

02 TA cloning 04 LIC Cloning

05 Annealed Oligo
Teknik kloning : Enzim Restriksi
 02
Study Case
 —Abstrak

Rekayasa genetika mikroalga eukariotik Chlorella protothecoides masih dalam tahap awal
pengembangan. Adanya kebutuhan untuk mengembangkan proses produksi biodiesel hemat biaya
dari C. protothecoides basah dan lipid yang berlimpah. Enzim malat adalah enzim kunci
potensial yang bertanggung jawab atas langkah pembatas laju yang terkait dengan akumulasi
lipid pada beberapa mikroorganisme. Dalam penelitian ini, kami merekayasa C. protothecoides
secara genetik dengan mengekspresikan enzim malat kunci secara berlebihan untuk meningkatkan
akumulasi lipid untuk produksi biodiesel langsung dari biomassa mikroalga. Kerangka pembacaan
terbuka yang mengkode 509 residu asam amino dari enzim malat diduga diperoleh dan
diidentifikasi. Kloning dan overekspresi gen enzim malat memungkinkan rekayasa genetika C.
protothecoides untuk akumulasi lipid dan produksi langsung biodiesel lebih lanjut tanpa
memerlukan langkah ekstraksi lipid. Total akumulasi lipid pada C. protothecoides yang direkayasa
secara genetik meningkat 2,8 kali lipat dibandingkan dengan tipe liar. Tahap dehidrasi
menggunakan pretreatment metanol digabungkan dengan H2SO4 atau produksi biodiesel
terkatalisis lipase memungkinkan 93-98% hasil biodiesel langsung dari biomassa mikroalga tanpa
ekstraksi lipid dalam kondisi optimal. Dehidrasi langsung yang efisien dan proses transformasi
kimia dan enzimatik dapat secara signifikan mengurangi keseluruhan biaya produksi biodiesel dari
bahan baku mikroalga basah dan kaya lipid.
Pendahuluan
○ Metil asam lemak rantai panjang atau metil ester asam lemak
(FAME) yang dikenal sebagai biodiesel telah menarik banyak
perhatian
○ FAME merupakan sumber bahan bakar yang bersih, ramah
lingkungan, berkualitas tinggi dan bahan bakar terbarukan.
○ Tingginya harga dari minyak nabati yang dipilih sebagai
bahan baku untuk memproduksi biodiesel mengakibatkan
ekonomi semakin memburuk.
○ Salah satu strategi yang dapat digunakan untuk mengatasi
permasalahan tersebut yaitu produksi minyak mikroalga
sebagai bahan baku produksi biodiesel karena merupakan
minyak yang terbarukan, menunjukkan efisiensi
pemanfaatan cahaya yang tinggi, dan memiliki persyaratan
pertumbuhan minimal.
Pendahuluan
○ Telah banyak upaya yang dilakukan untuk memproduksi biodiesel berbasis mikroalga untuk meningkatkan
produksi lipid mikroalga, diantaranya membatasi nitrogen atau fosfat. Strategi lain yang menjanjikan yaitu dengan
rekayasa genetika jalur biosintesis lipid untuk meningkatkan kandungan lipid.

