FITOKIMIA

Oleh:
ElfIta
P E N DA H U L U A N

Tumbuhan Genus Garcinia

Kandungan kimia Aktivitas biologi dan

farmakologi yang bervariasi

Garcinia griffithii Antioksidan

Santon dan benzofenon Santon dan

(Xu et al., 1998 dan Nilar et al., 2005) Profil kimia
benzofenon lain ?

Sifat antioksidan ?
Metode DPPH, XO, dan NBT/XO Usulan biogenesis

Hubungan struktur-aktivitas
 Santon dan benzofenon dari kulit batang G. griffithii (Xu et al., 1998 dan Nilar
et al., 2005) O OH O OH
O OH
HO
HO O OH HO O OH
O OH OH
1,7-dihidroksisanton 1,3,6,7-tetrahidroksisanton 1,3,5,6-tetrahidroksisanton
OH

HO OH
HO O O
O O
OH O
OH
O OH
OH
HO O OH
OH
OH Gutiferon I
Grifipavisanton
HO O O

O O
Isosantosimol
P E N DA H U L U A N

Perumusan Masalah

Berdasarkan studi pustaka dan uji pendahuluan aktivitas

antioksidan, maka dirumuskan masalah dalam penelitian
ini yaitu:
1) Bagaimana profil kimia tumbuhan G. griffithii.
2) Bagaimana sifat antioksidan senyawa hasil isolasi dengan
metode DPPH, XO, dan NBT/XO.
3) Bagaimana hubungan struktur-aktivitas dari senyawa hasil
isolasi.
P E N DA H U L U A N

Maksud dan Tujuan Penelitian

Maksud yang hendak dicapai dalam penelitian ini adalah:

1) Mengisolasi dan menentukan struktur molekul senyawa santon dan

benzofenon dari kulit batang G. griffithii.

2) Menguji aktivitas antioksidan senyawa hasil isolasi dengan metode

DPPH, XO, dan NBT/XO.

3) Mempelajari profil kimia, kaitan biogenesis, dan hubungan struktur-

aktivitas dari senyawa hasil isolasi.

P E N DA H U L U A N

Tujuan yang hendak dicapai dalam penelitian ini adalah:

1) Mengetahui struktur molekul senyawa santon dan

benzofenon dari kulit batang G. griffithii.

2) Mengungkap sifat antioksidan senyawa hasil isolasi.

3) Mengungkap profil kimia, kaitan biogenesis, dan hubungan

struktur-aktivitas dari senyawa hasil isolasi.

P E N DA H U L U A N

Kegunaan Penelitian

1) Memberikan sumbangan terhadap perkembangan ilmu kimia

bahan alam dengan melengkapi ciri kimiawi dari tumbuhan G.
griffithii dan meningkatkan nilai tambahnya sebagai sumber
senyawa antioksidan.
2) Memberikan usulan biogenesis dan hubungan struktur-
aktivitas dari senyawa hasil isolasi, untuk pengembangan
lebih lanjut.
KERANGKA PEMIKIRAN

Tumbuhan Genus Garcinia

Kandungan kimia: Antioksidan

Santon dan benzofenon

Studi pustaka Garcinia griffithii Uji pendahuluan

Aktivitas antioksidan
senyawa santon dan bervariasi dengan ke-3
benzofenon lain metode uji: DPPH, XO,
dan NBT/XO

Profil kimia
SAR

Usulan biogenesis
Hipotesis

Hipotesis yang diajukan dalam penelitian ini adalah:

1) Kulit batang G. griffithii mengandung senyawa santon
dan benzofenon yang belum dilaporkan sebelumnya.
2) Santon dan benzofenon hasil isolasi memberikan
aktivitas antioksidan yang bervariasi dengan ketiga
metode uji yang digunakan (DPPH, XO, NBT/XO).
3) Sifat antioksidan suatu senyawa dipengaruhi oleh
struktur dasar, posisi, dan jenis substituen yang terikat.
Prosedur ekstraksi kulit batang G. griffithii
METODE PENELITIAN

