Analisa Kualitatif dan Kuantitatif Obat dan

Kosmetik dengan Menggunakan

Spektrofotometer UV-Vis dan KCKT
P R O D I D 3 FA R M A S I
FA K U LTA S M AT E M AT I K A D A N I L M U P E N G E TA H U A N A L A M
U N I V E R S I TA S B E N G K U L U
Outline
BPOM
Teori Spektrofotometri UV-Vis dan KCKT
Aplikasi instrumen Spektrofotometer UV Vis dan KCKT untuk analisa obat dan kosmetik
Bagian dari instrumen tersebut dan fungsinya
Preparasi sampel untuk analisa
Running dan Output dari instrument
Membaca data hasil instrument, dan menyimpulkannya

Permasalahan dan hambatan selama analisa dan solusinya

Badan Pengawas Obat dan Makanan
 BadanPengawasObat danMakanan

 Berdasarkan pasal 1 pada Peraturan Presiden Nomor 80 Tahun 2017

tentang Badan Pengawas Obat dan Makanan:
1. Badan Pengawas Obat dan Makanan, yang selanjutnya disingkat BPOM
adalah lembaga pemerintah nonkementerian yang menyelenggarakan
urusan pemerintahan di bidang pengawasan Obat dan Makanan.
2. BPOM berada di bawah dan bertanggung jawab kepada Presiden
melalui menteri yang menyelenggarakan urusan pemerintahan di bidang
kesehatan.
3. BPOM dipimpin oleh Kepala.
 BadanPengawasObat danMakanan

 Berdasarkan pasal 2 pada Peraturan Presiden Nomor 80 Tahun 2017

tentang Badan Pengawas Obat dan Makanan:
1. BPOM mempunyai tugas menyelenggarakan tugas pemerintahan di
bidang pengawasan Obat dan Makanan sesuai dengan ketentuan
peraturan perundang-undangan.
2. Obat dan Makanan sebagaimana dimaksud pada ayat (1) terdiri atas
obat, bahan obat, narkotika, psikotropika, prekursor, zat adiktif, obat
tradisional, suplemen kesehatan, kosmetik, dan pangan olahan.
 BadanPengawasObat danMakanan

 Berdasarkan pasal 4 pada Peraturan Presiden Nomor 80 Tahun 2017

tentang Badan Pengawas Obat dan Makanan
Dalam melaksanakan tugas pengawasan Obat dan Makanan, BPOM mempunyai
kewenangan :
1. menerbitkan izin edar produk dan sertifikat sesuai dengan standar dan
persyaratan keamanan, khasiat/manfaat dan mutu, serta pengujian obat
dan makanan sesuai dengan ketentuan peraturan perundang-
undangan;
2. melakukan intelijen dan penyidikan di bidang pengawasan Obat dan
Makanan sesuai dengan ketentuan peraturan perundang-undangan;
dan
3. pemberian sanksi administratif sesuai dengan ketentuan peraturan
perundang-undangan.
 BadanPengawasObat danMakanan

 Visi:
Obat dan Makanan aman, bermutu, dan berdaya saing untuk
mewujudkan Indonesia maju yang berdaulat, mandiri, dan
berkepribadian berlandaskan gotong royong
 STRUKTUR ORGANISASI BPOM
(Peraturan BPOM 26/2017 Kepala Badan Pengawas Obat dan
tentang OTK BPOM) Makanan

Inspektorat Utama Sekretariat Utama

Biro Umum dan Biro Hubungan

Biro Perencanaan Biro Hukum dan Masyarakat dan
Inspektorat I Inspektorat II dan Keuangan Organisasi
Biro Kerja Sama Sumber Daya Dukungan Strategis
Manusia Pimpinan

Deputi Bidang Pengawasan Obat, Deputi Bidang Pengawasan Obat

Deputi Bidang Pengawasan Deputi
Narkotika, Psikotropika, Prekursor, dan Tradisional, Suplemen Kesehatan,
Zat Adiktif dan Kosmetik Pangan Olahan Bidang Penindakan

Direktorat Standardisasi Obat, Direktorat Standardisasi Obat

Narkotika, Psikotropika, Direktorat Standardisasi Pangan Direktorat
Tradisional, Suplemen Kesehatan,
Prekursor, dan Zat Adiktif Olahan Pengamanan
dan Kosmetik

