1.

Metode Penapisan Fitokimia

Skrining fitokimia atau penapisan kimia adalah tahapan awal untuk
mengidentifikasi kandungan kimia yang terkandung dalam tumbuhan, krna pada
tahap ini kita bisa mengetahui golongan senyawa kimia yang dikandung
tumbuhan yang sedang kita uji/teliti.
Metode yang digunakan dalam skrining fitokimia harus memiliki persyaratan :
metodenya sederhana dan cepat
peralatan yang digunakan sesedikit mungkin
selektif dalam mengidentifikasi senyawa-senyawa tertentu
dapat memberikan informasi tambahan mengenai keberadaan senyawa
tertentu dalam kelompok senyawa yang diteliti.
Golongan senyawa kimia dapat ditentukan dengan cara:
uji warna
penentuan kelarutan
bilangan Rf
ciri spektrum UV
namun secara umum penentuan golongan senyawa kimia dilakukan denga cara
uji warna dengan menggunakan pereaksi yang spesifik karena dirasakan lebih
sederhana.
Senyawa kimia berdasarkan asal biosintesis, sifat kelarutan, gugus fungsi
digolongkan menjadi :
Senyawa fenol, bersifat hidrofil, biosintesisnya berasal dari asam shikimat
terpenoid, berasal dari lipid, biosintesisnya berasal dari isopentenil pirofosfat
asam organik, lipid dan sejenisnya, biosintesisnya berasal dari asetat
senyawa nitrogen, bersifat basa dan bereaksi positif terhadap ninhidrin atau
dragendorf
gula dan turunannya
makromolekul, umumnya memiliki bobot molekul yang tinggi
Sedangkan berdasarkan biogenesisnya senyawa bahan alam dikelompokkan
menjadi :
Asetogenin : flavonoid, lipid, lignan, dan kuinon
karbohidra : monosakarida, oligosakarida, dan polisakarida
isoprenoid : tepenoid, steroid, karotenoid
senyawa mengandung nitrogen : alkaloid, asam amino, protein, dan nukleat
Dari semua kelompok senyawa, skrining fitokimia umumnya hanya dilakukan
terhadap kelompok senyawa fenol, terpenoid, dan senyawa nitrogen.


1. senyawa fenol
Senyawa fenol ditandai dengan struktur cincin aromatik yang mengandung satu
atau dua penyulih hidroksil. cendrung mudah larut dalam air, contoh senyawa :
polifenol, flavonoid, tanin dan quinon

2. senyawa terpenoid
terpenoid tersusun dari molekul unit isoprena (C5), digolongkan berdasarkan
jumlah isoprena dari senyawa tersebut, seperti: monoterpen, dua isopren (C10),
tiga isopren (C15), empat (C20), C25, C30, C35, C40 :
monoterpen (C10) dan seskuiterpen (C15) : mudah menguap, komponen minyak
atsiri
diterpen (C20) : lebih sukar menguap
triterpen (C30) : sterol dan saponin (senyawa yang tidak menguap)
pigmen karetonoid : tetraterpenoid (C40)
3. senyawa nitrogen
senyawa nitrogen yang ada pada tumbuhan seperti : asam amino, amina,
alkaloid, glikosida, sianogen, porfirin, purin, piridin, sitokinin dan klorofil (pigmen
porifirin), tetapai kelah terbesar dari senyawa nitrogen adalah alkaloid.