Bubuk kering kulit batang

G. griffithii (1 kg)
- Maserasi: n-heksan (3 x 5 L @ 5 hari)
- Penyaringan
- Penguapan

Ekstrak kental Ampas

n-heksan (35,2 g) - Maserasi: CH2Cl2 (3 x 5 L @ 5 hari)
- Penyaringan
- Uji aktivitas antioksidan - Penguapan

Ekstrak aktif
Ekstrak kental Ampas
CH2Cl2 (23,5 g) - Maserasi: CH3OH (3 x 5 L @ 5 hari)
Dilanjutkan - Penyaringan
- Uji aktivitas antioksidan - Penguapan

Ekstrak aktif
Ekstrak kental Ampas
CH3OH (125,4 g)
Dilanjutkan
- Uji aktivitas antioksidan

Ekstrak tidak aktif

Dilanjutkan
Pemisahan dan pemurnian senyawa 3 dan 6 dari ekstrak n-heksan

Ekstrak n-heksan (20 g)

- KVC (2 x 10 g)
eluen: n-heksan-CH2Cl2 (10:0 – 0:10)
- KLT

FA FB FC FD
- KVC (3 x 10 g)
eluen: n-heksan-EtOAc (10:0 – 3:7)
- KLT

FC.1 FC.2 FC.3 FC.4 FC.5

- KKG
eluen: n-heksan-EtOAc (8:2)

Senyawa 3
(12 mg)
FD.1 FD.2 FD.3 FD.4 FD.5
- KKG
eluen: n-heksan-CH2Cl2 (8:2)

Senyawa 6
(7 mg)
Pemisahan dan pemurnian senyawa 1, 4, dan 5 dari ekstrak diklorometan

Ekstrak diklorometan (20 g)

- KVC 2 x 10 g, eluen: n-heksan-CH 2Cl2 (10:0 – 0:10) dan CH2Cl2-CH3OH (9:1 dan 8:2)
- KLT

FE FF FG FH FI FJ
- KKG, eluen: n-heksan-EtOAc (9:1 – 2:8)
- KLT

FF.1 FF.2 FF.3 FF.4 FF.5 FF.6

- KKG, eluen: n-heksan-CH2Cl2 (3:7)

Senyawa 4
(14 mg)

FH.1 FH.2 FH.3 FH.4 FH.5

- KKG, eluen: n-heksan-EtOAc (3:7-
- KKG, eluen: n-heksan-EtOAc (3:7)
1:9) dan EtOAc-CH3OH (9:1)
- KLT
Senyawa 1
(110 mg)
FH.4.1 FH.4.2 FH.4.3 FH.4.4 FH.4.5
- KKG, eluen: n-heksan-CH2Cl2 (3:7)

Senyawa 5 (5 mg)
Pemisahan dan pemurnian senyawa 2 dari ekstrak metanol

Ekstrak metanol (40 g)

- KVC (4 x 10 g), eluen: n-heksan-EtOAc (2:8 dan 1:9)
dan EtOAc-CH3OH (9:1 dan 8:2)
- KLT

FK FL FM FN
- KKG, eluen: n-heksan-EtOAc (2:8 dan 1:9)
dan EtOAc-CH3OH (9:1 dan 8:2)
- KLT

FM.1 FM.2 FM.3 FM.4

- KKG, eluen: n-heksan-EtOAc (2:8)

Senyawa 2
(5 mg)
 Uji aktivitas antioksidan

- Larutan induk dibuat dalam DMSO dengan konsentrasi 800 µg/mL.

- Variasi konsentrasi sampel dibuat dengan pengenceran larutan
induk menjadi: 200; 100; 50; 25; 12,5; 6,25; dan 0 µg/mL.

Uji antioksidan dengan metode DPPH

200 µL sampel 3,8 mL DPPH 0,05 mMDiamkan 30 menit Ukur A pada

dalam DMSO + dalam MeOH maks 517 nm

Ak – As Ak = Absorban kontrol
% Inhibisi = X 100
Ak As = Absorban sampel
Uji antioksidan dengan Metode XO
Komposisi reagen pengujian antioksidan dengan metode XO

Kuvet Sampel XO XH SDS DMSO Buffer

(μL) (μL) (μL) (μL) (μL) (μL)
P0 - - 500 500 100 1900
100 L 100 µL XO
sampel
+ 1 unit/mL
P1 - 100 500 500 100 1800
P2 100 100 500 500 - 1800

