Isolasi Bakteri Protealitik pada Rusip Ikan Teri Hitam (Stolephorus commersonnii)

Isolation of Protealytic Bacteria on Rusip Black Anchovy (Stolephorus commersonnii)

Efita Karunia Harita1), Faras Puji Astuti1), Farra Oktaviani1), Firzan Fatansyah1), Gita Safitri1)

1) Program Studi Biologi, Fakultas Pertanian Perikanan dan Biologi, Universitas Bangka Belitung, Indonesia

ABSTRAK

Enzim protease berperan penting dalam bidang pangan dan kesehatan, khususnya dalam proses pembuatan
pengawet non-formalin. Pemanfaatan enzim protease semakin pesat dan menempati posisi penting di berbagai
bidang industri. Salah satu upaya untuk meningkatkan produksi enzim protease adalah dengan mencari sumber
baru penghasil enzim protease, khususnya dari kelompok bakteri. Rusip merupakan makanan tradisional
masyarakat Bangka-Belitung yang terbuat dari bahan baku ikan teri segar yang diberi garam dan air gula aren
yang difermentasi secara anaerob dengan kurun waktu kurang lebih dua minggu. Rusip ikan teri mengandung
protein yang cukup tinggi, sehingga diperkirakan terdapat bakteri proteolitik yang menghasilkan enzim protease.
Penelitian dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Universitas Bangka Belitung selama 2 minggu. Proses isolasi
dan purifikasi koloni bakteri dilakukan menggunakan media Nutrient Agar. Uji penghasilan enzim protease
dilakukan pada media Skim Milk Agar. Metode yang digunakan dalam penelitian ini yaitu metode spread plate
(cawan sebar) dan metode cawan gores dengan pengenceran bertingkat. Isolat bakteri proteolitik pada rusip ikan
teri hitam memiliki zona bening paling banyak pada isolate dengan kode FRS. Dan yang memiliki indeks
proteolitik tertinggi pada isolate bakteri dengan kode LBR. Berdasarkan hasil uji produksi enzim protease yang
diikubasi selama 24 jam didapat hasil diameter zona bening bakteri lebih dari 12 mm yang menunjukan bahwa
isolat dengan kode FRS, LBR, AKH dan TJH menghasilkan enzim protease.

Kata kunci : Isolasi bakteri, Identifikasi molekuler, Bakteri proteolitik, Rusip ikan teri

ABSTRACT

Protease enzymes play an important role in the food and health sector, especially in the process of making non-formalin
preservatives. Utilization of protease enzymes is growing rapidly and occupies an important position in various industrial
fields. One of the efforts to increase the production of protease enzymes is to look for new sources of protease enzymes,
especially from the group of bacteria. Rusip is a traditional food for the people of Bangka Belitung which is made from fresh
anchovy with salt and palm sugar water which is fermented anaerobically for about two weeks. Anchovy chips contain high
enough protein, so it is estimated that there are proteolytic bacteria that produce protease enzymes. The research was
conducted at the Microbiology Laboratory of the University of Bangka Belitung for 2 weeks. The process of isolation and
purification of bacterial colonies was carried out using Nutrient Agar media. The protease enzyme production test was
carried out on Skim Milk Agar media. The method used in this research is the spread plate method and the scratch plate
method with multilevel dilutions. Isolates of proteolytic bacteria on black anchovy rusips had the most clear zones in isolates
with FRS code. And which has the highest proteolytic index on bacterial isolates with LBR code. Based on the results of the
protease enzyme production test which was incubated for 24 hours, the diameter of the bacterial clear zone was more than 12
mm which indicated that the isolates coded FRS, LBR, AKH and TJH produced protease enzymes.

