Laporan Praktikum Hari/tanggal : Senin/10 Maret 2014

Struktur Fungsi Subseluler Waktu : 08.00-11.00 WIB

PJP : Syaefudin, SSi, MSi
Asisten : Dwi Ayu S
Nazula Rahma S
M. Maftuchin S.




PENENTUAN PROTEIN METODE BRADFORD

Kelompok 26

Navia Belladina G84120059
Khairika Helyuputri G84120093
Saepul Rahmat G84120029





















DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014

PENDAHULUAN
Protein merupakan komponen penting atau komponen utama sel hewan atau
manusia. Protein yang terdapat dalam makanan berfungsi sebagai zat utama dalam
pembentukkan dan pertumbuhan tubuh. Protein merupakan polipeptida yang
mempunyai bobot molekul dari 5000 hingga satu juta (Poedjiadi dan Supriyanti
2007).
Metode analisis protein dapat dilakukan dengan uji kualitatif. Untuk
mengetahui keberadaan atau jenis protein dalam suatu bahan, sedangkan uji
kuantitatif dapat dilakukan untuk mengetahui jumlah kandungan proteindalam
suatu bahan. Beberapa jenis uji yang dilakukan pada protein diantaranya uji
ninhidrin, uji biuret,xantoprotein, Uji Hopkins-Cole, Uji Heller, Uji Koagulasi
Panas, Uji Asam Sulfosalisilat, Uji Orto-Tolidin, Uji Benzidin, Uji Guaiac, Uji
Bradford (Bintang 2010). Uji protein yang digunakan dalam praktikum ialah
penggunaan metode uji Bradford.
Metode Bradford ialah suatu metode yang dapat digunakan untuk
menganalisis kandungan protein di dalam suatu larutan dengan menggunakan zat
warna Coomassie Blue G-250 sebagai pengikat protein (Bradford 1976). Zat warna
tersebut akan mengikat protein dan mengubah warna pada larutan yang
mengandung protein tersebut dari warna kemerahan menjadi warna kebiruan.
Panjang gelombang yang digunakan 595 nm. Hal itu dikarenakan zat warna yang
diikat oleh bagian hidrofobik protein ialah bentuk anionnya yang nilai absorbansi
maksimumnya berada pada panjang gelombang terebut (Bradford 1976). Metode
ini hanya digunakan untuk mendeteksi protein yang memiliki konsentrasi hingga 20
L.
Praktikum bertujuan menentukan kadar protein dalam suatu sampel dengan
metode spektrofotometri dengan menggunakan kurva standar. Praktikum juga dapat
mempraktikan prinsip metode Bradford dalam analisis protein.

METODE PRAKTIKUM
Waktu dan Tempat Praktikum
Praktikum dilakukan pada hari Senin, 10 Maret 2014 pukul 08.00-11.00 WIB
di Laboratorium Pendidikan-1 Biokimia, Departemen Biokimia Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor, Dramaga,
Bogor.
Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan dalam percobaan ini adalah spektrofotometer 20,
neraca analitik, gelas piala, dan pipet. Bahan-bahan yang digunakan pada
praktikum ini antara lain reagen Bradford, BSA,NaCl, dan sampel protein.
Prosedur Percobaan
Pembuatan kurva standar. Dua belas tabung reaksi yang bersih dan
kering di siapkan. Kemudian pada tabung 1, dicampurkan larutan BSA 0L dan
NACL 100L. Tabung 2 dicampurkan larutan BSA 10L dan NaCl 90L. Tabung
3 dicampurkan larutan BSA 20L dan NaCl 80L. Tabung 4 dicampurkan larutan
BSA 30L dan NaCl 70L. Tabung 5 dicampurkan larutan BSA 50L dan NaCl
50L. Tabung 6 dicampurkan larutan BSA 100L dan NaCl 0L. kemudian,
tambahkan 5 ml reagen Bradford pada setiap tabung, lalu dikocok dan dibiarkan
selama selang waktu lima menit hingga satu jam. Pada tabung 1, digunakan sebagai
larutan blanko. Kemudian, baca pada absorbans 595nm untuk setiap tabung.
Terakhir, kurva standar dibuat antara absorbans 595nm dan rata-rata konsentrasi
protein.
Penentuan konsentrasi protein sampel. Praktikum ini dilakukan dengan
mengencerkan terlebih dahulu 0,5 ml suatu sampel protein dengan 4,5 ml aquades.
Lalu, dipipet kedalam dua tabung reaksi masing-masing sebanyak 0,05 ml dan
2,5ml reagen Bradford. Kemudian kedua tabung larutan diukur nilai absorbannya
dengan menggunakan spektrofotometer.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Berikut adalah hasil percobaan yang dilakukan terhadap pembuatan kurva
standar dan analisis kadar protein.


