LAPORANPRAKTIKUM MIKROBDANPOTENSINYA

PENGUKURANKADARPROTEIN DENGANMETODEBRADFORD

KHAIRULANAM P051090031/BTK

BIOTEKNOLOGI SEKOLAHPASCASARJANA INSTITUTPERTANIANBOGOR 2010

PENGUKURANKADARPROTEINDENGANMETODEBRADFORD Pendahuluan UjiBradfordadalahsuatuujiuntukmengukurkonsentrasiproteintotaldengansecarakolorimetridalam suatu larutan. Dalam uji Bradford melibatkan pewarna Coomassie Brilliant Blue (CBB) yang berikatan dengan protein dalam suatu larutan yang bersifat asam sehingga memberikan warna (kebiruan). Karena menghasilkan warna, sehingga secara kolorimetri dapat diukur absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometri(LambertBeer)padapanjanggelombang465595nm(cahayatampak).

BahandanMetode BahanyangdigunakanadalahbiakanbakteriBacillussubtilisdanBacillussp.umur18jamdalamlarutan kaldu nutrient yang ditambahkan 1% pati tapioca yang kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit pada suhu 4C. diperoleh supernatant yang kemudian disebut dengan ekstrakenzimkasar(EEK) Reagen Bradford dibuat dengan cara menimbang 0.01 g coomasie brilian blue (CBB) G250 yang kemudian dilarutkan dalam 5 ml etanol 95% (v/v), lalu ditambahkan 10 ml asam fosfor 85% (v/v). Campuran dihomogenkan (dikocok kuat) lalu disaring dengan kertas saring dan disimpan dalam botol gelapdansuhurendah.StokpereaksiBradfordharusdiencerkan5kalisebelumdigunakan.. Larutan standar protein dibuat dengan menimbang 0,01 g BSA (bovine serum albumin) yang kemudian dilarutkan dengan 10 ml H2O steril sehingga diperoleh larutan stok BSA dengan konsentrasi 1000 ppm. Larutan stok dengan konsentrasi 1000 ppm diencerkan dengan melarutkan 0,5 ml larutan stok Gambar1.StrukturmolekulCoomasieBlue

ditambahkan 4,5 ml H2O steril sehingga diperoleh larutan stok BSA 100 ppm. Dari larutan stok tersebut dilakukan pengukuran terhadap standar protein terlarut dengan konsentrasi 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 dan 100 ppm. Kemudian dilakukan pengukuran terhadap standar protein dengan menambahkan 0.1 ml seri larutan standar dengan 5 ml reagen Bradford. Kemudian larutan divortex dan di inkubasi pada suhu ruang selama 1060 menit. Larutan ini memberikan warna biru dan dibaca pada panjang gelombang 595 nm. Dengan menggunakan regresi linear, akan didapatkan persamaan matematik untuk larutan standar protein yang diperoleh dari nilai absorbansi standar, yang akan digunakanpadapengukurankadarproteinterlarut. Pengukuran protein terlarut. Pengukuran sampel dilakukan dengan cara menambahkan 0,1 ml ekstrak enzimkasar dengan5 ml reagenBradforddivortex dandiinkubasipadasuhu ruangselama1060menit. Absorbansi Larutan sampel protein dibaca pada panjang gelombang 595 nm. Dengan persamaan matematik dari kurva standar protein, akan didapatkan kadar protein terlarut yang terkandung dalam larutanekstrakenzimkasar. HasildanPembahasan Dari hasil pembacaan spektrofotometri larutan standar BSA maka diperoleh kurva standar sebagai berikut.

Gambar2.KurvastandarlarutanBSA Dari nilai absorbansi standar BSA, maka diperoleh kurva standar BSA dengan persamaan regresi y = 1.445x + 0.258. Apabila absorbansi sampel adalah 0.360 dan 0.369 dari ekstrak enzim kasar yang

diperoleh dari biakan Bacillus sp. lalu dimasukkan ke dalam persamaan regresi, maka ratarata kadar proteinnya adalah 0.074 mg/ml atau 74 ppm larutan EEK sedangkan untuk ekstrak enzim kasar dari biakan Bacillus subtilis diperoleh absorbansi sampelnya adalah 0.347 dan 0.350, maka ratarata kadar proteinadalah0.063mg/mlatau63ppmlarutanEEK. Oleh karena itu, dari hasil percobaan tersebut dapat diketahui bahwa protein terlarut pada EEK dari biakan Bacillus sp. lebih banyak daripada protein terlarut yang ada pada EEK dari biakan Bacillus subtilis. Kesimpulan 1. KadarproteinterlarutEEKBacillussp.sebesar74ppmsedangkankadarproteinterlarutEEK Bacillussubtilis63ppm. 2. KadarproteinterlarutpadabiakanBacillussp.lebihbanyakdaripadaproteinterlarutyangada padaEEKdaribiakanBacillussubtilis. DAFTARPUSTAKA 1. Bradford MM. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microorganisms quantitiesofproteininutilizingtheprincipleofproteindyebinding.Anal.Biochem72:248254.