Keywords : Bacterial isolation, Moleculer identification, Proteolytic bacteria, Anchovy rusip

PENDAHULUAN
Kebutuhan enzim untuk industri
dalam negeri dapat mencapai 2500 ton per
tahun. Hampir 99% masih mengimpor
enzim dari beberapa Negara seperti Cina,
India, Jepang dan sebagian dari Eropa
sehingga. Indonesia pada tahun 2015
mengimpor enzim senilai 187,5 milyar dan
diperkirakan akan terus meningkat tiap
tahunnya. Hingga saat ini BPPT (Badan
Pengkajian dan Penerapan Teknologi)
merupakan satu-satunya fasilitas unit
produksi enzim dan pertama di Indonesia
(Badan Pengkajian dan Penerapan
Teknologi, 2015).
Salah satu jenis enzim yang telah
dikembangkan yaitu protease . Enzim
protease berguna untuk menguraikan protein
didalam tubuh. Enzim ini merupakan satu
diantara 3 kelompok enzim komersial yang
diaplikasikan dalam dunia seperti industri
dan deterjen. Sebagia besar industri
memanfaatkan bakteri sebagai penghasil
protease karena memiliki daya produksi
tinggi. Selain itu, protease juga
dimanfaatkan dalam bidang kesehatan yang
digunakan untuk proses pembuatan chitosan
(pengawet nonformalin) (Lingewati, 2012).
Bakteri merupakan satu mikroorganisme
penghasil enzim terbanyak karena
pertumbuhannya cepat (Melliawati et al,
2016). Kemampuan bakteri dalam
menghasilkan enzim protease dapat
diketahui dengan mengisolasi bakteri pada
medium susu skim (Safitri, 2018). Isolasi
bakteri penghasil enzim protease dapat
dilakukan dari produk olahan fermentasi
misalnya rusip. Rusip terbuat dari udang
atau ikan teri yang difermentasi dengan
garam dan gula aren (Koesoemawardani,
2015).
Kemampuan bakteri dalam
menghasilkan enzim protease dapat
diketahui dengan mengisolasi bakteri pada
medium susu skim (Safitri, 2018). Isolasi
bakteri penghasil enzim protease dapat
dilakukan dari produk olahan fermentasi
misalnya rusip. Rusip terbuat dari udang atau
ikan teri yang difermentasi dengan garam dan
gula aren (Koesoemawardani, 2015). Ikan
digunakan sebagai bahan dasar pembuatan rusip
karena memiliki protein yang cukup tinggi.
Ikan merupakan salah satu hasil laut terbanyak
yang ada di Indonesia. Proses fermentasi
dipembuatan rusip, terjadi degradasi protein
oleh bakteri proteolitik menjadi asam amino
dan peptida lalu diubah menjadi komponen
lainnya dan menghasilkan produk berbentuk
pasta atau cairan (Hanafiarti, 2015). Degradasi
protein menjadi senyawa lebih kecil pada
proses fermentasi dapat membentuk enzim
protease. Adapun kandungan protein pada rusip
ialah sebanyak 17,1 g (Sastra, 2008).
Bacillus dan Lactobacillus adalah contoh
bakteri yang dimanfaatkan untuk menghasilkan
protease komersial. Bakteri protease hidup di
lingkungan yang kaya protein. Beberapa tempat
yang dapat dijadikan lokasi isolasi bakteri
dengan aktivitas proteolitik diantaranya limbah
cair tahu, rumah pemotongan hewan, tambak,
tempat pembuangan susu rusak serta tanah
gambut yang kaya akan bahan organik. Produk
pangan hasil fermentasi juga kaya akan bakteri
proteolitik seperti oncom dan produk
fermentasi ikan. Salah satu hasil produk
fermentasi ikan adalah Rusip. Berdasarkan hal
tersebut penelitian ini dilakukan untuk
mengisolasi bakteri proteolitik pada rusip ikan.
METODE PENELITIAN
Alat dan Bahan
Alat yang digunakan adalah cawan petri,
magnetik stirer, mikropipet, autoklaf, hot plate,
tabung reaksi, rak tabung, gelas ukur, laminar,
spiritus, ose jarum, pinset, neraca analitik,
mikrotube, vortex.
Bahan yang digunakan adalah akuades,
media Skim Milk Agar (SMA), rusip.
Prosedur Kerja Uji Indeks Proteolitik
Sterilisasi Alat dan Bahan
Peralatan disterilisasi terlebih dahulu Pada penentuan indek proteolitik
menggunakan dengan menggunakan Autoklaf digunakan sebanyak 1 ose koloni tunggal
selama ± 20 menit, kemudian didinginkan selama biakan murni diambil dan diencerkan hingga