Direktorat Direktorat Registrasi Obat

Direktorat Direktorat
Registrasi Obat Tradisional, Suplemen Kesehatan,
Registrasi Pangan Olahan Intelijen Obat dan Makanan
dan Kosmetik

Direktorat Pengawasan Produksi Direktorat Pengawasan Obat Direktorat Pengawasan Pangan

Obat, Narkotika, Psikotropika,dan Direktorat
Tradisional dan Suplemen Olahan Risiko Rendah dan
Prekursor Penyidikan Obat dan Makanan
Kesehatan Sedang

Direktorat Pengawasan Distribusi Direktorat Pengawasan Pangan

Obat, Narkotika, Psikotropika,dan Direktorat
Pengawasan Kosmetik Olahan Risiko Tinggi dan
Prekursor Teknologi Baru

Direktorat Pengawasan Keamanan,

Mutu, dan Ekspor Impor Obat, Direktorat
Narkotika, Psikotropika, Prekursor, Pemberdayaan Masyarakat dan Unit Pelaksana Teknis
dan Zat Adiktif Pelaku Usaha

Pusat Data dan Informasi Obat dan Pusat Pengembangan SDM Pusat Pengembangan Pengujian Obat Pusat Riset dan Kajian 8
Makanan Pengawasan Obat dan Makanan dan Makanan Nasional Obat dan Makanan
PUSAT PENGEMBANGAN PENGUJIAN
OBAT DAN MAKANAN NASIONAL
KEDUDUKAN DAN TUGAS
PPPOMN
PerBPOM 21 tahun 2020

Psl 122 Psl 123

KEDUDUKAN TUGAS

• Berada di bawah dan Melaksanakan

bertanggung jawab penyusunan kebijakan
kepada Kepala BPOM teknis, pelaksanaan,
melalui Sekretaris pemantauan, evaluasi
Utama dan pelaporan di
bidang pengembangan
• Dipimpin oleh pengujian Obat dan
seorang Kepala Pusat Makanan
 PENDAHULUAN

 Pengujian laboratorium sangat strategis dan pilar penting bagi

pengawasan obat dan makanan
Tahapan Analisis

Penimbangan
Sampling Homogenisasi

Interpretasi/
Preparasi
Pengolahan Pengukuran
sampel
Data

Pengambilan
Pelaporan
Kesimpulan

13
 Pengujian

Laboratory

Jaminan Mutu
ISO 17025:2017
GLP

Analisis di Laboratorium
Sampel Ekstraksi, Pemurnian (clean-up); Laporan
analisis dengan instrumen, analisis data Hasil
Analisis
 KOMODITI
YANG DIUJI

Obat dan Bahan Baku Obat

Narkotika Psikotropika
Kosmetika
Obat Tradisional
Produk Komplemen
Pangan
Kemasan Pangan
Produk Biologi
Pengujian biologi molekular (residu DNA)
Rokok dan Alkes
Spesimen COVID-19
15
 PENANGANAN SAMPEL
Sampel merupakan bagian dari populasi yang ingin diteliti dan
dianggap sebagai perwakilan dari populasi yang hasilnya mewakili
keseluruhan gejala yang diamati.

1. Hasil Uji yang valid dimulai dengan pengelolaan sampel

yang baik.
2. Sampel harus diperlakukan sesuai dengan karaktestik, sifat
kimia dan fisika  tidak terjadi penurunan potensi yang
disebabkan oleh pengelolaan yang tidak tepat.
3. Jumlah sampel harus representative,
sesuai dengan monografi / prosedur
Analisa Kualitatif
Apakah yang terkandung dalam sampel?
Apakah benar sampel mengandung analit X?
Analisa Kuantitatif
Berapa kandungan zat X dalam sampel?
Apakah kandungan zat X dalam sampel sesuai dengan persyaratan yang ditetapkan?
 Analisis kualitatif berupa identifikasi suatu senyawa yang
terkandung dalam sampel;
• untuk memastikan kebenaran zat aktif.
Identifikasi Parasetamol dalam Tablet Parasetamol
• untuk senyawa yang dilarang
Identifikasi Bahan Kimia Obat dalam sampel Obat
Tradisional
Uji Reaksi Warna (Reinsch Test) untuk merkuri dalam
kosmetik