Masalah pada skrining fitokimia biasanya adalah kesalahan menafsirkan hasil
analisis pengujian/skrining, seperti :
reaksi positif palsu adalah hasil pengujian menyatakan ada (positif), tapi
sebenarnya tidak ada (negatif), hal ini bisa disebabkan kesalahan alat, atau
pengaruh senyawa yang memiliki kesamaan sifat maupun struktur atom yang
identik
reaksi negatif palsu adalah hasil pengujian menyatakan tidak ada (negatif), tapi
sebenarnya ada (positif), hal ini bisa disebabkan kurang sensitifnya alat, atau
karena kadar didalam bahan uji terlalu sedikit, atau bahan ujinya (ekstrak
simplisia) tidak memenuhi syarat, oleh karena itu senyawa yang tadinya ada
hilang/rusak karna reaksi enzimatik maupun hidrolisis.
2. Ekstraksi
Ekstraksi adalah suatu proses pemisahan dari bahan padat maupun cair dengan
bantuan pelarut. Pelarut yang digunakan harus dapat mengekstrak substansi
yang diinginkan tanpa melarutkan material lainnya. Ekstraksi merupakan proses
pemisahan suatu bahan dari campurannya, ekstraksi dapat dilakukan dengan
berbagai cara. Ekstraksi menggunakan pelarut didasarkan pada kelarutan
komponen terhadap komponen lain dalam campuran (Suyitno, 1989).
Tehnik ekstraksi lainnya misalnya menggunakan air untuk mengambil pigmen
alami dari tumbuhan, seperti: daun, dll. Contoh: Ekstraksi pigmen biru dari daun
tanaman Baphicacanthus cusia Brem dan Indigofera tintoria Linn (Tanaman asli
negeri Gajah Thailand). ekstraksi betasianin pada tanaman suku Amarantaceae
dapat dilakukan dengan 2 tahap yaitu ekstraksi dengan menggunakan air
kemudian dilanjutkan dengan menggunakan metanol 80%. Namun ekstraksi
pewarna alami dengan metanol, diragukan aspek keamanan pangannya.
Faktor-faktor yang mempengaruhi laju ekstraksi adalah:
Tipe persiapan sampel
Waktu ekstraksi
Kuantitas pelarut
Suhu pelarut
Tipe pelarut

Secara umum, terdapat empat situasi dalam menentukan tujuan ekstraksi:
1. Senyawa kimia telah diketahui identitasnya untuk diekstraksi dari organisme.
Dalam kasus ini, prosedur yang telah dipublikasikan dapat diikuti dan dibuat
modifikasi yang sesuai untuk mengembangkan proses atau menyesuaikan
dengan kebutuhan pemakai.

2. Bahan diperiksa untuk menemukan kelompok senyawa kimia tertentu,
misalnya alkaloid, flavanoid atau saponin, meskipun struktur kimia sebetulnya
dari senyawa ini bahkan keberadaannya belum diketahui. Dalam situasi seperti
ini, metode umum yang dapat digunakan untuk senyawa kimia yang diminati
dapat diperoleh dari pustaka. Hal ini diikuti dengan uji kimia atau kromatografik
yang sesuai untuk kelompok senyawa kimia tertentu

3. Organisme (tanaman atau hewan) digunakan dalam pengobatan tradisional,
dan biasanya dibuat dengan cara, misalnya Tradisional Chinese medicine (TCM)
seringkali membutuhkan herba yang dididihkan dalam air dan dekok dalam air
untuk diberikan sebagai obat. Proses ini harus ditiru sedekat mungkin jika ekstrak
akan melalui kajian ilmiah biologi atau kimia lebih lanjut, khususnya jika
tujuannya untuk memvalidasi penggunaan obat tradisional.

4. Sifat senyawa yang akan diisolasi belum ditentukan sebelumnya dengan cara
apapun. Situasi ini (utamanya dalam program skrining) dapat timbul jika
tujuannya adalah untuk menguji organisme, baik yang dipilih secara acak atau
didasarkan pada penggunaan tradisional untuk mengetahui adanya senyawa
dengan aktivitas biologi khusus.

Proses pengekstraksian komponen kimia dalam sel tanaman yaitu pelarut
organik akan menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang
mengandung zat aktif, zat aktif akan larut dalam pelarut organik di luar sel, maka
larutan terpekat akan berdifusi keluar sel dan proses ini akan berulang terus
sampai terjadi keseimbangan antara konsentrasi cairan zat aktif di dalam dan di
luar sel.