± 3 jam . Alat yang telah disterilisasi, kemudian pengenceran 10- 5 , selanjutnya sebanyak 100
dikeluarkan dan disimpan . µL hasil pengenceran 10-5 diinokulasikan
dengan metode sebar pada media SMA ,
kemudian diinkubasi pada suhu 35°C selama 2
Pembuatan Media x24 jam. Setelah itu dilakukan pengukuran
Pembuatan media skim milk agar (SMA) diameter koloni dan zona bening yang
Timbang sebanyak 23 gram NA kemudian NA terbentuk pada jam ke-24 dan ke 48.
telah ditimbang dilarutkan dengan 1000 mL Analisis Data
akuadest , selanjutnya panaskan campuran
hingga mendidih (diperoleh larutan bewarna Analisis data dari kriteria variasi
kekuningan atau putih tulang) setelah itu karakteristik morfologi dan variasi aktivitas
campuran didinginkan dan tuang pada bakteri proteolitik dideskripsikan secara
erlenmeyer. Erlenmeyer selanjutnya di tutup kualitiatif berdasarkan hasil uji indeks
kapas yang telah dibungkus kasa) - Sterilkan proteolitik yang dilakukan oleh panelis.
dengan autoklaf. - Sebanyak 1% susu skim
ditambahakan pada media NA yang sudah HASIL DAN PEMBAHASAN
steril.
Variasi Karakteristik Morfologi
Isolasi Mikroba Sampel yang digunakan dalam penelitian
Isolasi mikroba penghasil protease adalah rusip ikan teri hitam (Stolephorus
dilakukan dengan menyiapkan sebanyak 1 commersonnii). Berdasarkan penelitian yang
gram sampel/1 mL sampel cair lalu telah dilakukan didapatkan 4 isolat bakteri
dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi dengan morfologi yang berbeda-beda. Adapun
9 mL akuadest steril lalu diaduk dihomogen karakteristik morfologi dapat dilihat pada tabel 1.
(10-1 ).Dilakukan pengenceran sampel hingga
diperoleh konsentrasi 10-5 , lalu sebanyak 0.1 Tabel 1. Karakteriktik Morfologi Bakteri
mL sampel dengan konsentrasi 10-5 diinokulasi Proteolitik Pada Ikan Teri Hitam (Stolephorus
pada media skim milk agar (SMA) dengan commersonnii).
metode spread plate. Kemudian sampel Kode Morfologi
Isolat
diinkubasi pada suhu 35°C selama 2x24 jam. Bentuk Ukuran Elevasi Warna Margin
Dan akan diperoleh hasil koloni yang FRS Irregular Large Raised Putih Lobate
dikelilingi oleh zona bening merupakan bakteri LBR Irregular Large Flat Abu-abu Undulate
penghasil protease. Selanjutnya diakukan & Putih
pemurnian bakteri. keruh
AKR Filamentous Large Umbonate Putih Serrate
Pemurnian Bakteri TJH Rhizoid Moderate Flat Putih Serrate
Pemurnian bakteri proteolitik dilakukan
dengan memnyiapkan sebanyak 1 ose bakteri Variasi Aktivitas Bakteri Proteolitik
proteolitik yang telah dimurnikan diencerkan Adapun uji kemampuan aktivitas bakteri
ke dalam 10 mL larutan fisiologis, dilakukan proteolotik pada rusip dapat dilihat pada tabel 2.
pengenceran hingga pengenceran 10-5 , setelah Tabel 2. Hasil Kemampuan Aktivitas Bakteri
itu sebanyak 100 µl hasil pengenceran Proteolitik (dalam satuan mm)
diinokulasi pada media SMA dengan dengan
metode goresan empat kuadran.
 Setelah tahap inkubasi selama 48 jam,
Kode Diameter Diameter Indeks
dilakukan pemurnian bakteri proteolitik.
Isolat Koloni Zona Proteolitik
Sebanyak 1 ose bakteri digores dengan metode
Bening
empat kuadran pada media SMA kemudian
FRS 16,775 19,525 0,16 dilakukan inkubasi selama 24 jam. Tahap
LBR 8,75 14,275 0,63 selanjutnya adalah penentuan indeks proteolitik.
AKR 9,90 12,20 0,23 Sebanyak 1 ose koloni bakteri biakan diambil dan
TJH 8,55 11,525 0,34 diencerkan hingga pengenceran 10-5 . Sebanyak
100 µL hasil pengenceran 10-5 diinokulasi dengan
metode spread plate pada media SMA.
Diinkunasi pada suhu 35oC selama 24 jam dan
kemudian diamati zona bening dan diameter
koloni untuk menentukan indeks proteolitik.
Indeks proteolotik dapat dihitung menggunakan
rumus Durham et al 1987.
Indeks Proteolitik (IP) = Diameter Zona Bening (mm) – Diameter Koloni
Diameter Koloni (mm)