 Analisis kuantitatif berupa Penetapan Kadar untuk

senyawa zat aktif atau Penentuan Kandungan untuk
senyawa berupa kontaminan atau cemaran
• PK Asam Glutamat dalam Bumbu
• Penentuan kandungan residu Etilen Glikol dan Dietilen
Glikol dalam sirup
Spektrometri vs Spektrofotometri
Spektrometri adalah tehnik yang digunakan untuk mengukur suatu zat berdasarkan spektroskopi.
Spektroskopi merupakan ilmu yang mempelajari interaksi antara antara radiasi elektromagnetik
(EMR) dengan bahan (sampel)
Spektrofotometri: teknik analisis digunakan untuk mengukur suatu zat berdasarkan spektroskopi
yang berhubungan dengan penggunaan cahaya
Instrument yang digunakan disebut spektrometer dan spectrophotometer
Spektrofometer UV Vis, Spektrofotometer Serapan Atom (AAS), Spektrofotometer Infra Red
Spektrometer Massa
Untuk melihat pola spektrum yang dihasilkan
Untuk mengukur konsentrasi suatu bahan
Radiasi Elektro Magnetik
seperti diberikan dalam rumus sebagai berikut :

E = h f = h c/λ
dimana :
h = 6,63 x 10-34 J s (Tetapan Plank)
c = 3 x 1010 cm s-1 (Kecepatan cahaya dalam hampa )
f = frekuensi
λ = Panjang gelombang
Radiasi Elektromagnetik
UV Vis
Cahaya Tampak
Dasar Analisis Spektrofotometri UV
senyawa harus memiliki kromofor dan auksokrom yang memadai
kromofor adalah bagian molekul yang bertanggung jawab pada penyerapan cahaya
auksokrom adalah gugus fungsi yang memiliki hetero atom dan menempel langsung pada sistem
kromofor
Dasar Analisis Spektrofotometri Visible
Senyawa asli/asal harus berwarna
Bila senyawa asli tidak berwarna, dapat diubah menjadi senyawa berwarna dengan cara:
a. derivatisasi
b. memperpanjang kromofor
 Bagaimana menghitung kadar
Dengan perbandingan nilai absorban sampel terhadap nilai absorban baku [yang sudah diketahui
kadarnya]
Syarat: Nilai Abs.baku dan Nilai Abs.sampel berdekatan