- Inkubasi 20 menit

Larutan A + 500 L XH
P2 - P 0
0,5 x 10-2 M % Penghambatan aktivitas = 1 - x 100
P1 - P 0

- Inkubasi 20 menit

Larutan B 500 L SDS P0 = Absorban blanko

+ 69 mM P1 = Absorban kontrol
P2 = Absorban sampel

- Ukur pada maks 290 nm

Absorban P2
 Uji antioksidan dengan Metode NBT/XO
Larutan A
(500 µL XH; 100 µL + 100 µL XO 1 unit/mL
NBT; 100 µL sampel)

- Inkubasi 20 menit

Larutan B + 500 µL SDS 69 mM

- Ukur pada maks 560 nm

Absorban P2 .-
% Inhibisi O2 = 1 -
P2 - P0
x 100
P1 - P0

Komposisi reagen pengujian antioksidan dengan metode

NBT/XO P0 = Absorban blanko
Kuvet Buffer NBT XH XO DMSO SDS Sampel P1 = Absorban kontrol
(μL) (μL) (μL) (μL) (μL) (μL) (μL) P2 = Absorban sampel
P0 1800 100 500 - 100 500 -
P1 1700 100 500 100 100 500 -
P2 1700 100 500 100 - 500 100
Nilai IC50 senyawa hasil isolasi (1 sampai dengan 6), senyawa lainnya yaitu dari G. nigrolineata
(G1 dan G2), G. cowa (G3 dan G4), dan G. forbesii (G5), serta standar antioksidan
No. Senyawa uji Nilai IC50 (µg/mL)
DPPH XO NBT/XO
1. 1,7-Dihidroksisanton (1) > 100 > 100 > 100
2. 1,6,7-Trihidroksisanton (2) 9,8 23,9 37,2
3. 1,6-Dihidroksi-3-metoksi-4,7-di-(3- 74,7 38,9 40,8
metilbut-2-enil)santon (3)
4. 1,5-Dihidroksi-3,6-dimetoksi-2,7-di-(3- > 100 > 100 > 100
metilbut-2-enil)santon (4)
5. Gutiferon I (5) 8,0 9,9 8,4
6. Isosantosimol (6) 7,7 10,2 9,4
7. 1,7-Dihidroksi-3-metoksi-4-(3-metilbut- 78,9 81,5 85,8
2-enil)-6’,6’-dimetilpirano
(2’,3’:5,6)santon (G1)
8. 1,7-Dihidroksi-6’,6’-dimetilpirano 56,4 92,3 72,7
(2’,3’:6,5)santon (G2)
9. Kowanin (G3) 33,0 56,8 59,7
10. Rubrasanton (G4) 31,1 33,4 35,7
11. 1,3,5-Trihidroksi-7-metoksi-8-(3,7- 39,7 40,3 60,9
dimetilokta-2,6-dienil)santon (G5)
12. Asam askorbat 10,6 18,1 19,1
13. -Tokoferol 18,2 32,8 38,0
14. BHA 17,6 35,1 40,9
* IC50 < 11,4 g/mL = sangat aktif; 11,4-100 g/mL = aktif; dan > 100 g/mL= tidak aktif
 Hubungan Struktur-Aktivitas

Gugus o-dihidroksifenil meningkatkan aktivitas antioksidan

O OH OH OH
HO HO O O HO O O

HO O
(2) O OH
O O
(5)
(6)
DPPH : IC50 9,8 g/mL DPPH : IC50 8,0 g/mL
XO : IC50 23,9 g/mL DPPH : IC50 7,7 g/mL
XO : IC50 9,9 g/mL
NBT/XO : IC50 37,2 g/mL XO : IC50 10,2 g/mL
NBT/XO : IC50 8,4 g/mL
NBT/XO : IC50 9,4 g/mL
 Masuknya gugus prenil menurunkan aktivitas antioksidan