Gambar 1. Kemampuan Aktivitas Proteolitik Pada Bakteri
Keterangan: a. Koloni Bakteri, b. Zona Bening
Penelitian ini menggunakan sampel rusip
ikan teri hitam (Stolephorus commersonnii). Rusip
merupakan makanan khas daerah Bangka Belitung.
Rusip terbuat dari ikan yang kemudian ditambahkan
garam dengan kadar 10-25% dan beras atau gula
aren dengan kadar 10%, kemudian difermentasi
secara anaerob dengan kurun waktu kurang lebih dua
minggu. Menurut Steinkraus 2002, penambahan
garam dengan kadar lebih dari 13% pada substrat
melimpah protein seperti ikan menghasilkan
hidrolisis protein yang terkontrol yang dapat
mencegah pembusukan, menghasilkan pasta serta
asam amino dan peptide yang beraroma “meaty” dan
“savory”.
Sampel rusip ikan teri hitam diambil
sebanyak 1 gram sampel/1 mL kemudian diencerkan
kedalam tabung reaksi yang berisi 9 mL akuadest
steril kemudian di vortex pada tingkat pengenceran
10-1 kemudian lakukan pengenceran bertingkat
hingga 10-7. Sebanyak 0,1 mL sampel dengan
konsentrasi 10-5, 10-6, 10-7 diinokulasi pada media
skim milk agar (SMA) dengan metode spread plate.
Selanjutnya dilakukan tahap inkubasi selama 48 jam.
Pengenceran sampel dilakukan dengan tujuan agar
koloni bakteri yang tumbuh diharapkan tidak
bertumpuk sehingga dapat diamati morfologinya
dengan jelas.
Uji Aktivitas Proteolitik Isolat bakteri
asosiasi yang menghasilkan enzim protease
adalah isolat dengan kode FRS,LBR,AKR,TJH .
Dari pengamatan secara makroskopis dari ke-
empat isolat Bakteri yang memiliki aktivitas
proteolitik tersebut menunjukan perbedaan dari
segi tepi, bentuk, elevasi, dan warna. Hal ini
diduga karena setiap isolat berbeda jenis sehingga
aktivitas proteolitik yang ditunjukan juga berbeda
yaitu dari diameter zona bening yang terlihat.
Pengukuran zona bening pada isolat bakteri
proteolitik menunjukkan perbedaan dari tiap
isolat. Aktivitas paling rendah ditunjukkan pada
isolat TJH dengan diameter zona bening 11,525
mm. Zona bening yang paling besar ditunjukkan
oleh isolat FRS dengan diameter zona bening
19,525 mm.
Indeks proteolitik merupakan gambaran
dari kemampuan isolate bakteri proteolitik dalam
merombak protein dengan membandingkan besar
zona beningnya dengan besar diameter koloni
(Widhyastuti & Dewi 2001). Media yang
digunakan dalam penelitian ini untuk seleksi
bakteri proteolitik mengandung skim milk dan
agar (Widyastuti & Naiola 2002). Susu
merupakan media yang sesuai untuk perumbuhan
mikroba karena memiliki banyak kandungan
nutrient. Degradasi protein susu oleh protease
menjadi asam amino mengabitkan terjadinya
perubahan warna yang semulanya putih menjadi
