ISOLASI BAKTERI PROTEOLITIK DARI SALURAN PENCERNAAN BAWAL AIR TAWAR (Colossoma macropomum) DAN BAWAL BINTANG (Tranchinotus

blochii) BERBASIS MARKA MOLEKULER GEN 16S rRNA ISOLATION OF PROTEOLYTIC BACTERIA FROM GASTROINTESTINAL RED BELLY PACU (Colossoma macropomum) AND STAR POMFRET (Tranchinotus blochii) BASED MOLECULAR MARKA 16S rRNA GENE Revi Novia Jadris, Kiki Haetami dan Yuniar Mulyani Universitas Padjadjaran ABSTRAK Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi bakteri yang mempunyai aktivitas proteolitik dari ikan bawal air tawar (Colossoma macropomum) dan bawal bintang (Tranchinotus blochii) dengan habitat salinitas yang berbeda dan memverifikasi jenis bakteri proteolitik menggunakan marka molekuler gen 16S rRNA. Metode penelitian menggunakan analisis deskriptif terhadap parameter uji, identifikasi molekuler gen 16S rRNA dan aktivitas proteolitik. Penelitian ini dilaksanakan melalui tiga tahapan, yaitu kultivasi bakteri, uji aktivitas proteolitik dan analisis molekuler gen 16S rRNA. Hasil penelitian didapatkan 10 isolat murni bakteri yang memiliki aktivitas proteolitik, isolat bakteri dengan kode P.2, P.4, PB.4 dan PB.5 menghasilkan indeks proteolitik terbesar. Isolat bakteri dengan kode P.2 menghasilkan indeks proteolitik 2,452 mm, kode P.4 menghasilkan indeks proteolitik 2,671 mm, kode PB.4 menghasilkan indeks proteolitik 1,712 mm dan kode PB.5 menghasilkan indeks proteolitik 1,288mm. Dari hasil karakterisasi molekuler gen 16S rRNA diketahui spesies bakteri pada kode isolat P.2 adalah Pseudomonas aeruginosa, kode isolat P.4 adalah Bacillus sphaericus, kode isolate PB.4 adalah Bacillus cereus dan kode isolat PB.5 adalah Vibrio furnissii. Kata kunci : Bakteri Proteolitik, Bawal Air Tawar , Bawal Bintang, Zona Bening, 16S rRNA

Program Sarjana Perikanan dan Ilmu Kelautan e-mail: arifahmad62@yahoo.com

2 ABSTRACT The objective of this research was to identify the bacteria capable of proteolytic activity of Red Belly Pacu (Colossoma macropomum) and star pomfret (Tranchinotus blochii) with different salinity habitats and to verify the proteolytic bacterial species using molecular markers 16S rRNA gene. Method of research used descriptive analysis of the test parameters, molecular identification of 16S rRNA gene and proteolytic activity. The research was conducted in three stages, that were cultivation of bacteria, proteolytic activity assays and molecular analysis of 16S rRNA genes. The results obtained 10 pure bacterial isolates that have proteolytic activity, isolates bacterial with code P.2, P.4, PB.4 and PB.5 produce proteolytic largest index. Bacterial isolates code P.2 produced the proteolytic index 2.452 mm, code P.4 produce the proteolytic index 2.671 mm, code PB.4 produce the proteolytic index 1,712 mm and code PB.5 produce proteolytic index 1,288 mm. Molecular characterization of the results of 16S rRNA gene analysis obtained bacterial species code P.2 isolate of Pseudomonas aeruginosa, code P.4 isolate of Bacillus sphaericus, code PB.4 isolate of Bacillus cereus and the code PB.5 isolates of Vibrio furnissii. Keywords: Proteolytic Bacteria, Bawal Freshwater, Bawal Star, Zone Bening, 16S rRNA

3 PENDAHULUAN Dewasa ini, produksi perikanan khususnya yang berasal dari hasil penangkapan hampir mencapai titik jenuh, sedangkan permintaan dan kebutuhan ikan baik di dalam negeri maupun permintaan dari pasar dunia cenderung meningkat. Untuk dapat mencapai target produksi perikanan, merupakan maka perikanan bagi budidaya andalan peningkatan lapisan masyarakat mampu membelinya. Akhir-akhir ini muncul ikan jenis baru yang sosoknya mirip bawal laut, tetapi lingkungannya berbeda. Karena kemiripan tersebut ikan ini disebut ikan bawal air tawar (Colossoma macropomum). Rasa daging dan kandungan gizinya tidak kalah dengan bawal laut atau bawal bintang. Pada mulanya ikan bawal diperdagangkan sebagai ikan hias, namun karena pertumbuhannya cepat, dagingnya enak dan dapat mencapai ukuran besar, maka masyarakat pertumbuhan menjadikan yang ikan dan tersebut dapat sebagai ikan konsumsi. Bawal memiliki cepat mencapai ukuran besar. Bawal yang berumur 6 minggu sudah bisa mencapai berat 3 gram, umur 12 minggu bisa mencapai 25 gram, umur 6 bulan sudah mencapai ukuran konsumsi, yaitu 500 gram dan apabila dibiarkan di habitatnya, ikan bawal dapat mencapai berat 30 kg. Ikan dalam bawal air tawar 1998). dan Ikan bawal bawal bintangtermasuk jenis ikan omnivora (Paul Supriatna bintang memakan tumbuhan, udang, ikanikan kecil dan hewan lainnya. Sedangkan ikan bawal air tawar (Colossoma macropomum) bersifat kanibal pada masa kecilnya. Jadi pada saat fase tersebut tidak boleh kekurangan makanan karena sifat kanibalnya akan muncul (Arie 2000). Ikan omnivora bawal dengan termasuk organ ikan pencernaan

produksi perikanan di masa yang akan datang. Kegiatan budidaya terdiri dari budidaya ikan laut dan ikan air tawar. Salah satu budidaya perikanan yang menguntungkan bawal, baik yaitu ikan budidaya bawal ikan bintang

(Tranchinotus blochii) dan ikan bawal air tawar (Colossoma macropomum). Usaha budidaya ikan bawal memiliki prospek yang sangat baik untuk dikembangkan, karena kegiatan ini berperan dalam hal memenuhi kebutuhan ikan konsumsi, peningkatan penghasilan dan penyediaan lapangan kerja bagi masyarakat petani ikan maupun nelayan serta dapat bermanfaat dalam pelestarian sumber daya ikan laut yang mulai langka (Radit, 2011) Ikan bawal bintang (Tranchinotus blochii) merupakan salah satu komoditas perikanan laut yang bernilai ekonomis sangat tinggi. Ikan bawal ini mempunyai daging yang rasanya enak dan kandungan gizinya tergolong tinggi. Namun, karena harganya cukup mahal, tidak semua

