Identifikasi fenotipik dan genotipik Bakteri Asam Laktat asal fermentasi

spontan Pisang var. Agung Semeru (Musa paradisiaca formatypica)

Abstrak :
Bakteri asam laktat dapat ditemukan pada produk makanan seperti susu dan
produk daging, serealia, singkong, buah-buahan atau sayuran produk. tujuan
penelitian ini adalah untuk mengidentifikasi fenotipik dan genotipik bakteri asam
laktat yang diisolasi dari fermentasi pf spontan mentah var agung semeru pisang
(musa paradisiaca formatypica). Identifikasi fenotipik didasarkan pada morfologi
umum, tes fisiologis, API dan sistem Biolog. Identifikasi genotipe yang digunakan
reaksi berantai polimerase metode (PCR) dan analisis 16 S rRNA urutan. Hasil
penelitian menunjukkan bahwa dua kelompok LAB (FS nh 1 dan FSnh A
mengisolasi) dapat menggunakan gliserol, D-ribosa, D-xylose, D-glukosa, Dfruktosa, D-manose, metil alfa D-gluco pyranoside, N- asetil glukosamin, esculin
besi, sitrat, salisin, D-selobiosa, D-sakarosa, gentibiose dan kalium glukonat sebagai
sumber karbon. Selain itu FSnh 1 isolat yang digunakan D-galaktosa, L-sorbose, Lrhamnose, dan amygdalin, sementara FSnh A mengisolasi digunakan metil alfa Dglukopiranosa, arbutin, D-maltosa, D-laktosa, D-trehalosa, D-turanose, dan kalium 5ketogluconate sebagai sumber karbon. Identifikasi genotipe menunjukkan bahwa
lactobacillus sp terkait dengan fermentasi spontan var agung semeru pisang
diidentifikasi sebagai lactobacillus salivarus dan lactobacullis fructivorans.

BAB I
Pendahuluan
1.1 Latar Belakang
Bakteri Asam Laktat merupakan bakteri yang mampu mengubah karbohidrat (glukosa) menjadi
asam laktat. Efek bakterisidal dari asam laktat berkaitan dengan penurunan pH lingkungan menjadi 3-4,5
sehingga pertumbuhan bekteri lain termasuk bakteri pembusuk akan terhambat (Amin dan Leksono, 2001).
Pada umunnya mikroorganisme dapat tumbuh pada kisaran pH 6-8 (Amano, 1962). Berdasarkan
taksonomi, terdapat sekitar 20 genus bakteri yang termasuk dalam BAL (Aerococcus, Bifidobacterium,
Carnobacterium, Enterococccus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus,
Streptococcus, Tetragenococcus, Vegococcus, dan Weissella).
Bakteri asam laktat digunakan dalam bidang fermentasi, misalnya dalam pembuatan yoghurt, keju,
mentega, susu asam dll. Bakteri asam laktat dalam fermentasi berguna untutk melindungi produk dari
pencemaran bakteri patogen, meningkatkan nutrisi , serta berpotensi memberikan dampak yang positif bagi
kesehatan manusia (Wikipedia, 2011). Bukti bahwa mikroorganisme sangat bermanfaat dituliskan dalam
Al-Quran surah Al-Baqaroh ayat 164 :

Sesungguhnya pada kejadian semua langit dan bumi dan perubahan malam dan siang dan kapal yang
berlayar di lautan membawa barang yang bermanfaat bagi manusia, dan apa yang diturunkan Allah dari
langit dari ada air, maka dihidupkanNya dengan (air) itu bumi, sesudah matinya , seraya disebarkanNya
padanya dari tiap-tiap jenis binatang, dan peredaran angin, dan awan yang diperintah di antara langit
dan bumi; adalah semuanya itu tanda-tanda bagi kaum yang berakal.