Chlorella Protothecoides
○ Merupakan mikroalga eukariotik yang sangat potensial untuk memproduksi
biodiesel
○ Kelimpahan dan pertumbuhan mikroalga ini sangat cepat dan dinilai ideal dan
potensial untuk dijadikan sebagai bahan baku produksi bioenergi
○ Untuk memaksimalkan produksi lipid dari mikroalga protothecoides C,
digunakan enzim malat dengan membangun strain transgenik yang
meningkatkan hasil lipid dan dilakukan overekspresi gen enzim malat dalam
mikroalga protothecoides C.
○ Biomassa mikroalga kaya lipid yang direkayasa langsung diubah menjadi
biodiesel melalui dehidrasi in-situ dikombinasikan dengan teknologi katalis Chlorella Protothecoides as Biodiesel
tanpa ekstraksi lipid.
Bahan dan Metode
Strain, medium , chemical
• Strain bebas C. protothecoides dan escheria
coli DH5α disimpan dilaboratorium.
• Reagen molekuler umum di ampilfikasi
cepat pada ujung cDNA(RACE)
• Medium SE terdiri dari beberapa variasi
larutan
Budidaya mikroalga dan perolehan biomassa
• Dibawah penerangan cahaya putih, strain mikroalga
yang direkayasa ditanam dalam media SE cair pada
25oC selama satu minggu untuk perkembangbiakan
benih.
• Sel mikroalga di bawah fase pertumbuhan stasioner
disentrifugasi pada 5000 rpm selama 10 menit
• Biomassa ditentukan dengan menimbang sel baku
kering.
Bahan dan Metode
Kloning gen
Tahapan Isolasi gen
• RNA total C. protothecoides
diisolasi menggunakan reagen
trizol

• Strand pertama cDNA disintesis

dengan kit sintesis cDNA untai
pertama

• Seluruh fragmen yang

mengandung gen ME diperoleh
melalui ampifikasi PCR
berdasarkan tiga fragment
terminal
Bahan dan Metode
Kloning gen
Tahapan Insersi Tahapan Screening
• Gen ME lengkap disubklon ke plasmid
Koloni yang berubah dipilih berdasarkan
Pbi121 untuk menghasilkan rekombinan
pertumbuhan pada 20 µ ml-1 G418 (genicitin)
plasmid Pbi121-me.
pada pelat SE dan ditempatkan didalam
Tahapan Transformasi (Overekspresi ME) illumination incubator.

Untuk mendapatkan mikroalga transgenik,

plasmid Pbi121-me ditransformasikan
dengan micropartikel bombarded menjadi • Analisis transkripsi gen enzim malat
inang mikroalga melalui pengiriman dilakukan secara transkripsi semi-
mikroproyektil emas yang dilapisi DNA ke kuantitatif (RT)-PCR
dalam sel inang oleh alat penembak partikel
Bahan dan Metode
Uji Enzim malat dan uji lipase
Uji enzim malat
Uji lipase
Sel-sel mikroalga Uji lipase dilakukan dengan titrasi NaOH
Dihancurkan dan menggunakan minyak zaitun emulsi sebagai
disentrifugasi
substrat.
Supernatan
Dimurnikan melalui NI-NTA
affinity kromatografi

Enzim Malat Murni

Ditambahkan ke HCL,
MgCl2, L-malate, NaDP+

1 unit Enzim Malat

Ektraksi lipid dan kandungan lipid serta penentuan komposisi
 Hasil dan
Pembahasan 03
Kloning gen enzim malat
Pengaruh Enzim Malat pada Akumulasi Lipid
Mikroalga Biodiesel
Pengaruh variabel yang signifikan terhadap hasil biodiesel dalam produksi
biodiesel melalui jalur kimia (A) dan jalur enzimatik (B)
Kesimpulan
1 3
Dengan melakukan kloning Tahap dehidrasi menggunakan pre-treatment metano
dan overekspresi gen enzim digabungkan dengan H2SO4 (produksi biodiesel
malat pada C. Protothecoides termediasi lipase) dari biomassa mikroalga merupaka
tingkat akumulasi lipid proses yang menarik untuk bahan baku mikroalga
sebesar 2,8 kali lipat basah kaya lipid (wet and lipid-rich microalga)

2 4
Dengan rekayasa genetika pertama kali Proses dehidrasi dan transformasi langsung ini dapat
dilakukan pada C. Protothecoides akan secara otomatis mengurangi keseluruhan biaya
mendorong modifikasi genetik dan produksi biodiesel dari bahan baku mikroalga
metabolisme lebih lanjut dari mikroalga
eukariotik
Thankyou