BAB III.

Teknik Aseptik
 Kontaminasi :
Eksplan, organisme kecil, botol
kultur/alat2 tanam, lingk kerja & ruang
kultur, kecerobohan pelaks.
 Prosedur aseptik :
Lingk kerja, Alat-alat dan media,
Bahan tanaman
Sterilisasi lingkungan kerja
 Umum : r. transfer
 Pembatasan keluar-masuk
 Desinfektan (karbol, lysol, clorox)
 Alas kaki & jas lab

 Spesifik : LAF
Kotak pindah
 Lampu germicidal (UV), alkohol 70%, formalin
LAF Cabinet
 Aliran udara halus dr blower (100 flow/mnt),
lewat filter HEPA (High Efficiency Particulate
Air) dg pori < 0,3 m
 Alkohol 70% / lart kaporit, UV ½ - 1 jam
 Sterilisasi Alat-alat dan Media
Alat2 yg perlu sterilisasi :
 Pinset, gunting, gagang skalpel, kertas saring, petri
dish, botol2 kosong, jarum, pipet

Alat2 logam/gelas : autoclave

Alat tanam (pinset, gunting): pembakaran, pemanasan
 Dibungkus rapi dg kertas tebal, ditaruh baki stainless
steel
 Temp 121oC; tek 17,5 psi (pounds per square inch);
1 jam
Media dan aquadest : autoclave
 Aquadest : erlenmeyer 250 ml, max 100 ml
 17,5 psi; 1 jam

 Media :
 Tanpa bahan2 heat-labile: 121oC; 15-17,5 psi;
20-25 mnt
 Bahan2 heat-labile (GA3, Thiamin-HCl,
antibiotik, Ca-panthothenate): filter dg pori 0,20
– 0,22 m
Sterilisasi bahan tanaman
 Kontaminan :
Debu, kotoran, kontaminan hidup
 Pd media (gula, vit, min), kont (cend,

bakteri) tumbuh cepat, penuhi btl kultur,

eksplan mati

Dr dlm jar tnm (bakteri): sulit diatasi

 Antibiotik, fungisida sistemik
 Tingkat kontaminasi tergantung :
jenis tnm, bagian tnm yg dipergunakan,
morfologi permukaan, lingkungan tumbuh,
musim wkt mengambil, umur tnm, kondisi tnm

Bahan sterilisasi permukaan :

 Kalsium hipoklorid, Natrium hipoklorid, Hidrogen
peroksida, Gas klorin, Perak nitrat, Merkuri
klorid, Betadine, Fungisida, Benlate, Antibiotik,
Rifampicin, Kanamicin, Streptomycin, Cetafoxin,
Carbenicillin, Alkohol
 Toxic, perlu pembilasan berkali2
Penggunaan Laminar Air Flow Cabinet

 Persiapan bahan tanaman, penanaman,

pemindahan tnm dr satu botol ke botol lain
dlm kultur in vitro
2 macam filter :
 Pre-filter : saringan pertama debu &
benda2 kasar 5  ; eff 95% untuk obyek ≥
5 .
 HEPA, pori 0,3  pada bidang keluar udara
ke arah permukaan tempat kerja.
Tanpa UV : blower jalan terus
Dengan UV: nyalakan min 30 mnt sblm digunakan

Alat-alat yang masuk :

 Lampu alkohol / bacticinerator

 Wadah alkohol

 Pinset, skalpel, gunting, jarum

 Petridish steril

 Disecting microscop

 Kertas tissue / kapas

Cara menggunakan :

1. Nyalakan lampu UV (min 30 mnt sbl

dipakai, hindarkan dari badan & mata).
2. Siapkan semua alat2 steril yg perlu,
semprot alkohol 70%
3. Jalankan air flow dg hidupkan blower
4. Nyalakan lampu alkohol
5. Siap untuk dipakai
Hal yang perlu perhatian:
a. Jangan letakkan lampu alkohol tll dekat dg
filter
b. Jangan menumpuk alat2, botol2 media, dll di
depan tempat bekerja
c. Jangan celupkan alat tanam dg nyala api ke
dlm alkohol.
d. Jangan dekati lampu alkohol, dg tangan
yang baru disemprot alkohol
e. Bersihkan L A F setelah selesai bekerja.
Sterilisasi dg autoclave Gas

Prinsip: panas dan tekanan uap air.

 Temperatur:121oC

 Tekanan:17,5 – 20 psi

 Waktu (tergantung volume dan jenis)

 Alat-alat dan air: 1 jam

 Media: 20 – 40 menit
 Sterilisasi media terlalu lama:
Penguraian gula; Degradasi vitamin dan
asam-asam amino; Inaktifasi sitokinin zeatin
riboside; Perubahan pH shg depolimerisasi
agar

Bagian2 autoclave gas portable:

1. Panci luar
2. Panci dalam temp botol dg alur temp sal uap
3. Tutup beserta penunjuk tekanan dan sal uap
4. Katup pengeluaran uap
5. Pengunci
 Cara menggunakan:
1. Isi panci luar dengan air, (kecil 1 l ; besar 1,5 l)
2. Masukkan botol ke dalam panci dalam. Susun
hingga mencapai permukaan.
3. Atur posisi panci
4. Tutup dengan erat
5. Biarkan katup pengeluaran uap terbuka
6. Letakkan autoclave diatas kompor gas / bunsen
7. Panaskan sampai air mendidih dan uap keluar
dari katup pengeluaran uap
8. Biarkan uap keluar selama (min 5 mnt )
9. Tutup katup pengeluaran uap
10. Amati kenaikan temperatur dan tekanan
11. Saat tekanan 17,5 – 18 psi, api kompor
dikecilkan
12. Jaga tekanan dengan mengatur api kompor
13. Setelah waktu sterilisasi tercapai, matikan
api kompor
14. Keluarkan uap sedikit2 dg mengatur katup
pengeluaran uap
15. Stlh tek 0, buka pengunci dan keluarkan
panci berisi media