Sifat dari bakteri asam laktat ini adalah amilolitik, dimana BAL dapat
mendegredasi pati. Sifat-sifat fisik dari BAL ini dapat diketahui dengan pengamatan
morfologi koloni, pengamatan mikroskopis (pewarnaan gram), uji fisiologis,
metabolik (biokimia) atau dengan kemotaksonomi. Sedangkan untuk identifikasi dari
genotipik nya dapat dilakukan dengan menggunakan metode molekuler yaitu dengan
sekuensing gen pengkode 16S rRNA bakteri dengan metode polymerase chain
reaction(PCR)-sekuensing, fungsinya untuk mengetahui jenis gen nya dengan
mencocokan gen dari ke 20 genus pada bakteri asam laktat. Digunakan metode PCR
karena enzim polimerase itu sendiri dapat memecah ikatan antar basa nitrogen.
Pisang merupakan buah yang memiliki kandugan karbohidrat yang cukup
tinggi fungsi dari karbohidrat itu sendiri untuk menghasilkan energi dalam tubuh.
Karena dalam pisang tersebut memiliki karbohidrat cukup tinggi maka dapat
menghasilkan bakteri asam laktat yang bermanfaat bagi kesehatan manusia dan dapat
melindungi bahan-bahan fermentasi dari bakteri patogen yang berbahaya bagi
kesehatan. Pisang yang digunakan merupakan pisang yang berasal dari daerah
lumajang, selain dapat meningkatkan manfaat pisang sebagai distributor bakteri asam
laktat juga dapat meningkatkan hasil ekonomi warga lumajang.

1.2 Rumusan Masalah

1.

Bagaimana cara identifikasi fenotipik Bakteri Asam Laktat?

2.

Termasuk dalam genus apakah Bakteri Asam Laktat tersebut?

1.3 Tujuan
3.

Untuk mengetahui fenotipik dari Bakteri Asam Laktat

4.

Untuk mengetahui genus dari Bakteri Asam Laktat

1.4 Batasan Masalah

5.

Pisang yang digunakan merupakan produk asli indonesia dengan jenis Pisang var.
Agung Semeru (Musa paradisiaca formatypica)

6.

Identifikasi bakteri asam laktat berupa fenotipik dan genotipik

1.5 Manfaat Penelitian

7.

Memberikan informasi mengenai fenotipik serta genotipik dari Bakteri Asam Laktat

8.

Memberikan ilmu baru dalam bidang kimia tentang genetika dengan menggunakan
komputasi

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

2.2 Dasar Teori

2.2.1 Bakteri Asam Laktat
Bakteri asam laktat adalah kelompok bakteri yang mampu mengubah karbohidrat (glukosa)
menjadi asam laktat. Efek bakterisidal dari asam laktat berkaitan dengan penurunan pH lingkungan
menjadi 3 sampai 4,5 sehingga pertumbuhan bakteri lain termasuk bakteri pembusuk akan terhambat
(Amin dan Leksono, 2001). Pada umunya mikroorganisme dapat tumbuh pada kisaran pH 6-8 (Buckle et
al., 1987). Bakteri Asam Laktat merupakan kelompok besar bakteri menguntungkan yang memiliki sifat relatif
sama. Saat ini Bakteri Asam Laktat digunakan untuk pengawetan dan memperbaiki tekstur dan cita rasa
bahan pangan (Chabela, dkk., 2001). Bakteri Asam Laktat mampu memproduksi asam laktat sebagai produik
akhir perombakan karbohidrat, hidrogen peroksida, dan bakteriosin (Afrianto, dkk., 2006). Dengan
terbentuknya zat antibakteri dan asam maka pertumbuhan bakteri pathogen seperti Salmonella dan E. coli
akan dihambat (Silalahi, 2000).
Efektivitas Bakteri Asam Laktat dalam menghambat bakteri pembusuk dipengaruhi oleh kepadatan
Bakteri Asam Laktat, strain bakteri asam laktat, dan komposisi media (Jeppensen dan Huss, 1993). Selain
itu, produki substansi penghambat dari bakteri asam laktat dipengaruhi oleh media pertumbuhan, pH, dan
temperature lingkungan (Ahn dan Stiles, 1990).