4 lengkap yang juga berfungsi sebagai habitat dari bakteri yang hidup di dalamnya. Salah satu bagian dari organ pencernaan adalah usus. Usus merupakan segmen yang terpanjang dari saluran pencernaan ikan (Affandi et al 2004). Menurut Leano et al (2005) jumlah mikroorganisme yang ditemukan dalam usus ikan lebih tinggi dibandingkan dengan insang, lendir pada sisik dan lingkungan perairan sekitarnya. Ikan bawal sebagai salah satu ikan yang memiliki sistem pencernaan yang cukup baik, sehingga memungkinkan terdapatnya bakteri potensial di dalam ususnya. Hal tersebut yang membuat ikan bawal yang berbeda salinitas suatu objek menganalisis habitatnya dijadikan untuk yang dalam bakteri penelitian proteolitik katalik protease Enzim ekstraseluler yang dihasilkan dari bakteri banyak digunakan dalam industri, salah satunya protease karena dihasilkan dalam jumlah besar dan metode ekstraksi cukup mudah (Stanbury & Whitaker 1984). Protease subkelompok enzim, sistein, terdiri berdasarkan yaitu protease atas protease asam empat serin, dan mekanisme

protease logam atau metaloprotease (Rao et al. 1998). Protease serin adalah protease yang berasal dari Bacillus sp. (Fitri et al. 2005). Protease serin atau protease yang memiliki gugus serin pada sisi aktifnya dapat juga dihasilkan oleh A. hydrophilla dan P. aeruginosa (Rao et al. 1998). Protease sistein adalah protease yang memiliki sistein di sisi aktifnya dan sistein tersebut berperan dalam proses katalitik. Contoh dari protease sistein adalah Candida albicans. Protease asam adalah protease yang memerlukan pH rendah untuk aktif serta berfungsi memecah protein. Protease asam biasanya dihasilkan dari bakteri yang berasal dari lambung. Metaloprotease diaktifkan oleh atau ion protease magnesium logam dan

terdapat pada usus. Enzim protease dapat dihasilkan secara intraseluler dan ekstraseluler oleh tanaman, mempunyai hewan dan mikroba penting serta dalam peranan

metabolisme dan regulasi dalam sel (Ward 1983). Bakteri proteolitik adalah bakteri yang memproduksi enzim protease ekstraseluler. Menurut Rao et al.(1998) protease merupakan enzim pengurai yang mengkatalis hidrolisis total protein. Enzim ekstrakseluler disekresikan ke luar sel dan mendegradasi senyawa polimer menjadi senyawa yang lebih sederhana yang mudah larut dan diserap melalui dinding sel.

kalsium ialah berasal dari Citrobacter sp. yang diisolasi dari bagian lambung ikan kerapu lumpur (Ariana et al. 2003). Kendala utama dalam produksi enzim protease oleh mikroba adalah hasil yang sangat sedikit dan masih memerlukan

5 pemurnian. Untuk memperoleh protease dalam jumlah besar diperlukan rekayasa terhadap kondisi proses maupun mikroba itu sendiri. Berdasarkan hal tersebut sebagai langkah awal menuju perbaikan produksi dan sifat-sifat protease, maka dalam penelitian ini dilakukan identifikasi bakteri proteolitik dengan menggunakan amplifikasi gen molekuler 16S rRNA. Penelitian ini juga dapat memberikan informasi tentang keragaman jenis bakteri yang mempunyai aktivitas proteolitik pada saluran pencernaan ikan bawal dengan kondisi salinitas yang berbeda, sebagai upaya untukmenghasilkan enzimprotease. Menurut Baehaki (2011) enzim protease merupakan satu dari tiga kelompok enzim komersial yang diperdagangkan sebagai katalisator hayati dan dimanfaatkan dalam berbagai aplikasi industri pangan dan nonpangan. Tujuan Penelitian Berdasarkan latar belakang penelitian yang telah diuraikan, tujuan penelitian ini adalah: 1. Mendapatkan isolat murni bakteri yang mempunyai aktivitas proteolitik dari saluran usus ikan bawal air tawar (Colossoma macropomum) dan bawal bintang (Tranchinotus blochii). 2. Identifikasi bakteri dari ikan bawal dengan habitat salinitas yang berbeda. BAHAN DAN METODE PENELITIAN Lokasi Penelitian Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Bioteknologi Perikanan dan Kelautan Fakultas Perikanan dan Ilmu 2. 3. Menguji aktivitas proteolitik pada

medium agar dan susu skim dan memverifikasi menggunakan marka molekuler gen 16S rRNA. Kegunaan Penelitian Hasil penelitian ini diharapkan mampu memberikan informasi tentang peranan enzim protease yang berasal dari saluran pencernaan Bawal air tawar (Colossoma macropomum) dan bawal bintang (Tranchinotus blochii) dimana dengan adanya enzim protease proses pencernaan akan lebih optimal dan tingkat penyerapan makanan oleh ikan akan lebih efisien selain itu juga dapat digunakan untuk keperluan industri dan probiotik. Hipotesis Berdasarkan kerangka pemikiran di atas, hipotesis yang diajukan dalam penelitian ini adalah:
1.

Terdapat bakteri yang mempunyai aktivitas proteolitik dalam saluran pencernaan ikan bawal air tawar (Colossoma macropomum) dan Ikan bawal bintang (Tranchinotus blochii). Terdapat perbedaan dominansi keragaman bakteri dari ikan bawal dengan habitat salinitas yang berbeda.

6 Kelautan Universitas Padjajaran. Sampel usus ikan di peroleh dari dari dua tempat yang berbeda. Bawal air tawar didapat dari Balai Pengembangan Produksi Budidaya Air Tawar Tasik (BPPBAT) dan bawal bintang didapat dari Muara Angke Jakarta. Prosedur Penelitian Sterilisasi Alat dan Medium Sebelum ataupun melakukan bakteri, isolasi perlu pemurnian Menyimpan dalam inkubator pada suhu 37 C selama 24 jam Pemurnian bakteri Mengambil bakteri yang telah murni. Mengambil koloni bakteri yang terpisah Menyeleksi koloni bakteri yang akan dimurnikan warna dan berdasarkan pada bentuk, lainnya. kemudian kenampakkan jarum ose

Mengambil bakteri yang akan dimurnikan menggunakan memindahkan bakteri yang telah diambil ke cawan petri yang berisi medium agar lain menggunakan metode gores. Menutup cawan petri dan melapisinya dengan plastic wrap. Proses tersebut diulangi

dilakukan sterilisasi alat guna mencegah kontaminasi dari alat ataupun medium yang digunakan. dengan menggunakan oven. Kultivasi Bakteri dan Pemurnian Sampel usus yang telah diambil kemudian diukur derajat keasamannya pada bagian pyloric caeca. Bagian usus yang termasuk pyloric caeca ditambahkan dengan NaCl fisiologis kemudian digerus dengan menggunakan sumpit dalam tabung ependorf. Memasukkan sampel yang telah digerus kedalam tabung reaksi yang berisi 90 ml NaCl fisiologis. Homogenkan selama 2 menit kemudian mengambil 1,0 ml larutan menggunakan mikropipet dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi kedua. Begitu seterusnya hingga pengenceran 10-7. Memasukan kedalam cawan petri yang telah berisi medium agar dan susu skim. Meratakan menggunakan L Glass Menutup cawan petri dan lapisi dengan plastik wrap.

hingga mendapat isolat murni dimana hanya terdapat bakteri yang sama dalam isolat tersebut. Uji Aktivitas Proteolitik Setelah didapat isolat tunggal dilakukan uji aktivitas proteolitik. Uji skrining ini dilakukan pada media agar dengan tambahan TSB, susu skim dan tepung kedelai dari volume agar. Pada pengujian ini dilihat zona bening yang dihasilkan. melalui Pengujian beberapa ini dilakukan yaitu tahapan,

mengambil bakteri yang ada pada isolat tunggal menggunakan jarum ose lalu memindahkan bakteri menggunakan jarum ose kedalam cawan petri lain yang berisi medium agar + susu skim. Melakukan kultivasi bakteri selama 2X24 jam.