Gugus para hidroksil terhadap karbonil pada cincin heterosiklik

menaikkan aktivitas antioksidan

O OH O OH

HO O OCH3 H3CO O OCH3

(3)
OH
IC50 74,7 (4)
IC50 > 100

O OH O OH O OH
H3CO H3CO H3CO

HO O OH HO O OH O OH
(G3) (G4) OH
IC50 33,0 IC50 39,7
IC50 31,1 (G5)
 Pengurangan jumlah hidroksil bebas menurunkan aktivitas antioksidan

O OH O OH O OH
HO

HO O HO O OCH3 H3CO O OCH3

(1)
IC50 > 100 IC50 74,7 (3) OH(4)
IC50 > 100
O OH O OH
HO
HO

O O OCH3
O O
(G1) IC50 56,4
(G2)
IC50 78,9

O OH O OH O OH
H3CO H 3CO H3CO

HO O OH HO O OH O OH
(G3) IC50 33,0 IC50 31,1 (G4) OH (G5) IC50 39,7
Tipe reaksi pada metode DPPH

DPPH + AH → DPPH–H + A
DPPH + R → DPPH–R

Tipe reaksi pada metode XO

O H O H

HN N
+ 2O2 XO HN
N
O + 2 H+ + 2 O2 -
.
N santin oksidase
O N O N N
H H H
Santin Asam urat

Tipe reaksi pada metode NBT/XO

Santin + 2O2
XO .-
Asam urat + 2O2 + 2H+
NBT _
NO2 BT
(zat warna formazan)
Antioksidan

H2 O2 + O2
Tipe reaksi pada metode DPPH

Aktivitas antioksidan dari suatu senyawa ditunjukkan oleh hambatan

serapan DPPH melalui perhitungan persentase inhibisi absorbansi
DPPH pada panjang gelombang 517 nm. DPPH mempunyai absorbsi
yang kuat pada panjang gelombang 517 nm dengan warna violet gelap.
Karena memiliki elektron sunyi menyebabkan DPPH sangat reaktif
untuk menangkap elektron atau radikal hidrogen lainnya untuk menjadi
molekul diamagnetik yang stabil. Pengurangan nilai serapan DPPH
terjadi jika elektron sunyi menjadi berpasangan karena adanya zat
antioksidan, sehingga menyebabkan hilangnya warna ungu secara
stokhiometri. Reduksi DPPH dapat terjadi oleh suatu antioksidan (AH)
dan oleh suatu jenis radikal (R), yang dituliskan sebagai berikut

DPPH + AH → DPPH–H + A
DPPH + R → DPPH–R

Aktivitas antioksidan sampel ditentukan oleh besarnya hambatan serapan

radikal DPPH melalui perhitungan persen inhibisi serapan DPPH.
Tipe reaksi pada metode XO

Uji penghambatan aktivitas santin oksidase terhadap santin

sebagai substrat diukur secara spektrofotometri pada panjang
gelombang 290 nm pada suhu 200C melalui penentuan asam urat
yang terbentuk.
Prinsip pengujian pada metode ini adalah enzim santin oksidase
mengkatalisis oksidasi dari santin menjadi asam urat dan radikal
anion superoksida dengan reaksi sebagai berikut:

O H O H

HN N
+ 2O2 XO HN
N
O
.
+ 2 H+ + 2 O2 -
N santin oksidase
O N O N N
H H H
Santin Asam urat
Tipe reaksi pada metode NBT/XO

Metode penghambatan reduksi nitro tetrazolium biru (NBT/XO)

didasarkan pada penangkapan radikal anion superoksida (O2– ). Reaksi
antara santin dengan oksigen yang dikatalis oleh santin oksidase akan
menghasilkan radikal anion superoksida. Radikal anion superoksida (O2–
) yang terbentuk akan mereduksi warna kuning dari nitro tetrazolium biru
(NBT2+) menjadi formazan biru melalui reaksi antara NBT dengan O2–.
Zat antioksidan yang terdapat dalam sampel akan berkompetisi dengan
NBT untuk bereaksi dengan O2–. Penghambatan reduksi NBT sekaligus
menghambat pembentukan formazan. Aktivitas antioksidan diukur pada
panjang gelombang 560 nm.

Santin + 2O2
XO .-
Asam urat + 2O2 + 2H+
NBT _
NO2 BT
(zat warna formazan)
Antioksidan

H2 O2 + O2