tidak berwarna. Jika isolate bakteri yang diuji
mengandung protease, maka akan membentuk
zona be ing disekitar koloni (Amelinda 2010).
Menurut Susanti (2002) susu skim
mengandung kasein yang dimasukan kedalam
medium pertumbuhan bakteri berfungsi sebagai
substrat enzim. Hidrolisis kasein digunakan untuk
menunjukan aktivitas hidrolitik protease. Protease
mengkatalisis degradasi kasein yaitu dengan
memutuskan ikatan peptide CO-NH dengan
masuknya air kedalam molekul. Hasil perombakan
polimer protein hanya ditunjukan dengan adanya
zona bening yang menandakan protein telah
diromabk menjadi senyawa peptide dan asam amino
yang sifatnya terlarut dalam medium.
Isolat bakteri proteolitik pada rusip ikan teri
hitam memiliki zona bening paling banyak pada
isolate dengan kode FRS. Dan yang memiliki indeks
proteolitik tertinggi pada isolate bakteri dengan kode
LBR. Menurut Lehnibger (1998) aktivitas enzim
dipengaruhi oleh bebrapa faktor yaitu pH,
konsentrasi substrat dan enzim, suhu dan adanya
activator atau inhibitor.
Bakteri penghasil enzim protease ditandai
dengan terbentuknya zona bening karena adanya
pemecahan molekul protein pada susu skim yang
ditambahkan ke dalam media. Berdasarkan hasil uji
produksi enzim protease yang diikubasi selama 24
jam didapat hasil diameter zona bening bakteri lebih
dari 12 mm yang menunjukan bahwa isolat dengan
kode FRS,LBR,AKH dan TJH menghasilkan enzim
protease.Zona bening yang dihasilkan diukur
menggunakan jangka sorong untuk mengetahui
diameter yang dihasilkan bakteri (Sabrina et al.,
2018; Sabrina et al., 2018). Penelitian Borla dkk.
(2010) dan Ethica dkk. (2018) menyatakan
timbulnya zona bening dengan diameter 12 mm atau
lebih disekitar media adanya bakteri yang dapat
menghidrolisis protein melalui produksi enzim.
Namun, menurut Muchtadi dan Betty (1983)
kemampuan bakteri dalam menguraikan protein
berbeda antara 1 spesies dengan yang lainnya
(Muchtadi dan Betty, 1983, Paskandani dkk., 2014).
Berdasarkan hasil yang didapatkan maka dapat
dikatakan isolat FRS,LBR,AKH dan TJH merupakan
bakteri proteolitik karena dapat membentuk zona
bening.
KESIMPULAN
Rusip ikan teri hitam (Stolephorus
commersonnii) difermentasi secara anaerob
dengan kurun waktu kurang lebih dua minggu,
dengan hasil perombakan polimer protein hanya
ditunjukan dengan adanya zona bening yang
menandakan protein telah dirombak menjadi
senyawa peptide dan asam amino yang sifatnya
terlarut dalam medium. Enzim protease yang
dihasilkan oleh bakteri menyebabkan kasein
terhidrolisis menjadi asam amino yang larut
sehingga warna putih akan menghilang dan
terbentuk zona bening di sekitar koloni bakteri.