Absorban sampel
x Kadar baku = Kadar sampel
Absorban baku
 Bagaimana menghitung kadar
Dengan menggunakan kurva baku/persamaan garis regresi
linear.
Kalibrasi Spektrofotometer
Wavelength accuracy and reproducibility
Dengan: - holmium atau didinium filter
Check wavelength over entire UV-VIS range
Maximum deviation 1.00 nm
Kalibrasi Spektrofotometer
Photometric accuracy and reproducibility
Dengan: 60 ± 0,25 mg K2Cr2O7/Liter in 0.005 M H2SO4
Running Spektrofotometer
Lakukan kondisioning sekitar 30 menit
Lakukan baseline terlebih dahulu
Lakukan pengukuran mulai blanko, baku, dan sampel
Lakukan pengukuran mulai sampel yang paling encer
Memegang kuvet pada sisi yang keruh
Kuvet yang bening ke arah sesuai
Lakukan pengenceran jika serapan terukur di atas 0,1
IDENTIFIKASI TELBIVUDIN DALAM TABLET
SECARA SPEKTROFOTOMETRI UV
Pelarut: Larutan asam hidroklorida 0,1 N.
Larutan Baku: Ditimbang saksama lebih kurang 15 mg Baku Pembanding Telbivudin, dimasukkan
ke dalam labu tentukur 100 mL, ditambahkan 75 mL pelarut, disonikasi selama 5 menit hingga
larut, diencerkan dengan pelarut sampai tanda. Sejumlah 2,0 mL larutan dipipet ke dalam labu
tentukur 20 mL dan diencerkan dengan pelarut sampai tanda.
Larutan Uji: Ditimbang dan diserbukkan tidak kurang dari 20 tablet. Ditimbang sejumlah serbuk
setara 75 mg Telbivudin, dimasukkan ke dalam labu 100 mL, dilarutkan dan diencerkan dengan
pelarut hingga tanda. Sejumlah 2,0 mL larutan dipipet ke dalam labu tentukur 100 mL dan
diencerkan dengan pelarut sampai tanda.
Pelaarut, Larutan Baku, dan Larutan Uji diukur pada panjang gelombang 200-400 nm
CONTOH IDENTIFIKASI TELBIVUDIN DALAM
TABLET
SECARA SPEKTROFOTOMETRI UV
Larutan Uji mempunyai panjang gelombang maksimum yang sama dengan panjang gelombang
Larutan Baku (±2 nm)
Larutan Uji dan Larutan Spiked mempunyai bentuk spektrum yang sama dengan Larutan Baku.
PENETAPAN KADAR RIFAMPISIN DALAM
TABLET
SECARA SPEKTROFOTOMETRI UV/VIS
Pustaka: International Pharmacopoeia, Tenth Edition
Pelarut: Larutan Dapar Fosfat pH 7,4
Larutan Baku: Timbang saksama lebih kurang 20 mg Rifampisin BPFI, masukkan ke dalam labu
tentukur 20 mL, tambahkan 15 mL metanol, sonikasi 2 menit, encerkan dengan metanol hingga
tanda. Pipet 1 mL, masukkan ke dalam labu tentukur 50 mL dan encerkan dengan Pelarut
sampai tanda.
Larutan Uji: Timbang tidak kurang dari 20 tablet, hitung bobot rata-rata dan gerus hingga
homogen. Timbang serbuk setara 50 mg Rifampisin, masukkan ke dalam labu tentukur 50 mL.
Tambahkan 35 mL metanol dan sonikasi selama lebih kurang 5 menit, lalu encerkan dengan
metanol sampai tanda. Larutan sentrifugasi dengan kecepatan 2000 rpm selama 10 menit. Pipet
1 mL beningan masukkan ke dalam labu tentukur 50 mL dan encerkan dengan Pelarut sampai
tanda.
 PENETAPAN KADAR RIFAMPISIN DALAM
TABLET
SECARA SPEKTROFOTOMETRI UV/VIS
Cara penetapan: Ukur serapan Pelarut, Larutan Baku dan Larutan Uji pada panjang gelombang
maksimum 475 nm menggunakan Pelarut sebagai blanko.
Keterangan:
Au = serapan Larutan Uji
Ab = serapan Larutan Baku
Bb = bobot baku Rifampisin BPFI yang ditimbang dalam
mg
Bu = bobot uji yang ditimbang dalam mg
Br = Bobot rata-rata tablet dalam mg
Fu = faktor pengenceran Larutan Uji
Fb = faktor pengenceran Larutan Baku
Ke = kadar Rifampisin yang tertera pada etiket dalam mg

Tablet mengandung Rifampisin C43H58N4O12 tidak kurang dari 90,0% dan tidak lebih dari
110,0% dihitung terhadap kadar etiket.
CONTOH PENETAPAN KADAR RIFAMPISIN
DALAM TABLET
SECARA SPEKTROFOTOMETRI UV/VIS
Kadar Rifampisin yang tertera pada etiket 150 mg
Berat rata-rata satu tablet 210,6 mg
Bobot baku 20,5 mg
Bobot sampel yang ditimbang 75,8 mg
Serapan larutan baku 0,4000
Serapan larutan sampel 0,3600
Pengenceran Baku = 20 x 50/1 = 1000
Pengenceran Sampel = 50 x 50/1 = 2500
CONTOH PENETAPAN KADAR RIFAMPISIN
DALAM TABLET
SECARA SPEKTROFOTOMETRI UV/VIS
W (kandungan Rifampisin per tablet)
= (0,3600/ 0,4000) x (20,5/ 75,8) x (2500/1000) x 210,6 = 128,15 mg
Kandungan Rifampisin dalam tablet terhadap etiket
=(128,15/ 150) x 100% =85,43% (Syarat 90,0-110,0%)
 Sejarah Kromatografi
KROMATOGRAFI KOLOM TSWETT 1906
Mikhail Tswett, Russian, Botanist

He called the new technique chromatography because the

result of the analysis was 'written in color' along the length of
the adsorbent column
Chroma means “color” and graphein means to “write”
Kromatografi
Merupakan metode pemisahan (separasi) dua atau lebih komponen antara dua fase yang tidak
saling bercampur, yaitu:
FASE DIAM (Stationary phase): Berupa padatan atau cairan
FASE GERAK (Mobile phase) Berupa gas atau cairan yang mengalir secara kontinu melewati fasa
diam.
Kromatografi Lapis Tipis (TLC)
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC)
Kromatografi Gas (GC)
Kromatografi Ion
Sering ditandemkan dengan Spektroskopi
PERKEMBANGAN KROMATOGRAFI

