METODE ANALISIS PROTEIN

METODE ANALISIS PROTEIN

UJI
KUALITATIF

UJI
KUANTITATIF
Test Xanthoprotein

Test Biuret UJI KUALITATIF

Test Ninhydrin
Pengendapan protein oleh
Pengendapan Test
Pengendapan
MillonNinhydrin
protein
Nasse oleh
oleh Logam anion
anion kompleks Pengendapan
Denaturasi Test Test
Hopkins
Reduksi
oleh Biuret
Xanthoprotein
protein
panasSulfur
– Cole
oleh
danasampH yangkuat
Pengendapan protein oleh Reaksi Natriumnitroprusida
kompleks
anion kompleks Prinsipnya
uji
Prinsipnya
ini Pengendapan
untuk Reaksi adalah
ekstrim
adalah
mengetahui
Sakaguchi
oleh garam protein
alkohol
adanya logam
asam
Prinsipnya
Prinsipnya
Uji ini larutanadalah
untukadalah
adalah
adalah
adalah semua
reaksi
jika
mengetahui
apabila antara
asam
protein
reaksi suatu ini
Reduksi Sulfur dengan
amino
seperti
Prinsipnya Tyrosin.
Ag,
adalah Pb CuSO
Tetapi encer
natriumnitroprusida
dan tidak
4 Hg akan
terlalau
akan
amino pada
kation
ditambahkan
berada
protein
berdasarkan
Prinsipnya dandan
yang
adalah
padaanion
HNO 3peptida
lingkungan akan
mengandung kompleks
kondensansi
apabila yang 2yang
terbentuk
protein
asam
tidak
inti
Hopkins – Cole
membentuk
spesifik
membentuk
dalam
Prinsipnya karena
larutan
adalah senyawa
fenol
adalah
endapan
arginin
juga
amoniak kompleks
memberikan
atau protein
alkohol
logam
akan
Millon Nasse mengandung
digunakan
sesuai
amino
indol
berada
endapan
uji
dari
proteinat.
menurunkan
seperti
menghasilkan
dapat
positif.
pada
dengan
putih
menghasilkan
untuk
triftopan
pH
Pereaksi
Ikatan
muatan
gugus
lingkungan
atom
warna
yangdengan
yang
amat
Millon
warna
mengetahui
rendah
molekul
merah
kuat
α-amino
S,merupakan
yang
Nasse
misalnya
aldehid.
merah
dan
akibat
tidak
dengan
akibat
berisi
akan
jika
dalam
penambahan
cystein
Reaksi
sesuai
senyawa suasana
seperti
dan
positif
asam
methionin.
polinitro pH alkalis
ditandai
kuat,
dan dan
bilamaka
suhu yang
Prinsipnya
dengan
protein
yang
didinginkan
Pengendapan oleh Logam bebas
sifat
merkuri
memutuskan
dehidrasi
protein
ditambahkanmemberikan
protein
yang
dalam
dan mempunyai
fat
dengan
asam yang
jembatan
solven reaksi
nitrat
larutan
yang
gugus
dan positif
dapat
bersifat
garam,
alfa
asam
–SH–
membentuk
akan
adalah
terjadinya
ekstrim
kemudian maka
dalam warna
mengalami
cincin
protein
suasanan
ditambahkanungu ungu.
akan padamengalami
denaturasi
basa,
NaOH bidang
10%Pb
Pengendapan oleh alkohol dengan
dipresipitasikan
nitrit. Warna
sehingga
ireversibel.
bebas.
naftaol terbentuknya
Jadi
dan protein
natrium
protein
merah oleh
yang warna
hipoklorit.
yang anion
mengandung
mengalamibiru
terbentuk
(perubahan
asetat
batas
denaturasi
akan kedua
akansifat
terbentuk larutan.
sehingga
bereaksi
asli protein)
warna dengan
protein
orange. sehingga
S akan
dari
Denaturasi oleh panas sampaidapat
kompleks
adalah
denaturasi.
sistein ungu.
dan
garam untuk mengetahui
memberikan
Proses
merkuri dan
hasil
denaturasi
Tyrosin
positif.
dan pH yang ekstrim proteinamino
asam
mengendap. akan mengendap.
membentuk garam PbS
yang
tersebut
ternitrasi.
kestabilan akan menimbulkan endapan.
protein.
Reaksi berwarna hitam.
Natriumnitroprusida
Reaksi Sakaguchi
 UJI KUANTITATIF