Tabel 1 Absorbansi kurva standar BSA
Tabung Absorbansi Terukur Absorbansi
Terkoreksi
[BSA]
mg/ml
1 0,694 0 0,0000
2 0,816 0,122 0,1000
3 0,864 0,170 0,2000
4 0,925 0,231 0,3000
5 1,059 0,365 0,5000
6 2,230 1,536 1,0000

Contoh Perhitungan :
Konsentrasi BSA tabung 2
V
1 X
M
1=
V
2 X
M
2
0,01 ml x 1 mg/ml = 0,1 ml x M
2
M
2
= 0,1 mg/ml

Gambar 1 Hubungan konsentrasi BSA dengan Absorbansi

Tabel 2 Analisis kadar protein
Sampel Absorbansi
terukur
Absorbansi
terkoreksi
[Protein] (mg/ml)
1 0,883 0,189 2, 071
2 0,984 0,290 2,743



Contoh Percobaan
Faktor Pengenceran (FP)=

Kadar protein sampel
Y= a + bx
Y = 1.5047x - 0.1227
0,189 = 1.5047x- 0.1227
0,3117 = 1.5047x
x = 0,2071 x FP
x = 0,2071 x 10
x = 2,071 mg/ml
Metode Bradford ialah suatu metode yang dapat digunakan untuk
menganalisis kandungan protein di dalam suatu larutan dengan menggunakan zat
warna Coomassie Blue G-250 sebagai pengikat protein. (Bradford 1976). Prinsip
metode Bradford adalah pengikatan zat warna oleh protein. Zat warna tersebut
akan mengikat protein dan mengubah warna pada larutan yang mengandung protein
tersebut dari warna kemerahan menjadi warna kebiruan. Ikatan yang terjadi antara
zat warna Coomassie Blue G-250 dan protein dapat terjadi dikarenakan adanya
gaya van der walls antara keduanya. Gaya van der walls dapat terjadi karena adanya
bagian protein yang bersifat hidrofobik mengikat bagian dari zat warna Coomassie
Blue G-250( penyusun reagen Bradford) yang bersifat non polar sehingga
mengakibatkan zat warna tersebut melepaskan elektronnya ke bagian hidrofobik
protein. Selain itu, antara zat warna dan protein juga terdapat kekuatan ionik yang
memperkuat ikatan antara keduanya dan membuat zat warna tersebut menjadi
stabil. Hal ini lah yang digunakan pada metode Bradford untuk menentukan kadar
protein di dalam suatu larutan (Bradford 1976).
Reagen Bradford yang digunakan pada percobaan ini dibuat dengan cara
melarutkan 100 mg Coomassie Brilliant Blue G-250 dalam 50 ml etanol 95% dan
100 ml 85% (w / v) asam fosfat. Kemudian diencerkan sampai 1 L dengan akuades.
Reagen harus disaring melalui Whatman no. 1 filter kertas dan kemudian disimpan
dalam botol kuning pada suhu kamar. Reagen yang disimpan harus disaring terlebih
dahulu sebelum digunakan. (Rosenberg 2004)
Penggunaan NaCl digunakan sebagai tamabahan pada larutan Bovine Serum
Albumin (BSA) yang berfungsi sebagai pelarut protein yang akan diukur. Jika NaCl
yang ditambahkan ke dalam larutan Bovine Serum Albumin (BSA) semakin banyak
maka protein yang larut akan semakin banyak pula. Hal ini mengakibatkan
pengompleksanantara protein dan zat warna Coomassie Brilliant Blue G-250dalam
reagen Bradford akan semakin sedikit terjadi. Jadi, jika penambahan NaCl semakin
banyak maka nilai absorbansi larutan tersebut semakin kecil(Khopkar 2007). Pada
tabel 1, dapat terlihat seiring berkurangnya volume NaCl pada tabung satu hingga
tabung enam, nilai absorbansi yang terukur semakin besar. Hal ini sesuai dengan
pernyataan Khopkar. Kesalahan yang terjadi dapat diakibatkan dari pengocokkan
yang belum homogen.
Persamaan garis yang diperoleh dari kurva standar yang menghubungkan
antara nilai absorbansi dengan konsentrasi larutan Bovine Serum Albumin (BSA)
adalah Y= 1,5047x 0,1227dengan r
2
sebesar 0,9209. Ketepatan data dapat dilihat
dari nilai r
2
yang diperoleh. Hal tersebut dapat terjadi karena adanya kesalahan
selama percobaan. Nilai absorbansi sampel ulangan pertama adalah sebesar 0,189
dengan nilai konsentrasi sampel sebesar 2,071 mg/mL. Nilai absorban sampel
ulangan kedua adalah sebesar 0,290 dengan nilai konsetrasi sampel sebesar 2,743
mg/mL. Penentuan kadar protein terlebih dahulu praktikan melakukan pengenceran