• 1906 : KROMATOGRAFI KOLOM

TSWETT
• 1938 : KROMATOGRAFI LAPIS
TIPIS
• 1952 : KROMATOGRAFI GAS
• 1960 : KROMATOGRAFI CAIR
KINERJA TINGGI
KROMATOGRAFI LAPISAN TIPIS

1)
CONTOH DITOTOLKAN 2)
PADA JARAK 1 CM
DARI DASAR PELAT
3)

4)

5)

Tahap Pewarnaan Noda

54
KROMATOGRAFI CAIR
KINERJA TINGGI
SEBAGAI FASA GERAK DIGUNAKAN PELARUT

BERBEDA DENGAN KROM. KOLOM TSWETT, FASA

DIAM DITEMPATKAN PADA KOLOM TERTUTUP

PELARUT DIALIRKAN KEDALAM KOLOM

MENGGUNAKAN BANTUAN POMPA

55
KCKT H I G H P E R F O R M A N C E L I Q U I D C H R O M AT O G R A P H Y
H I G H P R E S S U R E L I Q U I D C H R O M AT O G R A P H Y
1970 CSABA HORVATH
FD DALAM KOLOM GELAS DG
FG TEKANAN TINGGI
KCKT = HIGH PRESSURE LIQUID
C H R O M AT O G R A P H Y / H P L C
KCKT PENGEMBANGAN TEKNOLOGI KOLOM
KROMATOGRAFI KOLOM
KROMATOGRAFI ADSORPSI, PARTISI

2
Beberapa keuntungan KCKT:
Waktu analisis cepat
Daya pisah baik
Peka
Pemilihan kolom dan detektor bervariasi
FG dan kolom yg digunakan dapat dipakai
kembali
Cuplikan yg dipisahkan dapat diambil

5
1. Berdasarkan sifat fase diam dan fase gerak

KROMATOGRAFI

KROM. GAS KROM. CAIR

PLANAR KOLOM

KERTAS LAPIS TERBUKA TERTUTUP

TIPIS (TSWETT) (KCKT)
58
Kromatografi Partisi
• Pemisahan berdasarkan partisi analit dalam fase gerak
cair dan fase diam cair yang tidak saling bercampur dan
terikat pada penyangga kolom karena adanya perbedaan
kelarutan komponen sampel dalam kedua fase cair tsb.
• Teknik kromatografi partisi :
a. Kromatografi Fase Normal (KFN)
- Fase gerak non polar, fase diam lebih polar.
- Sampel kurang polar, terelusi lebih awal.
b. Kromatografi Fase Balik (KFB)
- Fase gerak polar, fase diam kurang polar.
- Sampel sangat polar, terelusi lebih awal.
- Banyak digunakan dibanding teknik krom lainnya.
 Different Types of chromatography
Mechanism Mobile phase Stationary phase Mode or type
Solutes move at different rates according Liquid or gas Solid that attracts Adsorption
to the forces of attraction to the the solutes Chromatography
.stationary phase
Solutes equilibrate between the 2 phases Liquid or gas Thin film of liquid Partition
according to their partition coefficients formed on the Chromatography
surface of a solid
inert support
Solute ions of charge opposite to the Liquid containing Solid resin that Ion Exchange
fixed ions are attracted to the resin by electrolytes carries fixed ions & Chromatography
electrostatic forces & replace the mobile mobile couterions of
.counterions opposite charge
attached by covalent
bonds

Molecules separate according to their Liquid Porous gel with no Molecular Exclusion
:size attractive action on Chromatography
1.Smaller molecules enter the pores of solute molecules
the gel, and need a larger volume of
eluent.
2.Larger molecules pass through the
column at a faster rate.

Special kind of solute molecules interact Liquid or gas Solid on which Affinity
with those immobilized on the stationary specific molecules Chromatography
phase are immobilized
 Sistem LC – HPLC/UHPLC

• Memperoleh hasil pemisahan yang baik

Konsep kromatografi
 Sistem dan Radas KCKT (Lanjutan)

1. Pompa : - mengalirkan fase gerak ke dalam sistem.

- aliran tetap atau tekanan tetap.
- sistem elusi isokratik atau gradien/landaian.