Prinsip ekstraksi sebagai berikut:

- Prinsip Maserasi
Penyarian zat aktif yang dilakukan dengan cara merendam serbuk simplisia
dalam cairan penyari yang sesuai selama tiga hari pada temperatur kamar
terlindung dari cahaya, cairan penyari akan masuk ke dalam sel melewati dinding
sel. Isi sel akan larut karena adanya perbedaan konsentrasi antara larutan di
dalam sel dengan di luar sel. Larutan yang konsentrasinya tinggi akan terdesak
keluar dan diganti oleh cairan penyari dengan konsentrasi rendah ( proses difusi
). Peristiwa tersebut berulang sampai terjadi keseimbangan konsentrasi antara
larutan di luar sel dan di dalam sel. Selama proses maserasi dilakukan
pengadukan dan penggantian cairan penyari setiap hari. Endapan yang diperoleh
dipisahkan dan filtratnya dipekatkan.
Maserasi merupakan cara penyarian sederhana yang dilakukan dengan cara
merendam serbuk simplisia dalam cairan penyari selama beberapa hari pada
temperatur kamar dan terlindung dari cahaya. Metode maserasi digunakan
untuk menyari simplisia yang mengandung komonen kimia yang mudah larut
dalam cairan penyari, tidak mengandung benzoin, tiraks dan lilin.
Keuntungan dari metode ini adalah peralatannya sederhana. Sedang kerugiannya
antara lain waktu yang diperlukan untuk mengekstraksi sampel cukup lama,
cairan penyari yang digunakan lebih banyak, tidak dapat digunakan untuk bahan-
bahan yang mempunyai tekstur keras seperti benzoin, tiraks dan lilin.
Metode maserasi dapat dilakukan dengan modifikasi sebagai berikut :
Modifikasi maserasi melingkar
Modifikasi maserasi digesti
Modifikasi Maserasi Melingkar Bertingkat
Modifikasi remaserasi
Modifikasi dengan mesin pengaduk
Metode Soxhletasi
Soxhletasi merupakan penyarian simplisia secara berkesinambungan, cairan
penyari dipanaskan sehingga menguap, uap cairan penyari terkondensasi
menjadi molekul-molekul air oleh pendingin balik dan turun menyari simplisia
dalam klongsong dan selanjutnya masuk kembali ke dalam labu alas bulat
setelah melewati pipa sifon
Keuntungan metode ini adalah:
- Dapat digunakan untuk sampel dengan tekstur yang lunak dan tidak tahan
terhadap pemanasan secara langsung.
- Digunakan pelarut yang lebih sedikit
- Pemanasannya dapat diatur
Kerugian dari metode ini:
- Karena pelarut didaur ulang, ekstrak yang terkumpul pada wadah di sebelah
bawah terus-menerus dipanaskan sehingga dapat menyebabkan reaksi peruraian
oleh panas.
- Jumlah total senyawa-senyawa yang diekstraksi akan melampaui kelarutannya
dalam pelarut tertentu sehingga dapat mengendap dalam wadah dan
membutuhkan volume pelarut yang lebih banyak untuk melarutkannya.
- Bila dilakukan dalam skala besar, mungkin tidak cocok untuk menggunakan
pelarut dengan titik didih yang terlalu tinggi, seperti metanol atau air, karena
seluruh alat yang berada di bawah komdensor perlu berada pada temperatur ini
untuk pergerakan uap pelarut yang efektif.
Metode ini terbatas pada ekstraksi dengan pelarut murni atau campuran
azeotropik dan tidak dapat digunakan untuk ekstraksi dengan campuran pelarut,
misalnya heksan :diklormetan = 1 : 1, atau pelarut yang diasamkan atau
dibasakan, karena uapnya akan mempunyai komposisi yang berbeda dalam
pelarut cair di dalam wadah.