Metode konvensional
(untuk protein tidak
terlarut)

Metode modern (untuk

protein terlarut)
 UJI KUANTITATIF
Metode konvensional
(untuk protein tidak
terlarut)
Metode Kjeldahl
Metode ini merupakan metode yang sederhana untuk
penetapan nitrogen total pada asam amino, protein, dan
senyawa yang mengandung nitrogen. Prinsipnya adalah
sampel didestruksi dengan asam sulfat dan dikatalisis
dengan katalisator yang sesuai sehingga akan menghasilkan
amonium sulfat. Setelah pembebasan alkali dengan kuat,
amonia yang terbentuk disuling uap secara kuantitatif ke
dalam larutan penyerap dan ditetapkan secara titrasi.
 Metode Kjeldahl
• Analisis protein kuantitatif protein tak
langsung
• Penentuan protein kasar (crude protein)
• Pengukuran kadar N dalam bahan pangan
• Tahapan: destruksi, destilasi, titrasi
• Kadar Protein = Kadar N x faktor konversi
• Faktor konversi: 100/16 = 6.25 (umum)
Kelemahan
• Senyawa lain selain protein yang mengandung
N terukur sebagai protein
• Misal senyawa bernitrogen: asam amino
bebas, urea, amonia, asam nukleat, nitrit,
nitrat, amida, purin, pirimidin
1. Tahap Destruksi
• Tujuan : melepaskan nitrogen dari protein
• Sampel dipanaskan dalam larutan asam sulfat pekat
• Unsur C dan H teroksidasi menjadi H2O, CO2, CO
• Unsur N berubah menjadi amonium sulfat (NH4)2SO4
• Asam sulfat juga mendestruksi KH dan lemak
• Diperlukan katalisator untuk mempercepat proses destruksi
• Tujuan: Mempertinggi titik didih asam sulfat, suhu destruksi lebih tinggi (370-
410oC)
• Jenis:
• Campuran Na2SO4 dan HgO (20:1)
• K2SO4
• CuSO4
2. TahapDestilasi
• Dilakukan dengan menambahkan NaOH
• Pada tahap ini amonium sulfat dipecah
menjadi amonia
• Amonia yang dibebaskan ditampung dalam
larutan asam standar biasanya HCl atau asam
borat 4% yang jumlahnya berlebihan
3. Tahaptitrasi
• Jika larutan asam penampung yang digunakan
HCl, sisa asam klorida yang tidak bereaksi dengan
amonia(membentuk NH4Cl) dititrasi dengan NaOH
• Jika digunakan indikator PP akhir titrasi adalah
perubahan larutan menjadi merah muda
permanen(dari asam ke basa) atau jika digunakan
indikator MR larutan berubah menjadi kuning
• Buat titrasi untuk blanko (tanpa sampel)
• Jika larutan penampung adalah asam borat/H2BO3
(asam lemah), banyaknya asam borat yang
bereaksi dengan amonia dapat diketahui dengan
titrasi dengan HCl 0.1 N dengan indikator MR+BCG
• HCl akan mentitrasi amonium-borat menjadi
amonium klorida sehingga pada akhir titrasi
terjadi kelebihan HCl/ asam kuat
• Akhir titrasi ditandai dengan perubahan larutan
dari biru/hijau menjadi merah muda
 UJI KUANTITATIF
Metode modern (untuk
protein terlarut)