7 Mengamati dan mengukur luasan zona bening yang dihasilkan. Zona bening merupakan respon dari bakteri terhadap TSB dan susu skim serta tepung kedelai yang ditambahkan dalam medium. Dari seluruh isolat tunggal yang diuji aktivitas proteolitik, diambil sampel yang menghasilkan 5 indeks dipindahkan setiap kultur kedalam tabung ependorf 1,5 ml dan dilakukan sentrifugasi selama 2 menit dengan kecepatan tinggi (13.000 rpm) dengan mikrocentrifuge. Selanjutnya mengambil pellet DNA dari hasil sentrifugasi. Menambahkan 480 l 50 mM EDTA. Menambahkan 120 l Lysozyme kemudian inkubasi selama 45 menit pada suhu selama 37C 2 kemudian dengan sentrifugasi menit

proteolitik terbesar (Indeks proteolitik = rata-rata diameter zona bening : rata-rata diameter bakteri). Kedua sampel tersebut kemudian dilanjutkan dengan identifikasi secara molekuler. Analisis Molekuler 16S rRNA Analisis molekuler 16S rRNA dimaksudkan untuk mengidentifikasi lima isolat bakteri yang memiliki aktifitas proteolitik tertinggi. Tahapan ini meliputi: Kultur Cair Bakteri Sebelum melakukan isolasi DNA genom dari bakteri, dilakukan kultur cair untuk perbanyakan bakteri dengan tahapan sebagai untuk berikut kultur Menyiapkan cair (Nutrient medium Broth).

kecepatan 13000 rpm. Mengambil pellet DNA dari hasil sentrifugasidan tambahkan Nuclei Lysis Solution. sebanyak 600 l kedalam setiap tabung kemudian homogen dengan cara up down menggunakan mikropipet, inkubasi pada suhu 80C selama 5 menit. Menambahkan 3 l RNase Solution kemudian inkubasi selama 15-60 menit pada suhu 37C. Selanjutnya tammbahkan 200 l Protein Precipitation Solution, vortex kemudian inkubasi pada suhu -20C selama 5 menit dan disentrifugasi 1300016000 rpm selama 3 menit. Memindahkan supernatant ke tube yang steril sebanyak 600 l tambahkan isopropanol kemudian dihomogenkan. Melakukan sentrifugasi dan membuang supernatan. Pellet dari hasl sentrifugasi ditambahkan 600 l dengan kecepatan ethanol 70% dan 13000-16000 rpm dihomogenkan. Melakukan sentrifugasi selama 2 menit. Lalu tambahkan etanol dan keringkan pellet selama 10-15 menit. Setelah kering tambahkan Rehydrate

Memindahkan isolat yang telah dipilih untuk dilakukan analisis molekul dalam medium 37C. Isolasi DNA genom bakteri Metode isolasi DNA genom bakteri menggunakan Promega kit yaitu bakteri hasil kultur cair dalam medium Nutrien Broth yang telah keruh dilakukan Nutrien Brotth selanjutnya diinkubasi selama 24 jam dengan suhu

8 solution 50 l dan inkubasi pada suhu 65C selama 1 jam. Amplifikasi DNA dengan Primer Gen 16S rRNA Amplifikasi gen pengkode 16S rRNA sekuen dilakukan gen 16S dengan rRNA Polymerase yang akan Chain Reaction (PCR) untuk mendapatkan digunakan sebagai bahan sekuensing untuk menentukan jenis bakteri. Primer yang digunakan adalah primer universal 16S rRNA 1492R dengan urutan 9F dan (GAGTTTGATCCTGGCTCAG) dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekuler. Adapun tahapan untuk melakukan elektroforesis sebagai berikut: Persiapan Elektroforesis Membuat gel agarose (Konsentrasi 1 %) dan melarutkannya pada TBE buffer lalu memanaskannya di atas hot plate. Menuangkan gel yang masih dalam keadaan panas dan cair ke atas lempeng (plate).. Menancapkan lembaran Perspex tipis yang berbentuk menyerupai sisir saat agar masih dalam keadaan panas dan belum memadat setelah memadat kemudian mencabut lembaran Perspex yang berbentuk sisir saat agarose telah memadat hingga membentuk sumur untuk memasukkan sampel hasil produk PCR. Memasukkan gel agarose yang telah padat ke dalam suatu tangki yang berisi buffer TBE Pelaksanaan Elektroforesis Memasukan hasil amplifikasi DNA dan marker pada setiap sumurm kemudian menutup tangki dan mulai running elektroforesis dengan menghubungkan alat elektroforesis pada sumber listrik (Power merupakan teknik Supply). Sisi yang berisi hasil amplifikasi diberi menit. arus negatif. Selanjutntya Besarnya arus elektroforesis yaitu 75 volt selama 60 melakukan perendaman dengan Etbr selama 10-15 menit. Melakukan perendaman kembali

(GGCTACCTTGTTACGACTT)

(Sadi, 2009). Komponen reaksi PCR dan siklus PCR yaitu Nuclease Free Water 10,5 ul, Promega Master Mix 12,5 ul, Primer Forward 0,5 ui, Primer Reverse 0,5 ul dan DNA template 1 ul. Pengaturan program PCR yaitu Pre-PCR (95C, 2 menit), denaturasi (95 C, 30 detik), Annealing (55 C, 30 detik), elongasi (75 C, 1 menit) dan PostPCR (75 C, 5 menit) Jumlah siklus polimerasi DNA sebanyak 30 siklus (Lewaru, 2012). Elektroforesis Elektroforesis pemisahan molekuler berdasarkan atas ukurannya menggunakan medan listrik yang dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan

9 dengan akuades untuk mencuci sisa Etbr. Setelah selesai gel diangkat dengan menggunakan spatula dan ditiriskan. Dalam proses elektroforesis produk amplifikasi digunakan DNA Ladder 1 kb (Biolabs) terdiri dari fragmen mulai dari 500 sampai 10.000. Amplifikasi PCR menggunakan primer 16S RNA yang memiliki daerah target amplifikasi 1.500 bp. Analisis Bioinformatik Produk gen 16S rRNA ditempatkan dalam 30 ml nuclease free water pada suhu 4 C selama 24 jam. Produk gen 16S rRNA kemudian dipurifikasi dan dipilih empat isolat terbaik untuk dilanjutkan ke tahap sequencing. Hasil sequencing DNA dianalisis menggunakan perangkat bioinformatik kemudian diolah secara manual dan dicocokkan dengan data di www.ncbi.nih.nim.gov melalui program BLAST untuk menentukan jenis dari 4 isolat tersebut dari database Genbank yang ada. HASIL DAN PEMBAHASAN Isolasi dan Pewarnaan Gram Bakteri Tahapan awal proses isolasi bakteri yaitu melakukan penggerusan usus bagian pyloric caeca, pengenceran, penanaman bakteri pada media agar dan dilakukan pemurnian bakteri hingga memperoleh koloni tunggal. Berdasarkan hasil isolasi bakteri usus ikan bawal air tawar bawal (Colossoma macropomum) didapat empat isolat bakteri yang memiliki aktivitas proteolitik. Bobot atau berat bawal air tawar yang digunakan adalah 76,95 g dengan panjang 18,5 cm. Berat usus ikan tersebut yaitu 1,3 g dengan panjangnya 20 cm dan derajat keasaman (pH) usus 6,5 (Tabel 1) Sampel bintang berikutnya yaitu ikan (Trachinotus blochii)

dengan berat 550 gram dan panjang ikan 34,5 cm serta derajat keasaman (pH) usus 6, berat usus 3,4 g. Isolasi bakteri usus bawal bintang sama hal nya seperti bawal air tawar yaitu di bagian pyloric caeca dan didapatkan enam isolat bakteri yang memiliki identifikasi aktivitas proteolitik. Hasil menggunakan pewarnaan

bakteri terhadap isolat-isolat tersebut dapat dilihat pada Tabel 2. Tabel 1. Isolat Usus Ikan Bawal Air Tawar Kode Isolat P.1 P.2 P.3 P.4 Warna Koloni Putih Pucat Putih Bening Putih Bening Putih Susu Bentuk Coccus Bacillus Coccus Bacillus Gram + +