- Prinsip Perkolasi
Penyarian zat aktif yang dilakukan dengan cara serbuk simplisia dimaserasi
selama 3 jam, kemudian simplisia dipindahkan ke dalam bejana silinder yang
bagian bawahnya diberi sekat berpori, cairan penyari dialirkan dari atas ke
bawah melalui simplisia tersebut, cairan penyari akan melarutkan zat aktif dalam
sel-sel simplisia yang dilalui sampai keadan jenuh. Gerakan ke bawah disebabkan
oleh karena gravitasi, kohesi, dan berat cairan di atas dikurangi gaya kapiler yang
menahan gerakan ke bawah. Perkolat yang diperoleh dikumpulkan, lalu
dipekatkan.
Perkolasi adalah cara penyarian dengan mengalirkan penyari melalui serbuk
simplisia yang telah dibasahi.Keuntungan metode ini adalah tidak memerlukan
langkah tambahan yaitu sampel padat (marc) telah terpisah dari ekstrak.
Kerugiannya adalah kontak antara sampel padat tidak merata atau terbatas
dibandingkan dengan metode refluks, dan pelarut menjadi dingin selama proses
perkolasi sehingga tidak melarutkan komponen secara efisien.

- Prinsip Soxhletasi
Penarikan komponen kimia yang dilakukan dengan cara serbuk simplisia
ditempatkan dalam klonsong yang telah dilapisi kertas saring sedemikian rupa,
cairan penyari dipanaskan dalam labu alas bulat sehingga menguap dan
dikondensasikan oleh kondensor bola menjadi molekul-molekul cairan penyari
yang jatuh ke dalam klonsong menyari zat aktif di dalam simplisia dan jika cairan
penyari telah mencapai permukaan sifon, seluruh cairan akan turun kembali ke
labu alas bulat melalui pipa kapiler hingga terjadi sirkulasi. Ekstraksi sempurna
ditandai bila cairan di sifon tidak berwarna, tidak tampak noda jika di KLT, atau
sirkulasi telah mencapai 20-25 kali. Ekstrak yang diperoleh dikumpulkan dan
dipekatkan.

- Prinsip Refluks
Penarikan komponen kimia yang dilakukan dengan cara sampel dimasukkan ke
dalam labu alas bulat bersama-sama dengan cairan penyari lalu dipanaskan, uap-
uap cairan penyari terkondensasi pada kondensor bola menjadi molekul-molekul
cairan penyari yang akan turun kembali menuju labu alas bulat, akan menyari
kembali sampel yang berada pada labu alas bulat, demikian seterusnya
berlangsung secara berkesinambungan sampai penyarian sempurna,
penggantian pelarut dilakukan sebanyak 3 kali setiap 3-4 jam. Filtrat yang
diperoleh dikumpulkan dan dipekatkan. Keuntungan dari metode ini adalah
digunakan untuk mengekstraksi sampel-sampel yang mempunyai tekstur kasar
dan tahan pemanasan langsung. Sedangkan kerugian metode ini adalah
membutuhkan volume total pelarut yang besar dan sejumlah manipulasi dari
operator.

- Prinsip Destilasi Uap Air
Penyarian minyak menguap dengan cara simplisia dan air ditempatkan dalam
labu berbeda. Air dipanaskan dan akan menguap, uap air akan masuk ke dalam
labu sampel sambil mengekstraksi minyak menguap yang terdapat dalam
simplisia, uap air dan minyak menguap yang telah terekstraksi menuju
kondensor dan akan terkondensasi, lalu akan melewati pipa alonga, campuran
air dan minyak menguap akan masuk ke dalam corong pisah, dan akan memisah
antara air dan minyak atsiri.
Destilasi uap adalah metode yang popular untuk ekstraksi minyak-minyak
menguap (esensial) dari sampel tanaman. Metode destilasi uap air
diperuntukkan untuk menyari simplisia yang mengandung minyak menguap atau
mengandung komponen kimia yang mempunyai titik didih tinggi pada tekanan
udara normal.