2. Injektor : - sistem suntik katup kitar (loop valve) yang

tidak memutuskan aliran fase gerak selama proses
penyuntikan dan meningkatkan kecermatan dengan
keterulangan 0,1% pada volume 10 – 50 µl
- saat load, sampel disuntikkan melewati
kitaran sampel dan kelebihannya dikeluarkan melalui
buangan saat inject. Fase gerak dari pompa akan melewati
kitaran sampel, kemudian memasuki kolom.
- sistem injeksi manual atau otomatisasi
melalui auto sampler.
 Sistem dan Radas KCKT (Lanjutan)

3. Kolom : - Proses pemisahan terjadi didalam kolom.

- Fase gerak yang melewati kolom dapat menyumbat kolom karena
pertumbuhan bakteri, pengendapan, kontaminan dan gelembung
udara. Karenanya fase gerak harus disaring dengan penyaring membran
diameter 0,45 µm dan diawaudarakan.
pH fase gerak harus 2 < pH < 8
- Kolom harus dicuci setelah digunakan dan disimpan dalam pelarut
organik yang sesuai. Jika fase gerak berupa dapar, kolom harus dicuci
dengan air agar tidak terjadi endapan yang menyebabkan
penyumbatan.
- Sebaiknya digunakan kolom pengaman agar kolom tahan lama
(menghemat umur kolom).
- Laju alir yang tinggi dapat menyebabkan kolom cepat rusak atau
tersumbat.
- Kolom dapat dilengkapi dengan oven dan pengendali suhu kolom
untuk memperbaiki resolusi dan memperpendek waktu analisa. Hindari
Sistem dan Radas KCKT (Lanjutan)
4. Detektor :
- Memantau analit yang dipisahkan kolom dan memberi respon
adanya analit yang keluar dari kolom.
- Syarat detektor :
- Sensitifitas tinggi, stabil, noise/derau rendah.
- Keberulangan baik dan rentang linieritas luas.
- Tidak dipengaruhi oleh perubahan suhu.
- Jenis detektor :
- Tipe G (General) : tidak spesifik dan tidak selektif
misalnya detektor indeks bias untuk gula dan detektor
spektroskopi massa.
- Tipe S (Spesifik) : spesifik dan selektif misalnya detektor
optik (UV-VIS dan fluoresensi) dan detektor elektrokimia
(detektor konduktometri dan amperometri).
Kromatogram Data :
tR: waktu retensi (retention time)
 (parameter kualitatif)

tR-1
Respon Detektor

Luas puncak = Peak area

tR-2  parameter kuantitatif

Tinggi puncak (Peak height)

waktu parameter kuantitatif

Width = lebar puncak

Retention volume (VR)
VR = tR × F Relative Retention Time (RRT) = tR2/tR1
Tailing, Fronting & Symmetry Peak

a b
 Tailing Factor (USP)
Tailing Factor (Tf) = Symmetry Factor (As)
– Dihitung pada posisi 5% dari tinggi maksimum puncak

Tf = 1.0  Puncak simetri

Tf < 1.0  fronting
Tf > 2.0  tailing
1. Waktu Retensi (t R) dan faktor kapasitas (k’)

Waktu retensi adalah waktu yang diperlukan untuk membawa keluar suatu komponen dari
dalam kolom kromatografi sehingga yang keluar dari kolom adalah tepat pada konsentrasi
maksimum.

Faktor Kapasitas (k’) yang juga merupakan ukuran retensi suatu komponen dalam kolom.

k’ = tR – to / to

tR = waktu retensi solut / komponen yang ditentukan

to = waktu retensi solut yang tidak diretensi

Nilai k’ kecil berarti komponen tertahan sebentar dalam kolom (keluar berdekatan dengan
puncak pelarut).

Nilai k’ optimum adalah 2 < k ‘ < 6

Waktu retensi (tR)

Suatu cara untuk

mengarakterisasi
retensi pada
kromatografi yaitu
dengan mengukur
waktu retensi, yang
berbanding terbalik
dengan laju alir
eluen

 waktu retensi/retention time (tR): waktu yang dibutuhkan molekul

yang tertahan pada fase diam untuk mencapai detektor setelah injeksi

 waktu mati/dead time (tM): waktu yang dibutuhkan molekul yang tak
tertahan pada fase diam untuk mencapai detektor setelah injeksi
Waktu retensi (tR)

Waktu retensi dipengaruhi secara fisika dan kimia:

– Kimia (faktor yang mempengaruhi distribusi)
· Fase diam: tipe dan sifat
· Fase gerak: komposisi dan sifat
· Gaya intermolekul
· Suhu