10 Tabel 2. Isolat Usus Ikan Bawal Air Tawar Kode Warna Bentuk Gram Isolat Koloni PB.1 Kuning Coccus Pucat PB.2 Putih Bacillus PB.3 Putih Staphyl Bening ococcus PB.4 Putih Bacillus + Susu PB.5 Kuning Bacillus Muda PB.6 Kuning Coccus Uji Aktivitas Proteolitik Pengujian aktivitas proteolitik pada isolat bakteri yang didapat, dilakukan dengan menambahkan susu skim 1% pada medium agar dan TSB (Tripticase Soy Broth). Hal ini berfungsi untuk melihat isolat bakteri dalam membentuk zona bening terhadap protease. Dari empat isolat bakteri yang didapatkan semuanya menghasilkan zona bening yang menunjukkan adanya aktivitas proteolitik. Isolat bakteri P.2 merupakan isolat bakteri yang memiliki nilai indeks proteolitik terbesar, sedangkan bakteri P.1 merupakan isolat bakteri yang memiliki nilai indeks proteolitik terkecil. Besarnya indeks proteolitik berkaitan dengan peningkatan diameter zona hambat yang secara proporsional berhubungan dengan memiliki peningkatan diameter diameter bakteri koloni terbesar bakteri sebagai contoh pada isolat P.2 sehingga menunjukkan zona bening dan indeks proteolitik tertinggi. Hasil isolat 4.3. Karakterisasi Molekuler Isolasi DNA genom menggunakan Wizard Genomic Purification Kit. Isolasi DNA secara umum mempunyai empat tahap, yaitu pemecahan sel, ekstraksi DNA presipitasi DNA dan pencucian DNA. Elektroforesis dilakukan agar dapat melihat DNA genom Kemudian yang telah hasilnya diamplifikasi. 4.3.1. Isolasi DNA Genom Bakteri bakteri aktivitas Tabel 3. Tabel 3. Indeks Proteolitik Isolat Bakteri Ikan Bawal Kode Diamet Diameter Indeks Isolat er Zona Bakteri Proteo Bening litik P.1 4,4445 2,215 2,007 P.2 7,185 2,635 2,727 P.3 3,905 1,895 2,061 P.4 5,435 2,035 2,671 PB.1 60,43 49,05 1,232 PB.2 70,815 65,57 1,079 PB.3 49,57 44,36 1,117 PB.4 18,465 10,78 1,712 PB.5 52,705 40,93 1,288 PB.6 70,57 64,48 1,094 Isolat yag memiliki aktivitas proteolitik pada usus ikan bawal air tawar (Colossoma macropmum) diberi kode isolat P.1, P.2, P.3 dan P.4. Sedangkan isolat dari usus ikan bawal bintang (Trachinotus blochii) diberi kode isolat (PB.1, PB.2, PB.3, PB.4, PB.5, dan PB.6) juga memiliki aktivitas proteolitik. sampel ikan blochii) bawal disajikan bintang dalam

(Trachinotus

penghitungan

proteolitik

menggunakan sinar UV (Gambar 1).

11 etidium-bromida yang digunakan ketika perendaman kurang baik memiliki sehingga kualitas yang menyebabkan

tipisnya pita DNA genom pada hasil elektroforesis.

Gambar 1. Hasil Elektroforesis Isolasi DNA GenomIsolat Bawal Air Tawar Keterangan: P.1 = Isolat Bakteri Kode P.1 P.2 = Isolat Bakteri Kode P.2 P.3 = Isolat Bakteri Kode P.3 M = Marker DNA Ladder 1 kb Gambar 2. Hasil Elektroforesis Isolasi Berdasarkan visualisasi hasil DNA Genom Isolat Bawal Bintang Keterangan: PB.1 = Isolat Bakteri Kode PB.1 PB.2 = Isolat Bakteri Kode PB.2 PB.3 = Isolat Bakteri Kode PB.3 PB.4 = Isolat Bakteri Kode PB.4 PB.5 = Isolat Bakteri Kode PB.5 PB.6 = Isolat Bakteri Kode PB.6 M = Marker DNA Ladder 1 kb 4.3.2. Amplifikasi Gen 16S rRNA Pada tahapan ini, seluruh sampel hasil isolasi DNA genom diambil untuk dilakukan proses amplifikasi PCR menggunakan gen penyandi 16S rRNA. Sampel hasil isolasi DNA genom dari ikan bawal air tawar (Colossoma macropomum) yang diambil untuk dilakukan proses amplifikasi PCR yaitu isolat dengan kode P.1, P.2 dan P.3 (Gambar 3). Untuk isolat P.3 pita yang elektroforesis (Gambar 1), terdapat pita pada semua sampel tetapi sampel dengan kode P.1 tidak begitu terang pada gel elektroforesis. Hal tersebut menunjukkan bahwa konsentrasi DNA genom yang kecil sehingga menyebabkan tipisnya pita DNA genom pada hasil elektroforesis. Sampel dengan kode P.2 dan P.3 pita yang didapat tebal. Semua sampel hanya terdapat satu pita dan tidak menumpuk. Pada hasil isolasi DNA genom ikan bawal bintang, pita DNA genom yang muncul pada semua sampel tidak begitu terang di gel elektroforesis (Gambar 2). Hal tersebut dapat terjadi karena beberapa kemungkinan yaitu konsentrasi DNA genom yang terlalu sedikit atau kualitas

12 didapat tipis sehingga kurang jelas terlihat di kamera. Kemungkinan hal ini terjadi karena DNA template yang diambil pada saat elektroforesis terlalu banyak. Pada Gambar 3, menunjukan bahwa pita dari produk amplifikasi (hasil amplifikasi) berada pada ukuran 1.500 bp sesuai dengan target amplifikasi dari primer 16S rRNA yang digunakan. Sehingga sampel hasil amplifikasi tersebut dapat dilanjutkan ketahap selanjutnya yaitu sekuensing. Dilihat dari pita yang diperoleh dari produk amplifikasi tersebut maka P.1 dan P.2 yang merupakan isolat terbaik dan akan dilanjutkan ke tahap sekuensing. Sebelum terlebih dahulu dilakukan dilakukan sekuensing, purifikasi

produk amplifikasi oleh 1st BASE (Gambar 4). Hasil purifikasi produk amplifikasi menunjukan bahwa pita produk amplifikasi yang akan disekuensing berada pada ukuran 1.500 bp.

Gambar 4. Hasil Purifikasi Produk Amplifikasi oleh 1st BASE Keterangan: 1. Kode Bakteri P.2 2. Kode Bakteri P.1 Berdasarkan hasil purifikasi untuk isolat P.1 tampak adanya multiple band Gambar 3. Elektroforesis Hasil Amplifikasi Gen 16S rRNA (Colossoma macropomum) Keterangan: P.1 = Hasil Amplifikasi 16S rRNA Isolat Bakteri kode P.1 P.2 = Hasil Amplifikasi 16S rRNA Isolat Bakteri Kode P.2 P.3 = Hasil Amplifikasi 16S rRNA Isolat Bakteri Kode P.3 M = Marker DNA Ladder 1 kb dan diduga isolat tersebut belum tunggal. Pita pada isolat P.1 tida konsisten sehingga isolat tersebut tidak dilanjutkan ke tahap sekuensing. Selanjutnya dilakukan optimasi kembali pada isolat P.4 untuk mendapatkan dua isolat terbaik pada sampel bawal air tawar. Untuk isolat P.2 hasil yang didapat hanya satu pita