larutan. Hal ini disebabkan karena sebelum pengenceran nilai absorbansi semakin
besar. Faktor pengenceran yang didapat adalah 10. Kemudian dikali dengan nilai x
pada persamaan regresi, lalu didapat kosentrasi protein mg/ml.
Selain menggunakan metode Bradford, terdapat berbagai cara dalam
penentuan kadar protein. Refraktori (menyelupkan refraktomer menurut Pulrich)
dengan standar kadar protein n = 0,002/ 1% protein, sangat cepat pelaksanaannya
dan hanya memerlukan sedikit bahan, namun tidak spesifik jadi hanya baik untuk
pengenalan protein. Uji biuret, metode ini untuk penentuan konsentrasi dengan cara
meneteskan protein ke dalam larutan CuSO4 dari berbagai macam konsentrasi.
Penentuan kekeruhan dengan Nephelometer yaitu penentuan intensitas kekeruhan
dengan memberikan standar sulfosalsilat pada larutan protein, namun metode ini
jarang digunakan. Fotometri (reaksi warna), yaitu dengan meneteskan biuret atau
fenol ke dalm larutan protein, reaksi warna akan menjadi biru dari reagenisa biuret
dan reduksi asam heteropoli. Penyisaan basah menurut Kjeldahl merupakan metode
analitik klasik sehingga perlu persiapan lama dan N dari non protein ikut dalam
perhitungan. Selain itu, penentuan kadar protein yang menggunakan dengan metode
Lowry akan memberikan warna biru yang intensitasnya bergantung pada
konsentrasi protein yang ditera. Dalam percobaan kali ini akan digunakan metode
Bradford yang menggunakan suatu pereaksi pewarna yang mampu mengikat
protein di dalam sampel (Kusnawidjaja, 2007).
Keuntungan dari metode ini adalah pereaksi yang digunakan sangat
sederhana serta mudah disiapkan. Selain itu kompleks warna biru pada larutan yang
diberi reagen Bradford sangat cepat terbentuk dan bersifat stabil. Kestabilan warna
biru coomassie ini karena adanya inteaksi antara lapisan hidrofobik dari protein
dengan bentuk anion dari zat warna Coomassie Brilliant Blue G-250 yang
menstabilkan bentuk anion tersebut (adanya gaya van der walls) (Bradford 1976).
Selain itu, uji Bradford juga sangat menguntungkan karena nilai akurasi dan presisi
data yang didapatkan cukup tinggi serta untuk menjamin keakuratan data sampel
yang berada di luar jangkauan dapat dilakukan uji ulang yang hanya membutuhkan
beberapa menit saja. Hal itu membuat keefektifan kerja sangat cepat.
Kelemahan utama metode Bradford adalah reagen khususnya dapat
mengakibatkan perbedaan respon tes untuk jenisprotein yang berbeda. Hal itu
membuat kita harus teliti dalam memilih protein yang akan di ujikan. Sebaiknya
protein yang akan diuji ialah protein yang memberikan nilai absorbansi mendekati
konsentrasi sampel protein yang diujikan. uji ini kurang akurat untuk asam protein
dasar.Selain itu kelemahan lainnya ialah kurangnya sensitivitasterhadap sampel
yang hanya memiliki sedikit kandungan protein.(Bradford 1976)



SIMPULAN
Kadar protein yang didapat adalah pada ulangan pertama 2,071 mg/ml, pada
ulangan kedua 2,743 mg/ml .praktikan menggunakan kurva standar yang digunakan
untuk menentukan konsentrasi sampel yang nilai absorbansinya telah diketahui.
Prinsip metode Bradford ialah pengikatan zat warna Coomassie Blue G-250 dengan
protein.
DAFTAR PUSTAKA
Bintang Maria.2010.Biokimia teknik Penelitian. Jakarta(ID) : Erlangga.
Bradford MM .1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of
microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye
binding. Analitical Biochemistry72 , 248-254.
Khop Rosenberg I.M. 2004. Protein Analysis and Purification: Benchtop
techniques. Massachusetts General Hospital: Bostonkar, S. 2007. Konsep
Dasar Biokimia. Jakarta(ID) : UI Press.
Kusnawidjaja K. 2007. Petunjuk Praktikum Biokimia. Universitas Negeri
Yogyakarta(ID): Yograkarta.
Poedjiadi A dan Supriyanti FMT. 2007.Dasar-Dasar Biokimia Edisi Revisi.
Jakarta(ID): UI Press.