– Fisika (laju, hidrodinamika)

· Laju fase gerak
· Dimensi kolom
 PEMISAHAN 2 PUNCAK
trA
trB
tr‘A
t
tr‘B
B A

t0

Pelarut
Titik WAKTU
Injeksi

PARAMETER :
• Faktor Selektivitas : 
• Resolusi : Rs 71
 FAKTOR SELEKTIVITAS
• FAKTOR SELEKTIVITAS= SELECTIVITY FACTOR = K’B /K’A

• MERUPAKAN UKURAN ATAU SELEKTIVITAS PEMISAHAN DUA

KOMPONEN
• HARGA > 1 BERARTI DUA PUNCAK TERPISAH
• DIPENGARUHI KOMPOSISI FASE GERAK, JENIS FASE DIAM,
TEMPERATUR, PH FASE GERAK
 PEMISAHAN DUA PUNCAK

• HARGA  HARUS > 1

• APABILA  > 1, DAPATKAH DIRAMALKAN
SUDAH TERJADI PEMISAHAN YANG
SEMPURNA ?

73
FAKTOR PEMISAHAN 
PUNCAK A DAN B PUNCAK C DAN D
trA = 5 menit trC = 5 menit
trB = 4 menit trD = 4 menit
t0 = 1 menit t0 = 1 menit

k’A = (5-1)/1 k’C = (5-1)/1

k’B = (4-1)/1 k’D = (4-1)/1

AB = 1,33 CD = 1,33

74
 B A

1 4 5

D C

1 4 5
75
 k‘B

k‘A DENGAN PERJANJIAN k‘B > k’A
=

HARGA  HARUS BAGAIMANA ?

DAPATKAH  MERAMALKAN TERJADINYA PEMISAHAN
YANG SEMPURNA ?

B A

1 2

 KEDUANYA SAMA  trA = 2 mnt. ; trB = 1 mnt

PUNCAK LEBAR ATAU SEMPIT

DITENTUKAN OLEH EFISIENSI KOLOM 76

 EFISIENSI KOLOM
LEBAR SEMPIT- NYA SUATU PUNCAK DITENTUKAN OLEH:
EFISIENSI KOLOM

• Pelat teoretis = Theoretical Plates (N)

• Tinggi pelat = Plate Height (H) = HETP (High equivalent to a
Theoretical Plate)
 Untuk menunjukkan efisiensi kolom
N = L/H
L = panjang kolom 77
 EFISIENSI KOLOM
Isyarat detektor

N = 16 (tr/W)2

tr waktu
0 W

L
HETP =
N
78
HUBUNGAN ANTARA N DAN HETP
N = 16 ( tr /w ) 2

HETP = L / N
KOLOM AKAN MAKIN EFFISIEN APABILA:

N >>>>
atau
HETP <<<<< 79
 Nilai N tergantung bentuk puncak
Peak A Peak B

WA WB
Nilai N dipengaruhi:
• Bentuk puncak
• Jika puncak ramping, nilai w (lebarpuncak) kecil sehingga nilai N besar
• Jika puncak tailing  Nilai N menurun
• Waktu retensi
• Makin besar waktu retensi  N makin besar
• Makin panjang kolom yang digunakan, nilai N bertambah besar
 RESOLUSI (RS)

• MENUNJUKKAN KEMAMPUAN
SEBUAH KOLOM UNTUK
MEMISAHKAN DUA ANALIT
• RS  DUA PUNCAK TERPISAH
DENGAN BAIK
 Meningkatkan resolusi
· Untuk resolusi yang baik dalam
pemisahan, tiga istilah dapat
dioptimumkan

· Meningkatkan k (faktor retensi)