13 sehingga dapat dilanjutkan ke tahap sekuensing. Hasil purifikasi produk amplifikasi isolat P.2 dan P.4 menunjukan bahwa pita produk amplifikasi berada pada ukuran 1.500 bp sehingga dapat dilanjutkan ke tahap sekuensing. tawar (Colossoma macropomum). Dari semua isolat pita yang didapat hanya satu dan jika diperhatikan berdasarkan visualisasi pita tersebut dapat terlihat jelas. Berdasarkan gambar terlihat bahwa pita dari produk PCR (hasil amplifikasi) berada pada ukuran 1.500 bp sesuai dengan target amplifikasi dari primer 16S rRNA yang digunakan. tahap Sehingga sampel hasil amplifikasi tersebut dapat dilanjutkan ke selanjutnya yaitu sekuensing. Pemilihan isolat yang akan disekuensing berdasarkan dari bentuk bakteri yang sangat berbeda diantara yang lainnya ketika dilakukan pewarnaan gram maka dipilih PB.4 dan PB.5. Gambar 5. Elektroforesis Hasil Amplifikasi Gen 16S rRNA (Trachinotus blochii) Keterangan: PB.3 = Hasil Amplifikasi 16S rRNA Isolat Bakteri Kode PB.3 PB.4 = Hasil Amplifikasi 16S rRNA Isolat Bakteri Kode PB.4 PB.5 = Hasil Amplifikasi 16S rRNA Isolat Bakteri Kode PB.5 PB.6 = Hasil Amplifikasi 16S rRNA Isolat Bakteri Kode PB.6 M = Marker DNA Ladder 1 kb Pada Gambar 5, sampel hasil isolasi DNA genom ikan bawal bintang (Trachinotus blochii) yang diambil untuk dilakukan proses amplifikasi PCR yaitu isolat dengan kode PB.3, PB.4, PB.5 dan PB.6. Isolat tersebut dipilih berdasarkan koloni bakteri yang sangat berbeda dengan koloni bakteri yang diisolasi dari bawal air Gambar 6. Hasil Purifikasi Produk Amplifikasi oleh 1st BASE Keterangan: 1. Kode Bakteri PB.4 2. Kode Bakteri PB.5 Hasil purifikasi produk amplifikasi untuk isolat PB.4 dan PB.5 menunjukan bahwa pita produk amplifikasi yang akan disekuensing berada pada ukuran 1.500 bp (Gambar 6).

14 Analisis Hasil BLAST Penggunaan pensejajaran berganda ini bertujuan untuk mensejajarkan dan mencocokan hasil sekuensing yang diperoleh dari sampel penelitian dengan data yang telah ada di GeneBank. Analisis hasil BLAST atau tersebut bakteri memberikan apa yang informasi dan memverifikasi mengenai organisme mempunyai kesamaan dengan urutan DNA sampel sehingga dapat digunakan untuk identifikasi bakteri. Informasi dari hasil BLAST tersebut berupa score, Query Coverage dan Maximum identity. Score adalah jumlah keselarasan semua segmen dari urutan database yang cocok dengan urutan nukleotida. Query coverage adalah persentasi dari panjang nukleotida yang selaras dengan database yang terdapat pada BLAST. Max identity adalah nilai tertinggi dari persentasi identitas atau kecocokan et al, 1990) Berdasarkan hasil pensejajaran berganda, isolat P.2 menunjukkan bahwa terdapat empat spesies memiliki score yang besar diantara yang lainnya Pseudomonas otitidis dengan yaitu Query antara sekuen query dengan sekuen database yang tersejajarkan (Miller 97% dan max ident stutzeri 90% serta

Pseudomonas

(accession

NR_041715.1) dengan Query Coverage 97% dan max ident 90%. Semakin besar score maka semakin besar kemungkinan kesesuaian/homologinya. Isolat P.2 yang memiliki otitidis score hasil BLAST dengan yang Query tertinggi adalah bakteri Pseudomonas ditunjukkan Coverage 97% dan max ident 92%. Berdasarkan hal tersebut maka isolat P.2 kemungkinan dilakukan besar adalah bakteri (2012) Pseudomonas otitidis. Penelitian yang oleh Kyungwong memberikan hasil bahwa Pseudomonas otitidis (Gen Bank accession AY953147) 100% sekuen sama 16S dengan rRNA, dengan Pseudomonas analisis sehingga gen pada aeruginosa berdasarkan

penelitian ini Pseudomonas otitidis juga disamakan Pseudomonas aeruginosa. Data hasil BLAST NCBI isolat P.4 menunjukkan bahwa terdapat empat spesies bakteri yang memiliki score lebih besar diantara yang lainnya yakni Lysinibacillus NR_074883) sphaericus (accession dengan Query Coverage

83% dan max ident 82%, Lysinibacillus fusiformis dengan Query Coverage 83% dan max ident 82%, Lysinibacillus NR_042073.1) sphaericus (accession

Coverage 97% dan max ident 92%, Pseudomonas aeruginosa dengan Query Coverage 97% dan max ident 91%, Pseudomonas stutzeri (accession NR_074829.1) dengan Query Coverage

dengan Query Coverage 83% dan max ident 81% serta Acetobacter pasteurianus dengan Query Coverage 81% dan max

15 ident 81%. Isolat P.4 kemungkinan besar merupakan yang tertinggi. Berdasarkan hasil pensejajaran menunjukkan berganda isolat PB.4, bakteri Lysinibacillus sphaericus dilihat dari score hasil BLAST kesesuaian/homologi menyatakan bahwa yang tingkat tinggi. kesamaan

Khumaida dkk dalam Addinilia (2012) nukleotida sekitar 80% sudah termasuk cukup tinggi. Hasil yang diperoleh dengan pensejajaran berganda dengan data Gen Bank memberikan informasi mengenai bakteri yang mempunyai kesamaan dengan urutan DNA sampel sehingga dapat digunakan untuk mengidentifikasi bakteri. Potensi Proteolitik Pseudomonas aeruginosa dan Lysinibacillus sphaericus Pada Ikan Bawal Air Tawar (Colossoma macropomum) Pseudomonas aeruginosaa adalah bakteri berbentuk batang, berwarna merah muda, merupakan bakteri gram negatif yang berukuran 0,5-1,0 m. Bakteri Pseudomonas termasuk golongan bakteri mesofil, bakteri tersebut dapat tumbuh optimal pada kisaran 2530C dengan suhu optimum 40C (Puspitasari et al, 2012). Pseudomonas aeruginosa (1997) dapat sp dapat menyebabkan konjungtivitis akut kecuali Pseudomonas dan (Siswandono Pseudomonas mendegradasi dan Soekardjo, 1995). Menurut Takenaka Watanabe aeruginosa

bahwa terdapat empat spesies memiliki score yang besar diantara yang lainnya yaitu Bacillus Bacillus cereus, Bacillus dan Keempat sama thuringiensis, Bacillus anthracis

weihenstephanensis. yang

spesies bakteri tersebut memiliki tingkat kesesuaian/homologi ditunjukkan Query Coverage 93% dan max ident 75%. Isolat PB.4 kemungkinan besar merupakan bakteri Bacillus cereus atau Bacillus thuringiensis dilihat dari score hasil BLAST yang tertinggi. Data hasil BLAST NCBI bahwa isolat terdapat PB.5 empat menunjukkan

spesies bakteri yang memiliki score lebih besar diantara yang lainnya yakni Vibrio furnisii dengan Query Coverage 97% dan max ident 95%, Vibrio fluvialis dengan Query Coverage 94% dan max ident 96%, Vibrio hepatarius dengan Query Coverage 97% dan max ident 94% serta Vibrio fulnivicus dengan Query Coverage 94% dan max ident 95%. Isolat PB.5 kemungkinan besar merupakan bakteri Vibrio furnisii dilihat dari score hasil BLAST yang tertinggi. Berdasarkan data hasil BLAST semua isolat yang didapat memiliki

mikrosistin. Mikrosistin adalah toksin yang diproduksi oleh genus Microcystis yang merupakan senyawa siklopeptida dan dapat menyebabkan blooming (Christoffersen et al. 2002). Pseudomonas