- Prinsip Rotavapor
Proses pemisahan ekstrak dari cairan penyarinya dengan pemanasan yang
dipercepat oleh putaran dari labu alas bulat, cairan penyari dapat menguap 5-
10 C di bawah titik didih pelarutnya disebabkan oleh karena adanya penurunan
tekanan. Dengan bantuan pompa vakum, uap larutan penyari akan menguap
naik ke kondensor dan mengalami kondensasi menjadi molekul-molekul cairan
pelarut murni yang ditampung dalam labu alas bulat penampung.

3. Fraksinasi

Di alam senyawa kimia umumnya terdapat dalam bentuk campuran, oleh sebab
itu diperlukan pemisahan, fraksinasi adalah proses pemisahan suatu zat dari
campuran zat tersebut, pemisahan dilakukan tehnik yang bermacam macam
seperti kromatografi (KKt, KLT, KCKT, KCV, KK, KGC) dan ekstraksi cair-cair.
terkadang digunakan kombinasi keduanya, seringkali dilakukan secara berulang-
ulang agar didapat fraksi zat yang lebih banyak.



Metode fraksinasi/pemisahan umumnya:
1. Ekstraksi Cair-cair
Ekstraksi cair-cair adalah metode pemisahan dengan menggunakan dua cairan
pelarut yang tidak saling bercampur, sehingga senyawa tertentu terpisahkan
menurut kesesuaian sifat dengan cairan pelarut (prinsip solve dissolve like).

2. Kromatografi
Kromatograsi adalah teknik pemisahan zat dari campuran berdasarkan
perbedaan migrasi komponen-komponen tersebut dari fase diam oleh fase
gerak. pemisahan ini dilakukan berdasarkan sifat fisika-kimia umum dari molekul
seperti :
1. kecenderungan molekul untuk melarut dalam cairan (kelarutan)
2. kecenderungan molekul untuk melekat pada permukaan serbuk halus
(adsorbsi/penjerapan)
3. kecenderungan molekul untuk menguap atau berubah ke keadaan uap
(keatsirian)
4. UJI KEMURNIAN
Berbagai metode kromatografi memberikan cara pemisahan paling kuat
dilaboratorium kimia. Metode kromatografi, karena pemanfaatannya yang leluasa,
dipakai secara luas untuk pemisahan analitik dan preparatif. Biasanya, kromatografi
analitik dipakai pada tahap permulaan untuk semua cuplikan , dan kromatografi
preparatif hanya dilakukan juka diperluk- an fraksi murni dari campuran. Pemisahan
secara kromatografi dilakukan dengan cara mengotak-atik langsung beberapa sifat
fisika umum dari molekul. Sifat utama yang terlibat ialah : (1) Kecenderungan
molekul untuk melarut dalam cairan (kelarutan), (2) Kecender -ungan molekul untuk
melekat pada permukaan serbuk halus (adsorpsi, penjerapan), dan (3)
Kecenderungan molekul untuk menguap atau berubah ke keadaan uap (keatsirian) .
Pemisahan atau pemurnian kandungan tumbuhan terutama dilakukan dengan
menggunakan salah satu dari empat teknik kromatografi atau gabungan teknik
tersebut. Keempat teknik kromatografi itu adalah kromatografi kertas (KKT),
Kromatografi lapis tipis (KLT), Kromatogfrafi gas cair (KGC), dan kromatografi cair
kinerja tinggi (KCKT).
Metode pemisahan dan pemurnian kandungan tumbuhan terutama dilakukan
dengan menggunakan salah satu dari empat teknik atau gabungan teknik tersebut.

1. Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Kedua cara ini serupa dalam hal fase diamnya berupa lapisan tipis dan fase geraknya
mengalir karena kerja kapiler. Perbedaannya dalam sifat dan fungsi fase diam.
Kromatografi Lapis Tipis Preparatif
Proses isolasi yang terjadi berdasarkan perbedaan daya serap dan daya partisi serta
kelarutan dari komponen-komponen kimia yang akan bergerak mengikuti kepolaran
eluen, oleh karena daya serap adsorben terhadap komponen kimia tidak sama, maka
komponen bergerak dengan kecepatan yang berbeda sehingga hal inilah yang
menyebabkan pemisahan.
Kromatotron
Proses isolasi yang terjadi berdasarkan adsorpsi dan partisi. Adsorpsi adalah senyawa
kimia dapat terpisah-pisah disebabkan oleh daya serap adsorban terhadap tiap-tiap
komponen kimia tidak sama. Sedangkan partisi adalah kelarutan tiap-tiap komponen
kimia dalam cairan pengelusi (eluen) tidak sama dimana arah gerakan eluen
disebabkan oleh gaya sentrifugal sehingga komponen kimia dapat bergerak dengan
kecepatan yang berbeda-beda yang menyebabkan terjadi pemisahan.

2. Kromatografi Gas Cair (KGC)
Pemisahan pada kromatografi gas didasarkan pada titik didih suatu senyawa
dikurangi dengan semua interaksi yang mungkin terjadi antara solute dengan fase
diam. Fase diam berupa gas akan mengelusi solute dari ujung kolom lalu
menghantarkannya ke detector. Penggunaan suhu yang meningkat (biasanya pada
kisaran 50-350C) bertujuan untuk menjamin bahwa solute akan menguap dan
karenanya akan cepat terelusi.
Ada 2 jenis kromatografi gas :
1. Kromatografi gas-cair (KGC)
Pada KGC ini, fase diam yang digunakan adalah cairan yang diikatkan pada
suatu pendukung sehingga solute akan terlarut dalam fase diam. Mekanisme sorpsi-
nya adalah partisi.
2. Kromatografi gas-padat (KGP)
Pada KGP ini, digunakan fase diam padatan (kadang-kadang polimerik).
Mekanisme sorpsi-nya adalah adsorpsi.
3. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)
KCKT dapat disamakan dengan KGC dalam hal kepekaan dan kemampuan
menghasilkan data kualitatif dan kuantitatif dengan sekali kerja saja. Perbedaannya
adalah fase diam yang terikat pada polimer berpori terdapat pada kolom baja tahan
karat yang bergaris tengah kecil dan fase gerak cair mengalir akibat tekanan yang
besar. Maka, dari berbagai kromatografi diatas, penggunaan untuk kualitatif dapat
digunakan KKt dan KLT serta KGC dan KCKT. Untuk penggunaan kuantitatif dan untuk
pemurnian (isolasi) maka dapat dipertimbangkan penggunaan
beberapa metode berikut, yaitu : KLT preparatif, kromatografi kolom (termasuk
kromatografi gas dan kromatografi cair kinerja tinggi).

4. KROMATOGRAFI KOLOM
Pelarut (fase gerak) dibiarkan mengalir melalui kolom karena aliran yang disebabkan
oleh gaya berat atau didorong dengan tekanan. Pita, senyawa linarut bergerak
melalui kolom dengan laju yang berbeda, memisah dan dikumpulkan berupa fraksi
ketika keluar dari alas kolom.
Kromatografi kolom merupakan metode kromatografi klasik yang masih banyak
digunakan. Kromatografi kolom digunakan untuk memisahkan senyawa-senyawa
dalam jumlah yang banyak berdasarkan adsorpsi dan partisi. Kemasan adsorben yang
sering digunakan adalah silika gel G-60, kieselgur, Al
2
O
3
, dan Diaion. Cara
pembuatannya ada dua macam :
Cara kering yaitu silika gel dimasukkan ke dalam kolom yang telah diberi
kapas kemudian ditambahkan cairan pengelusi.
Cara basah yaitu silika gel terlebih dahulu disuspensikan dengan cairan
pengelusi yang akan digunakan kemudian dimasukkan ke dalam kolom melalui
dinding kolom secara kontinyu sedikit demi sedikit hingga masuk semua, sambil kran
kolom dibuka. Eluen dialirkan hingga silika gel mapat, setelah silika gel mapat eluen
dibiarkan mengalir sampai batas adsorben kemudian kran ditutup dan sampel
dimasukkan yang terlebih dahulu dilarutkan dalam eluen sampai diperoleh kelarutan
yang spesifik. Kemudian sampel dipipet dan dimasukkan ke dalam kolom melalui
dinding kolom sedikit demi sedikit hingga masuk semua, dan kran dibuka dan diatur
tetesannya, serta cairan pengelusi ditambahkan. Tetesan yang keluar ditampung
sebagai fraksi-fraksi