Cahaya yang diserap sebanding

Metode Titrasi Prinsipnya
MetodeLowry
Metode Titrasi
adalahFormoldidasarkan
merupakan
Formol dengan konsentrasi zat yang
pada pengukuran serapan
pengembangan dari cahaya
metode
terkandung dalam sampel sehingga
Metode Lowry berwarna
Biuret. ungumetode
Prinsipnya
Dalam dari protein
adalah ini yang
larutan
terlibat
akan diketahui konsentrasi zat
bereaksi
protein
2 reaksi.dengan
dinetralkanpereaksi
Awalnya, dengan biuret
basa
kompleks
Metode dalam sampel secara kuantitatif
Spektrofotometri dimana
(NaOH) yang lalu
Cu(II)-proteinmembentuk
akan ditambahkan
kompleks
terbentuk
Visible (Biuret) dengan membandingkan
adalah
formalin
proteinakan
sebagaimana dengan membentuk
metode ion Cu2+yang
biuret, yang
Metode absorbansi sampel dan kurva
terdapat
dimethilol.
dalam dalam alkalis
suasana pereaksi
Cu(II) biuret
akan
Spektrofotometri UV standar BSA (Bovine Serum
dalam suasana
tereduksi basa.Cu(I).
menjadi
Albumine).
 Metode Biuret
• Pengukuran jumlah ikatan peptida dalam
protein
• Semakin tinggi kadar protein bahan, jumlah
ikatan peptida semakin banyak
• Prinsip analisis:
• Bahan yang mengandung ikatan peptida dua
atau lebih membentuk kompleks berwarna
ungu dengan ion Cu2+ /kupri pada kondisi alkali
Keunggulan
• Pengukuran kadar protein (direct method)
• Mendeteksi ikatan peptida protein (spesifik)
• Tidak mendeteksi nitrogen dr senyawa non peptida
• Sederhana, cepat, murah

Tahap analisis:
• Pembuatan kurva standar, preparasi, penetapan
sampel dg spektrofotometer, perhitungan
Pembuatan kurva standar
• Buat larutan standar BSA atau kasein dalam air dengan konsentrasi
0.5 mg/ml.
• Masukkan ke dalam tabung reaksi 0 (blanko), 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8.
dan 1.0 ml larutan protein standar. Tambahkan air sampai volume
total masing2 sebanyak 4 ml.
• Tambahkan 6 ml pereaksi Biuret ke dalam masing2 tabung reaksi.
Campur rata.
• Simpan tabung pada suhu 37°C selama 10 menit atau pada suhu
kamar selama 30 menit sampai terbentuk warna ungu yang
sempurna.
• Ukur absorbansi pada panjang gelombang 520 nm.
Preparasisampel
• Timbang sampel padat. Hancurkan sampel padat dengan
menggunakan waring blender. Hancuran yang diperoleh disaring
lalu disentrifugasi.
• Supernatan didekantasi untuk dipergunakan selanjutnya (protein
yang terdapat dalam supernatan adalah soluble protein).
• Sampel cair yang berupa protein konsentrat, isolat yang tidak
keruh, maka persiapan sampel cukup dengan pengenceran saja.
Jika cairannya keruh atau mengandung bahan-bahan yang
menganggu seperti glukosa maka harus dilakukan perlakuan
sebagai berikut:
• Timbang ekstrak. Ekstrak dimasukkan ke dalam
tabung reaksi seperti pada waktu penetapan standar,
kemudian tambahkan air sampai volume total
masing-masing 1 ml.
• Tambahkan 1 ml TCA (Tri ChloroaceticAcid) 10% pada
masing-masing tabung reaksi sehingga protein akan
terdenaturasi.
• Sentrifusa pada 3000 rpm selama 10 menit sampai
protein yang terdenaturasi mengendap, supernatan
dibuang dengan cara dekantasi.
• Ke dalam endapan tambahkan 2 ml etil eter, campur
merata lalu sentrifusa kembali untuk menghilangkan
residu TCA. Biarkan mengering pada suhu kamar.
• Ke dalam endapan kering ditambahkan air 4 ml,
campur merata.
• Tambahkan 6 ml pereaksi biuret, alkali dalam pereaksi
ini akan melarutkan endapan yang tersisa
• 0.1-1.0 ml sampel (dipipet tepat) dimasukkan ke dalam
tabung reaksi, kemudian diperlakukan seperti
penetapan standar
DISKUSI
TERIMAKASIH