16 aeruginosa, adalah multifungsi karena dapat bertindak sebagai Purin spesifik, berperan dalam pemeliharaan bentuk sel dan diperlukan untuk pertumbuhan dalam lingkungan rendah osmolaritas (Rawling et al,1998). Pseudomonas aeruginosa adalah produsen lendir. mengambil Pembentukan nutrisi dan lendir yang dapat menyebabkan gaya adesi interseluler, melindungi bakteri terhadap efek buruk dari antibiotik (Donlan dan Costerton, 2002). Menurut Jaret (2004) Pseudmonas aeruginosa bersifat termasuk atau protease yang logam metaloprotease. yang sphaericus adalah organisme lingkungan umum yang menghasilkan racun insektisida mirip dengan yang dihasilkan oleh Bacillus thuringiensis. Nama lain untuk organisme ini adalah Bacillus sphaericus (Hu et al, 2008). Menurut Hue et al (2008) Bacillus sphaericus memiliki enzim proteolitik yang melimpah. B. sphaericus telah terbukti sangat toksik terhadap larva nyamuk, tetapi aman terhadap parasit dan pemangsanya, tidak mencemari lingkungan dan tidak berbahaya bagi manusia dan hewan lainnya. Lysinibacillus melepaskan sphaericus endotoksin yang digunakan sebagai insektisida karena spora merupakan salah satu jenis protease dapat membunuh larva nyamuk. Bakteri ini digunakan dapat secara komersial ke air untuk tempat mengendalikan populasi nyamuk. Bakteri ditambahkan perkembangbiakan nyamuk atau dapat disemprotkan di udara dalam bentuk cair. Oleh karena itu Bacillus sphaericus dapat dikembangkan sebagai bio-insektisida dan tampaknya memberi harapan baik sebagai alat pengendali nyamuk vektor penyakit, khususnya terhadap vektor demam berdarah dan malaria (Salamun, 1995). di Indonesia

Protease yang dihasilkan Pseudomonas aeruginosa dengan substrat yang khusus mempunyai banyak manfaat di luar bidang perikanan yaitu untuk industri makanan hewan dan minuman dalam kemasan kaleng, produksi asam amino. Dalam biokimia dapat digunakan untuk isolasi sel dari berbagai jenis jaringan tersebut hewan. dapat Sehingga al. 2002). Lysinibacillus sphaericus adalah bakteri gram-positif, mesofilik, bakteri berbentuk batang. Lysinibacillus sphaericus dapat membentuk endospora aktif yang tahan terhadap panas, bahan kimia, dan sinar ultraviolet. Spora ini dapat bertahan hidup untuk waktu yang lama (Boudko et al, 2001). Lysinibacillus enzim

dimanfaatkan secara komersial (Gupta et

17 Potensi Proteolitik Bacillus cereus dan Vibrio furnissii Pada Ikan Bawal Bintang (Trachinotus blochii) Bacillus cereus merupakan bakteri gram-positif, berbentuk batang, aerob fakultatif (dapat menggunakan oksigen tetapi dapat juga menghasilkan energi secara anaerobik), dan dapat membentuk spora (endospora). Menurut Baehaki (2011), Bacillus sp merupakan salah satu jenis bakteri yang memiliki kemampuan untuk menghasilkan protease. Protease merupakan satu diantara tiga kelompok enzim komersial yang diperdagangkan sebagai katalisator hayati. Protease dimanfaatkan dalam berbagai aplikasi industri pangan dan non-pangan. Salah satu industri non-pangan yang memanfaatkan protease adalah industri biodeterjen. Bacillus cereus dapat bersaing dengan dalam usus, mikroorganisme sehingga jumlah lain seperti Salmonella dan Campylobacter kehadirannya mikroorganisme mengurangi berupa hasil ekstraksi enzim akan mudah mengalami biodegradable (Suhartono 2000) sehingga akan ramah lingkungan. Dibidang perikanan sendiri penambahan Bacillus cereus pada pakan ikan dapat mempercepat laju pertumbuhan karena enzim protease yang dihasilkan Bacillus cereus daapat mempercepat penyerapan makanan. Disamping itu ikan yang mengandung Bacillus cereus jika dimakan oleh manusia akan menyebabkan diare oleh karena itu ikan harus disimpan pada suhu <0C terlebih dahulu. Bakteri vibrio adalah bakteri gram negatif yang berbentuk batang bengkok, oksidase dan katalase glukosa positif, tanpa memfermentasikan

menghasilkan gas dan mempunyai flagel polar (Bauman et al., 1994; Barrow dan Feltham, 1993). Bakteri ini sangat umum dijumpai di air payau dan laut. Sebagian bersifat saproba namun ada beberapa spesies yang menyebabkan penyakit vibriosis pada hewan akuatik termasuk ikan. Salah satu kendala dalam budidaya ikan laut adalah serangan penyakit vibriosis yang disebabkan oleh bakteri Vibrio. Salah satu spesies bakteri vibrio tersebut adalah Vibrio furnissii. Penyakit ini merupakan penyakit bakterial utama terutama pada benih yang dapat menimbulkan kematian sampai 100 % dalam waktu 2 minggu. Namun, lain halnya jika bakteri Vibrio furnisii atau

tersebut. Spora Bacillus cereus lebih tahan pada panas kering daripada pada panas lembab dan dapat bertahan lama pada produk yang kering. Menurut Prakash et al (2005) Bacillus cereus merupakan bakteri yang bersifat alkalin protease yang dapat digunakan sebagai bahan aditif dari detergen sehingga memudahkan kerja dari surfaktan dalam melepaskan kotoran yang menempel. Penggunaan bahan yang

18 Bacillus cereus hanya terdapat dalam jumlah sedikit maka tidak akan membahayakan karena bakteri tersebut merupakan bakteri normal yang terdapat pada usus. Menurut Aznar (1994) Vibrio furnissii merupakan bakteri yang tergolong dalam proteobacteria. V. furnissi termasuk bakteri halofilik yang secara alamiah ditemukan pada perairan pantai. Bakteri ini dapat diisolasi dari air, sedimen, plankton atau organisme laut. Vibrio furnissii termasuk bakteri yang relatif ganas. Bakteri ikan yang ini biasanya sidat dapat pada sering fase perut menyerang pendederan rongga menggembung/hidroperitoneum (Tomiyama dan Hibiya, 1977). Keganasan bakteri vibrio berkaitan dengan berbagai jenis protease (Chen et al., 1999; Deane dan Woo, 2000), toksin (enterotoksin, cytotoksin, endotoksin), protein yang terikat dengan permukaan (surface-binding protein) seperti fimbriae dan kapsul, LPS, hemaglutinin, motilitas dengan menggunakan flagella, plasmid dan produksi siderofor (agen penyapit zat besi) yang berfungsi mengikat zat besi dari darah inang (Amaro et al., 1997). Vibrio furnissii juga termasuk bakteri pathogen bagi manusia (Retno, 2008). yaitu Selain sebagai mempunyai kerugian, Vibrio furnissii juga mempunya keuntungan 1. KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan Berdasarkan hasil penelitian ini dapat disimpulkan bahwa: 1. Dari sepuluh Isolat bakteri yang memiliki indeks proteolitik terbesar pada bawal air tawar yaitu isolat P.2 dengan nilai 2,452 mm dan isolat P.4 dengan nilai 2,67 mm. Sedangkan pada bawal bintang yaitu isolat PB.4 dengan nilai 1,712 mm dan isolat PB.5 dengan nilai 1,288 mm. Hasil karakterisasi molekuler dengan gen penyandi 16S rRNA isolat P.2, P.4, PB.4 dan PB.5 mendapatkan hasil urutan basa yang memiliki homologi tertinggi dari data yang ada di Gen Bank yaitu 92%, 82%, 75% dan 95%, sedangkan panjang atau ukuran sekuen query yang selaras dengan database (Gen Bank) yaitu 97%, 83%, 93% dan 97%. probiotik terhadap serangan Vibrio

harveyi pada udang vaname (Litopenaeus vannamei). Uji in vivo menunjukkan bahwa udang yang diinjeksi probiotik dari isolat tantang Vibrio furnissii sebelum diuji dengan V. harveyi memiliki

kelangsungan hidup lebih tinggi daripada control (Sukendaet al, 2005).