5. KROMATOGRAFI KERTAS
Kromatografi kertas atau KKt pada hakekatnya adalah KLT pada lapisan tipis selulosa
atau kertas. Cara ini ditemukan jauh sebelum KLT dan tetap dipakai secara efektif
selama bertahun-tahun untuk pemisahan molekul biologi seperti asam amino, gula
dan nukleotida. Metode ini merupakan metode KCC dengan fase diam cair, biasanya
air pada serabut kertas. KKt tidak memerlukan pelat pelindung dan kertas dapat
mudah diperoleh dengan dalam bentuk murni sebagai kertas saring. Lapisan selulosa
harus dicetak lebih panjang dari pada serabut pada lapisan selulosa yang lazim,
menyebabkan lebih banyak terjadi difusi kesamping dan bercak lebih besar Akhirnya
lapisan selulosa lebih rapat dan pelarut lebih cenderung mrngalir melaluinya. lebih
cepat menghasilkan pemisahan lebih tajam (Roy, 1991).
Mekanisme pemisahan dengan kromatografi kertas prinsipnya sama dengan
mekanisme pada kromatografi kolom. Adsorben dalam kromatografi kertas adalah
kertas saring, yakni selulosa. Sampel yang akan dianalisis ditotolkan ke ujung kertas
yang kemudian digantung dalam wadah. Kemudian dasar kertas saring dicelupkan
kedalam pelarut yang mengisi dasar wadah. Fasa mobil (pelarut) dapat saja beragam.
Air, etanol, asam asetat atau campuran zat-zat ini dapat digunakan. Kromatografi
kertas diterapkan untuk analisis campuran asam amino dengan sukses besar Ketika
pelarut mencapai ujung atas kertas proses dihentikan. Setiap asam amino bergerak
dari titik awal sepanjang jarak tertentu. Dari nilai R, masing-masing asam amino
diidentifikasi. Kromatografi kertas dua-dimensi (2D) menggunakan kertas yang luas
bukan lembaran kecil, dan sampelnya diproses secara dua dimensi dengan dua
pelarut ( www.Indigo. Com ,1994).