Bakteri penghasil enzim protease ditandai
dengan terbentuknya zona bening karena
adanya pemecahan molekul protein pada susu
skim yang ditambahkan ke dalam media.
Berdasarkan hasil uji produksi enzim protease
yang diikubasi selama 24 jam didapat hasil
diameter zona bening bakteri lebih dari 12 mm
yang menunjukan bahwa isolat dengan kode
FRS, LBR, AKH dan TJH menghasilkan enzim
protease.
UCAPAN TERIMA KASIH
Terimakasih kepada Dosen pengampu
mata kuliah Mikrobiologi terapan serta asisten
dosen yang banyak membantu selama proses
penelitian berlangsung.
DAFTAR PUSTAKA
Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi.
2015. Berita Teknologi Argoindustri &
Bioteknologi: Ciptakan Pabrik Enzim
Pertama di Indonesia, BPPT Transfer
Teknologi Produksi Enzim ke PT
Petrosida Gresik
Lingewati, S. 2012. Skrining dan Isolasi bakteri
penghasil enzim protease dari limbah
tebu. Undergraduated Thesis. Widya
Mandala Catholic University Surabaya.
Koesoemawardani, D., Rizal, S., dan
Susilowati, R. 2015. Perubahan Sifat
Mikrobiologi dan Kimia Rusip dengan
Perbedaan Waktu Penambahan Gula Aren
Cair. Prosiding Seminar Agroindustri dan
Lokakarya Nasional FKPT-TPI. 2-3
September 2015, Lampung. Hal. 132-139.
Borla OP, Davidovich LA, Roura SI.2010.
Isolation and Characterization of
Proteolytic Microorganisms from Fresh
and Fermented Cabbage. LWT-Food
Science and Technology 43(2):298-301.
Choirunnisa, H. Sari, R.Y. dan Hastuti, U.S.,
2017. Identifikasi dan Uji Kemampuan
Hidrolisis pada Bakteri Amilolitik dan
Proteolitik yang Diisolasi dari Wadi,
Makanan Khas Kalimantan Tengah.
Jurnal Bionature. 18 (2). 99-109
Irena, Amelinda. 2010. Isolasi dan Optimasi
Protease Bakteri Termofilik dari Sumber
Air Panas Tangkuban Perahu Bandung.
Skripsi. Bogor: Departemen Biokimia
FMIPA IPB Bogor.
Sabrina, A.N. and Ethica, S.N., 2018,
November. Potensi Bakteri Indigen
Penghasil Enzim Protease dan Lipase
sebagai Agen Bioremediasi Limbah
Biomedis Puskesmas Tlogosari Kulon. In
Prosiding Seminar Nasional Mahasiswa
Unimus(Vol. 1).Steinkraus, K. H. 2002.
Fermentation in World Food Processing
Comprehensive Reviews in Foos Science
and Food Safety. 1:23-32.
Putri, Yunita Silvia., 2012. Skrining dan Uji
Aktivitas Enzim Protease Bakteri dari
Limbah Rumah Pemotongan Hewan.
Skripsi. Universitas Airlangg
Widhyastuti N & Dewi RM. 2001. Isolasi
bakteri proteolitik dan optimasi produksi
protease. Laporan Teknik Proyek
Inventarisasi dan Karakterisasi
Sumberdaya Hayati. Pusat penelitian
Biologi. LIPI.
Widhyastuti N, Naiola E. 2002. Isolasi, seleksi,
dan optimasi produksi protease dari
beberapa isolat bakteri. Berita Biologi
6:467-