menyebabkan

19 2. Isolat P.2 dan P.4 dari sampel bawal air tawar (Colossoma macropomum) memiliki Pseudomonas kesamaan aeruginosa dengan dan Affandi, R. dan U. Tang. 2002. Fisiologi Hewan Air.University Riau Press. Riau. 217 p. Affandi, R., DS. Sjafei, MF. Raharjo, Sulistiono. 2005. Fisiologi Ikan, Pencernaan dan Penyerapan Makanan. Bogor. Departemen Manajemen Sumberdaya Perairan, Fakulitas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor. Al-Harbi, AH., N. Uddin. 2005. Bacterial diversity of tilapia (Oerochomis niloticus) cultured in brackish water in saudi Arabia. Amaro. C., B.Fouz, E.G. Biosca, E. Marco-Noates and R. Collado. 1997. The Lypopolysacharide O Side Chain of Vibrio vulnivicus Serogroup E is a virulence determinant for eels. Infection and Immunity 65: 2475-2479. Ariana, Mubarik NR, Prawasti TS. 2003. Produksi dan karakterisasi protease Citrobacer sp. galur BKL-1 dari saluran pencernaan ikan kerapu Lumpur (Epinephelus tauvina) Biosfera 20: 75-84. Arie, U. 2000. Budidaya Bawal air Tawar untuk Konsumsi dan Ikan Hias. Jakarta; Penebar Swadaya. Aznar R., W. Ludwig., RI. Amann dan KH. Schleifer. 1994. Sequence Determination Of rRNA Genes Of Pathogenic Vibrio Species and Whole-Cell Identification Of Vibrio vulnificus With rRNA-targeted Oligonucleotide Probes. Lehrstuhl fr Mikrobiologie, Technische Universitt Mnchen, Germany Baehaki, A., Rinto dan B. Arif. 2011. Isolasi dan Karekterisasi Protease dari Bakteri Tanah Rawa Indralaya, Sumatera Selatan. J. Teknologi dan

Lysinibacillus sphaericus, sedangkan isolat PB.4 dan PB.5 dari sampel ikan bawal bintang memiliki kesamaan dengan Bacillus cereus dan Vibrio furnissii. Keempat bakteri tersebut memiliki potensi untuk dikembangkan sebagai protease. Saran Perlu dilakukan penelitian lanjutan peningkatan pemanfaatan enzim yang dihasilkan aeruginosa, dari bakteri Pseudomonas sphaericus, Lysinibacillus bakteri penghasil enzim

Bacillus cereus dan Vibrio furnissii baik sebagai penghasil enzim maupun sebagai probiotik. Serta perlu dilakukan isolasi gen penyandi proteolitik yang dihasilkan dari keempat bakteri tersebut, sehingga enzim yang dihasilkan dapat diaplikasikan kearah yang lebih menguntungkan.

Addinilia, Dewi. 2012. Analisis Karakter Genetik Berdasarkan Gen Cytochrome B pada Sidat (Anguilla bicolor Dan A. marmorata).Skripsi. program studi perikanan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan. Universitas Padjadjaran. Jatinangor.

20 Industri Pangan, Vol. XXII (1) : 1016 Baumann, P., A.L. Furniss and J.V. Lee. 1984. Genus Vibrio. Page 528-550 in N.R. Krieg and J.G. Holt, editors. Bergeys Manual of Systematic Bacteriology Vol. 1. William and Wilkins, Baltimore, Maryland. Boudko, Dimitri et al. 2001. In situ Analysis of pH Gradients in Mosquito Larvae Using Noninvasive, Self-Referencing, pH-Sensitive Microelectrodes. Journal of Experimental Biology. Brett, J. R. dan T.D.D. Groves. 1979. Physiological energetics dalam W.S. Hoar, D.J. Randall dan J.R. Brett (Eds) : Fish physiology Vol VIII. Academic Press, New York. Chen, F.R., P.C. Liu and k.K. Lee. 1999. An evaluation of chromogenic substrates for characterization of serine protease produced by pathogenic Vibrio alginolyticus. Christoffersen K, Lyck S, Winding A. 2002. Microbial activity and bacterial community structure during degradation of microcystin. Aquol Microb Ecol 27: 125-136. Cipriano, RC., AF. Larisa, DT. Jeffery, EH. Laura. 1992. Detection of Aeromonas salmonicida in the mucus of salmonid fishes. Aquatic Animal Head. Clarke, RTJ., T. Bouchop. 1977. Microbial Ecology of Gut. London. New York. San Frasisco : Academics Press. Clarridge, J. E. 2004. Impact of 16S rRNA gene sequence for identification of bacteria on clinical microbiology and infections disease. Clinical Microbiology Reviews 17(4): 840-862. Dwijoseputro. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan: Malang. Effendie, M. I. 1997. Biology Perikanan. Yayasan Pustaka Nusantara. Yogyakarta. Hal 93-105. Eileen G. Rawling., S. Fiona., L. Brinkman and Robert E. W. Hancock. 1998. Roles of the Carboxy-Terminal Half of Pseudomonas aeruginosa Major Outer Membrane Protein OprF in Cell Shape, Growth in LowOsmolarity Medium, and Peptidoglycan Association. Journal of Bacteriology. Fatimah, I. 2005. Isolasi Bakteri Proteolitik Dari Pencernaan Ikan Nila Galur GIFT (Oreochromis niloticus (Linnaeus) Trewavas) Dan Karakterisasi Protease Ekstraselulernya. Institut Pertanian Bogor. Fitri SGS, Mubarik NR, Prawasti TS. 2005. Produksi dan karakterisasi protease ekstraseluler Bacillus sp. galur BKU 10 dari saluran pencernaan Epinephelus tauvina. J Mikrobiol Indonesia 10: 9-13. Fujaya dan Yushita. 2004. Fisiologi Ikan. Rineka Cipta. Jakarta. Gandjar, I., R. K. Isworo, M. Wibowo& S. Lanita. 1992. Pedoman praktikum mikrobiologi dasar. Jurusan Biologi FMIPA-UI, Depok: vii + 87 hlm. Gupta S., (1990), Mikrobiologi Dasar, diterjemahkan oleh Julius ES., edisi 3, Peberbit Binarupa Aksara.