Sebagian besar BAL dapat tumbuh sama baiknya di lingkungan yang memiliki
dan tidak memiliki O2 (tidak sensitif terhadap O2), sehingga termasuk anaerob
aerotoleran.Bakteri yang tergolong dalam BAL memiliki beberapa karakteristik
tertentu yang meliputi: tidak memiliki porfirin dan sitokrom, katalase negatif, tidak
melakukan fosforilasi transpor elektron, dan hanya mendapatkan energi dari
fosforilasi substrat. Hampir semua BAL hanya memperoleh energi dari metabolisme
gula sehingga habitat pertumbuhannya hanya terbatas pada lingkungan yang
menyediakan cukup gula atau bisa disebut dengan lingkungan yang
kaya nutrisi.Kemampuan mereka untuk mengasilkan senyawa (biosintesis) juga
terbatas dan kebutuhan nutrisi kompleks BAL meliputi asam amino, vitamin, purin,
dan pirimidin.
Berdasarkan studi genetika, beberapa sifat BAL yang berhubungan dengan
fermentasi cenderung disandikan oleh gen-gen di [plasmid] (DNA
ekstrakromosomal).Sifat-sifat yang dimaksud meliputi produksi proteinase,
metabolisme karbohidrat, transpor sitrat, produksi eksopolisakarida, produksi
bakteriosin, dan resistensi terhadap bakteriofag.DNA plasmid dapat ditransfer
antarbakteri dengan beberapa mekanisme, seperti konjugasi yang umum terjadi
pada Lactococcus sehingga sifat-sifat tersebut dapat menyebar.

2.2.2 Fenotipik dan Genotipik Bakteri Asam Laktat

Identifikasi fenotip didasarkan pada hasil pengamatan morfologi seperti bentuk sel dan pewarnaan
Gram, uji fisiologis, metabolik (biokimia) atau kemotaksonomi. Identifikasi genotip dapat dilakukan
dengan menggunakan metode molekuler yaitu sekuensing gen pengkode 16S rRNA bakteri dengaan
metode Polymerase Chain Reaction (PCR)-sekuensing(Ammmor et al.2005).
2.2.3 PCR (polymerase chain reaction)
metode untuk amplifikasi (perbanyakan) primer oligonukleotida diarahkan secara enzimatik urutan
DNA spesifik. Teknik ini mampu memperbanyak sebuah urutan 105-106-kali lipat dari jumlah
nanogram DNA template dalam latar belakang besar pada sequence yang tidak relevan (misalnya dari
total DNA genomik). Sebuah prasyarat untuk memperbanyak urutan menggunakan PCR adalah
memiliki pengetahuan, urutan segmen unik yang mengapit DNA yang akan diamplifikasi, sehingga
oligonucleotides tertentu dapat diperoleh. Hal ini tidak perlu tahu apa-apa tentang urutan intervening
antara primer. Produk PCR diamplifikasi dari template DNA menggunakan DNA polimerase stabilpanas dari Thermus aquaticus (Taq DNA polimerase) dan menggunakan pengatur siklus termal
otomatis (Perkin-Elmer/Cetus) untuk menempatkan reaksi sampai 30 atau lebih siklus denaturasi, anil
primer, dan polimerisasi. Setelah amplifikasi dengan PCR, produk ini dipisahkan dengan elektroforesis
gel poliakrilamida dan secara langsung divisualisasikan setelah pewarnaan dengan bromida etidium.
PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan suatu teknik perbanyakan (amplifikasi) potongan DNA
secara in vitro pada daerah spesifik yang dibatasi oleh dua buah primer oligonukleotida. Primer yang
digunakan sebagai pembatas daerah yang diperbanyak adalah DNA untai tunggal yang urutannya
komplemen dengan DNA templatnya. Proses tersebut mirip dengan proses replikasi DNA secara in
vivo yang bersifat semi konservatif.

BAB III
Metodologi
3.1 Metode

Bakteri asam
laktat

Isolasi
bakteri asam
laktat

Analisis
urutan
DNA
pengko
de 16S
rRNA

Identifikasi
fenotipik
dengan
menggunakan
API 50CH

Identifikasi
genotipik
menggunakan
PCR dan analisis
urutan DNA
pengkode 16S
rRNA
Amplifikasi
DNA
pengkode
16S rRNA
dengan PCR