– Mengubah suhu (KG)
– Mengubah komposisi fase gerak (KC)
· Meningkatkan  (faktor selektivitas)
– Mengubah fase gerak
– Mengubah suhu kolom
– Mengubah fase diam
· Meningkatkan N (jumlah pelat teoretis)
– Mengganti kolom dengan yang lebih panjang (KG)
– Menggunakan kolom dengan ukuran partikel fase
diam (KC)
IDENTIFIKASI β-ARBUTIN, HIDROKINON DAN
RESORSINOL DALAM PRODUK KOSMETIK SECARA
KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT)
Pelarut I : Metanol, Pelarut II : Asam Formiat 0,1%
Sejumlah lebih kurang 1 g sampel ditimbang saksama dalam erlemenyer, kemudian
ditambahkan sekitar 10 mL pelarut I, lalu sonikasi 15 menit. Dipipet 1 mL larutan tersebut
dimasukkan ke dalam tabung sentrifuga, lalu ditambahkan pelarut II sampai 10 mL, kemudian
disentrifuga dengan kecepatan 3500 rpm selama 15 menit. Beningan disaring dengan penyaring
membran berukuran 0,45 µm
Larutan uji dan baku diinjek 20 µLberurutan ke KCKT
Kolom berisi fenil, ukuran 250 x 4,6 mm, ukuran partikel: 5 µm.
Fase Gerak Asam Formiat 0,1% - Metanol (95:5). Elusi Isokratik. Laju alir 1 ml/ menit
Deteksi UV 270 nm
RUNNING HPLC

Gunakan eluen dengan grade HPLC. Eluen disaring dan disonikasi

Lakukan kondisioning
Pastikan tidak ada gelembung pada syringe
Injek dimulai dari pelarut, dilanjutkan dengan uji kesesuaian sistem
Uji Kesesuaian Sistem: RSD waktu retensi, RSD area, resolusi, dll
Di antara sampel sisipkan pelarut
Rekam waktu retensi dan luas area
Lakukan interpretasi data
Verifikasi HPLC

Auto injector (perlu dicek volumenya)

Laju Alir
Komposisi Fase Gerak
Presisi
Linieritas
IDENTIFIKASI β-ARBUTIN, HIDROKINON DAN
RESORSINOL DALAM PRODUK KOSMETIK SECARA
KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT)
PENETAPAN KADAR CHLOROPHENE
DALAM KOSMETIK SECARA KROMATOGRAFI CAIR
KINERJA TINGGI
Pustaka: Journal of AOAC International Vol. 84, No. 3, 2001 815
Larutan Uji: sejumlah 1 g sampel ditimbang saksama ke dalam labu tentukur 25-ml. Ditambahkan lebih
kurang 10 ml metanol, divorteks selama 1 menit, diencerkan dengan metanol sampai tanda. Larutan
disaring dengan penyaring membran Nylon 0,45μm
Larutan Baku Induk: Sejumlah 12,5 mg baku Chlorophene ditimbang saksama, dimasukkan ke dalam
labu tentukur 25-ml, ditambahkan 10 ml metanol, divorteks selama 1 menit, dan diencerkan dengan
metanol sampai tanda
Larutan Baku Kerja: Larutan baku induk dipipet sebesar 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; dan 5,0 ke dalam labu
tentukur 25-ml terpisah. Diencerkan dengan methanol sampai tanda. Larutan disaring dengan
penyaring membran Nylon 0,45 μm
Larutan uji dan baku diinjek 20 µLberurutan ke KCKT. Kolom berisi C18, ukuran 250 x 4,6 mm, ukuran
partikel: 5 µm.
Fase Gerak Asam Formiat 0,1% - ACN (50:50). Elusi Isokratik. Laju alir 1,5 ml/ menit. Deteksi 284 nm
PENETAPAN KADAR CHLOROPHENE
DALAM KOSMETIK SECARA KROMATOGRAFI CAIR
KINERJA TINGGI
Dibuat kurva antara konsentrasi larutan baku dan luas puncak larutan baku
Tentukan persamaan regresi linier kurva kalibrasi (Y =bX + a)
Kadar Chlorophene (% b/b) dalam sampel dihitung menggunakan rumus :

Persyaratan: Kadar Chlorophene dalam kosmetik tidak lebih dari 0,2%.

PENETAPAN KADAR CHLOROPHENE
DALAM KOSMETIK SECARA KROMATOGRAFI CAIR
KINERJA TINGGI
CONTOH PENETAPAN KADAR CHLOROPHENE
DALAM KOSMETIK SECARA KROMATOGRAFI CAIR
KINERJA TINGGI
Bobot sampel 1,0005 g Persamaan Kurva Baku: Y = 9510,8 X – 1818,5
Area Sampel: 750000
F: 25 mL
Kadar chlorophene dalam sampel (%): ()/ 1,00005 x (25 / 10000) = 0,1975%
18/12/2018 27
Belajar memang
melelahkan, namun masa
depan lebih melelahkan lagi
jika saat ini kita tidak
belajar.