Handajani, Hany. 2006. Pemanfaatan Limbah Cair Tahu Sebagai Pupuk

21 Alternatif Pada Kultur Mikroalga Spirullina sp.Jurnal Protein.. Halver, J.E. 2002. The vitamins. In J.E. Halver & R.W. Hardy, eds. Fish nutrition.New York, Academic Press Inc Hoshino, T., K. Ishizaki., T. Sakamoto., H. Kumeta., I. Yumoto., H. Matsuyama., S. Ohgiya. 1997. Isolated of Pseudomonas sp of Fish Intestine Excretion a Active Protease at Low Temperature. Hu X., W. Fan., B. Han., H. Liu., D. Zheng., Q. LI., W. Dong., J. Yan., M. Gao, C. Berry dan Z. Yuan. 2008. Complete Genome Sequence Of The Mosquitocidal Bacterium Bacillus sphaericus C3-41 and Comparison With Those of Closely Related Bacillus Species. Wuhan Institute of Virology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430071, China. Lewaru, S. 2012. Identifikasi Bakteri Indigenous Pereduksi Logam Berat Cr (VI) Dengan Metode Molekuler Di Sungai Cikijing Rancaekek, Jawa Barat. Universitas Padjadjaran. Lovell, T. 1989. Nutrition and feeding of fish. Auburn University, New York. Madigan, M. T., J. M. Martinko & J. Parker. 2010. Brock biology of microorganisms. Prentice-Hall, Inc., Upper Saddle River: xix + 991 hlm. Nakayama A., Y. Yano., K. Yoshida.,. 1994. New Method For Isolating Barophiles From Intestinal Contents of Deep-sea Fishes Retrieved From The Abyssal Zone. Nasreen Bano and James T. Hollibaugh. 2002. Phylogenetic Composition of Bacterioplankton Assemblages from the Arctic Ocean. Environ Microbiologi. Pangastuti, A. 2006. Definisi spesies prokaryota berdasarkan urutan basa gen penyandi 16S rRNA dan gen penyandi protein. Biodiversitas 7(3): 292--296. Pedersen BH., EM. Nielsen, K. Hjelmeland. 1987. Variation in the content of trypsin and trypsinogen in larval rearing (Clupea harengus) digesting copepod nauplii. Marine Biology 94: 171-181. Prakash, M., R. M. Banik. 2006. Purificatin and Characterization Of Laundry Detergent Compatible Alkaline Protease From Bacillus Cereus. Research Of Journal Institute Of Technology Banaras Hindu. Puspitasari FD., M. Shovitri., ND Kuswytasari. 2012. Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Aerob Proteolitik dari Tangki Septik. Institut Teknologi Sepuluh November.

Jaret L. Malloy., A.W Ruud., Veldhuizen., A. Brett., Thibodeaux., J. Richard., OCallaghan and Jo Rae Wright1. 2004. Pseudomonas aeruginosa protease IV degrades surfactant proteins and inhibitssurfactant host defense and biophysical functions. Articles in PresS. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol Kuzmina, VV. 1996. Influence of age on digestive enzyme activity in some freshwater teleostei. Aquaculture 148:25-37. Leano, E. M., G. D. Lio-Po, L. A. Nadong, A. C. Tirado, R. B. Sabada & N. G. Guanzon Jr. 2005. Mycoflora of the green water culture system of tiger shrimp Penaeus monodon Fabricius. Aquaculture research 36: 1581-1587

22 Radit. 2011. Dalam Laporan Praktikum Ikhtiologi Ikan Bawal Hitam. Universitas Brawijaya. Malang. Rao, M. B., A. M. Tanksale, M. S. Ghatge and V.V. Deshpande. 1998. Molecular and Biotechnological Aspect of Microbial Proteases. J. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62(3) Rodney M. Donlan and J. William Costerton. 2002. Biofilms: Survival Mechanisms of Clinically Relevant Microorganisms. Clinical Microbiology Reviews. Rosmawati. 2004. Hidrolisis pakan buatan oleh enzim pepsin dan pankreatin untuk meningkatkan daya cerna dan pertumbuhan benih ikan gurame (Osphronemus gouramy Lae.) (tesis). Bogor: Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Saanin, H. 1984. Taksonomi dan Kunci Identifikasi Ikan. Binacipta, Jakarta. Sadi, N.H. 2009. Tesis: Identifikasi Isolat Bakteri Tahan Krom(Vi) Dan Pengujian Aktivitas Enzim Krom(Vi) Reduktase. Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor. Bogor. Salamun. 1995. Studi Komparatif Efek Residual Bacillus thuringiensis H-14 Dan Bacillus sphaericus H-5a5b Terhadap Larva Aedes aegypti Pada Beberapa Tipe Tempat Penampung Air. Singh RK, Chaudhary BD. 1979. Biometrical Methods in Quantitative Genetic Analysis. Ludhiana-New Delhi. Kalyani Publishers. Siswandono, Soekardjo B. 1995. Kimia Medisinal. Surabaya: Airlangga Univ Pr. Souza, A. A. G., I. P. G. Amaral, A. R. E. Santo, L. B. Carvalh dan R. S. Bezerra. 2005. Trypsin-like enzyme from intestine and pyloric caeca of spottedgoatfish (Pseudupeneus maculatus). Food Chemistry 100 (2007) 1429 1434. Spanggaard, S., I. Huber, J. Nielsen, T. Nielsen, KF. Appel, L. Gram. 2000. The mikroflora of rainbow trout intestinal: a comparison of traditional and molecular identification. Stanbury PF, Whitaker A. 1984. Principles of Fermentation Technology. Oxford: Pagamon Pr. Suhartono M. T. 2000. Pemahaman Karkteristik Biokimiawi Enzim Protease dalam Mendukung Industri Berbasis Biotekhnologi. Bogor : Institut Pertanian Bogor Sukenda, A. J. Sihombing., F. Novianti dan Widanarni. 2005. Penapisan Bakteri Probiotik Dan Peranannya Terhadap Infeksi Buatan Vibrio harveyi Pada Udang Vaname (Litopenaeus vannamei). Jurnal Penelitian Institut Pertanian Bogor. Sukma, P. 2003. Produksi dan Karakterisasi Protease Bacillus sp Galur BBU-32 Asal Saluran Pencernaan Parastromateus niger. Departemen Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. IPB Supriatna. 1998. Pengaruh Kadar Asam Lemak Omega 3 yang Berbeda pada Kadar Asam Lemak Omega 6 Tetap dalam Pakan terhadap Pertumbuhan Ikan Bawal Air Tawar Colossoma macropomum Cuvier. Program Paska Sarjana IPB. Bogor. Supriyanto, M. Nur, I.R Widadi. 2009. Alternatif Baru Deterjen Ramah Lingkungan Dari Pyloric Caeca Ikan Bawal Air Tawar. Institut Pertanian Bogor.

23 Takenaka S & Watanabe MF. 1997. Microcystin-LR degradation by Pseudomonas aeruginosa alkaline protease. Chem 34 : 749-757. Tim Balai Budidaya Laut Batam. (1999). Pembenihan Bawal Bintang (Trachinotus blochii (Lecepede). Balai Budidaya Laut Batam Direktorat Jenderal Perikanan Departemen Pertanian. Batam. Tomiyama, T & Hibiya, T. 1979. Fisheris in Japan. Jacks & Pompanas. Japan Marine Products Photo. Veillette, P.A. 2007. Pyloric caeca in Chinook: Salmon: Osmoregulatory Functionand Responsivinnesto Cortisol.University of Otago P.O. Box 56 Dunedin, New Zealand. Ward OP. 1983. Proteinases. Di dalam Fogarty MW, editor. Microbial and Enzyme Technology. New York: Applied Science Publishing. hlm. 251-305. Warta Budidaya. 2007. Bawal Bintang Potensi Baru Perikanan Budidaya Indonesia. Media Informasi Perikanan Budidaya Edisi Xiv. Departemen Kelautan Dan Perikanan Direktorat Jenderal Perikanan Budidaya. Hal. 22-24. Zoetendall, E. G., B. Cheng, S. Koike & R. I. Mackie. 2004. Molecular microbial ecology of the gastrointestinal tract: from phylogeny to function. Intestinal Microbiology 5: 31--48.