Hasil dan pembahasan

Karakterisasi fenotipik dari BAL sebanyak 12 isolat, Beberapa isolat memiliki kesamaan morfologi
sehingga dikelompokkan menjadi dua kelompok yang selanjutnya akan diidentifikasi dengan menggunakan kit
API 50CHL untuk mengetahui pola fermentasinya. Kelompok I terdiri atas 10 isolat (FSnh 1 10) yang diwakili
oleh isolat FSnh 1 dengan karakteristik sel bentuk batang pendek, koloni bulat sedang, berwarna putih susu
dengan elevasi cembung, tidak membentuk gas dan dapat tumbuh pada suhu 15oC dan 45oC serta tumbuh
optimal pada suhu 35oC. Kelompok II terdiri atas 2 isolat (FSnh A dan B) yang diwakili oleh isolat FSnh A
dengan karakteristik sel bentuk batang pendek, koloni bulat kecil berwarna putih bening dengan elevasi seperti
tetesan, membentuk gas dan tumbuh optimal pada suhu 35oC dan 45oC tetapi tidak tumbuh optimal pada suhu
15oC. Kedua isolat BAL tersebut mampu memfermentasi gula tertentu sebagai sumber karbon.
Karakterisasi genotipik isolat bakteri asam laktat dilakukan berdasarkan DNA pengkode gen 16S rRNA
untuk menentukan genus dan strainya. DNA pengkode ini dapat dijadikan penanda molekuler untuk definisi
spesies karena molekul ini ada pada setiap organisme dengan fungsi yang identik pada seuruh organisme. Oleh
karea itu dapat dirancang suatu primer universal untuk seluruh kelompok. Data urutan basa gen penyandi 16S
rRNA memungkinkan digunkan untuk mengkonstruksi pohon filogenetik yang dapat enunjukan hubungan
kekerabatan serta asal mula (nenek moyang) suatu organisme.

isolat dari BAL FSnh 1 dan FSnh A diamplifikasi dengan menggunakan primer 63F dan 1378R.
Berdasarkan marker pita DNA yang digunakan mendekati 1500 pasang basa. Hasil tersebut relevan dengan
produk PCR yang dihasilkan sekitar 1400 pasang basa.
Analisis hasil sekuensing diawali dengan melakukan :
1.

Melakukan pensejajaran urutan basa DNA pengkode 16S rRNA pada kesua isolat BAL dari sekuen forward (F)
dan sekuen Reverse (R) dengan menggunakan proram bioedit CAP contig assembly program. Sekuen parsial
DNA pengkode 16S rRNA disejajarkan dengan sekuen lengkap Genbank DNA pengkode 16S rRNA dari
beberapa genus bakteri asam laktat dengan menggunakan program perangkat lunak

2.

DNA pengkode menunjukan bahwa isolat FSnh 1 dan FSnh A merupakan family dari Latobacillaceae. Genus
lactobacillus memeliki skor 75 sedangkan untuk genus Weissella yang paling rendah yaitu sebesar 41 untuk
isolat FSnh 1 dan 39 untuk isolat FSnh A.

Berikut ini adalah hasil elektroforesis dengan gel agarosa

Komposisi nukleotida penyusun DNA pengkode 16S rRNA setiap isolat

itu berbeda-beda sehingga dilakukan analisis kekerabatan menggunakan
program BLAST-N. FSnh 1 memiliki kemiripan dengan Lactobacillus
delbruekci subsp bulgaricus NDO2 (81%), L. Amylovorous GRL 1112 (80%),
dan L. Iners (80%) yang masing-masing memiliki nilai diatas 80%.
Sedangkan untuk BAL FSnh A memiliki kemiripan 81% dengan Lactobacillus
iners dan L. Delbruekci subsp bulgaricus, serta 80% dengan Leuconostoc
mesenteroides subsp cremoris ATCC 19254.
Setelah didapat hasil kekeranatan tersebut, kemudian dilanjutkan
dengan analisis pohon filogenetik secara dua tahap. Tahap pertama
fungsinya untuk mensejajarkan sekuen kedua BAL denganisolat internasional
dari genus yang berbeda dalam satu family yaitu lactobacillaceae. Tahap
pertama menunjukan bahwa skor untuk kesejajaran tinggi adalah 75
(Lactobacillus) dan 39 (Weisella). Kesejajaran antara BAL FSnh 1 dan FSnh A
sebesar 92 yang menunjukan bahwa kedua isolat tersebut berada dalam
satu genus. Tahap kedua, mensejajarkan kedua isolat BAL dengan isolat
inernasional dari spesies yang berbeda dalam satu genus Lactobacillus dari
hasil tahap pertama, didapatkan hasil skor tertinggi untuk FSnh 1 adalah 75
dengan Lactobacillius salivarus dan untuk FSnh A 76 dengan Lactobacillus
fructivorans. Hal ini menunjukkan keduanya memiliki edekatan genus yaitu
Lactobacillus.