5. ISOLASI PREPENTIF
Kromatografi Lapis Tipis Preparatif merupakan proses isolasi yang terjadi
berdasarkan perbedaan daya serap dan daya partisi serta kelarutan dari komponen-
komponen kimia yang akan bergerak mengikuti kepolaran eluen oleh karena daya
serap adsorben terhadap komponen kimia tidak sama, maka komponen bergerak
dengan kecepatan yang berbeda sehingga hal inilah yang menyebabkan pemisahan.
Kromatografi lapis tipis preparatif . Salah satu metode pemisahan yang memerlukan
biaya paling murah dan memakai peralatan sangat sederhana ialah kromatografi
lapis tipis preparatif (KLTP).Walaupun KLTP dapat memisahkan dalam jumlah
gram,sebagian besar pemakaian hanya dalam jumlah miligram. KLT preparatif
dilakukan dengan menggunakan lapisan tebal (sampai 1 mm) sebagai pengganti
lapisan penyerap yang tipis (Harborne, 1987)
Pada kromatografi lapis tipis preparatif, cuplikan yang akan dipisahkan ditotolkan
berupa garis pada salah satu sisi pelat lapisan besar dan dikembangkan secara tegak
lurus pada garis cuplikan sehingga campuran akan terpisah menjadi beberapa pita.
Pita ditampakkan dengan cara yang tidak merusak jika senyawa itu tanwarna, dan
penyerap yang mengandung senyawa pita dikerok dari pelat kaca. Kemudian
cuplikan dielusi dari penyerap dengan pelarut polar. Cara ini berguna untuk
memisahkan campuran reaksi sehingga diperoleh senyawa murni untuk telaah
pendahuluan, untuk menyiapkan cuplikan analisis, untuk meneliti bahan alam yang
lazimnya berjumlah kecil dan campurannya rumit dan untuk memperoleh cuplikan
yang murni untuk mengkalibrasi kromatografi lapis tipis kuantitatif (Gritter, 1991)
Pengembangan plat KLTP biasanya dilakukan dalam bejana kaca yang dapat
menampung beberapa plat. Keefisienan pemisahan dapat ditingkatkan dengan cara
pengembangan berulang. Harus diperhatikan bahwa semakin lama senyawa
berkontak dengan penyerap maka semakin besar kemungkinan penguraian
(Hostettman, 1995)
Jel silika adalah bentuk dari silikon dioksida (silika). Atom silikon dihubungkan oleh
atom oksigen dalam struktur kovalen yang besar. Namun, pada permukaan jel silika,
atom silikon berlekatan pada gugus -OH. Jadi, pada permukaan jel silika terdapat
ikatan Si-O-H selain Si-O-Si
Permukaan jel silika sangat polar dan karenanya gugus -OH dapat membentuk ikatan
hidrogen dengan senyawa-senyawa yang sesuai disekitarnya, sebagaimana halnya
gaya van der Waals dan atraksi dipol-dipol. Fase diam lainnya yang biasa digunakan
adalah alumina-aluminium oksida. Atom aluminium pada permukaan juga memiliki
gugus -OH. Apa yang kita sebutkan tentang jel silika kemudian digunakan serupa
untuk alumina.
Analisis preparatif ditujukan untuk memisahkan analit dalam jumlah yang banyak
lalu senyawa yang telah dipisahkan ini dianalisis lebih lanjut, misalkan dengan
spektrofotometri atau dengan teknik kromatografi lain. Pada KLT preparatif ini,
sampel ditotolkan dalam lempeng dengan lapisan yang besar lalu dikembangkan dan
dideteksi dengan cara yang non-destruktif. Bercak yang mengandung analit yang
dituju selanjutnya dikerik dan dilakukan analisis selanjutnya
a) Penyerap (adsorben)
Berbagai penelitian telah dilakukan untuk memeriksa pengaruh ketebalan penyerap
terhadap kualitas pemisahan tetapi ketebalan yang sering dipakai adalah 0,5 -2 mm .
ukuran pelat kromatografi biasanya 20x20 cm atau 20x40 cm . pembatasan
ketebalan ukuran lapisan dan ukuran pelat sudah tentu mengurangi jumlah bahan
yang dapat dipisahkan dengan KLTP. Penyerap yang paling umu ialah silica gel dan
dipakai untuk pemisahan campuran senyawa lipofil maupun campuran senyawa
hidrofil. Untuk pembuatan lapisan tanpa retak dianjurkan memakai penyerap niaga
yang tersedia. Ukuran partikel dan porinya kurang lebih sama dengan ukuran tingkat
mutu KLT. (Hostmann. 1995 : 9)
Pelat KLTP dapat dibuat sendiri atau dibeli dengan sudah terlapisi penyerap
(biasanya disebut pelat siap pakai atau pelat pralapis). Keuntungan membuat pelat
sendiri ialah bahwa ketebalan dan susnan lapisan dapat kia atur sendiri. Jadi, perak
nitrat, senyawa dapr, dsb. Dapat dicampur dengan penyerap pembuatan lapisan
penyerap. (Hostettmann. 1995 : 9)
Pembuatan lapisan penyerap yang diperlukan dapat dikerjakan denganmemakai
salah satu dari alat penyaput niaga yang banyak jenisnya misalnya dari camag,
desaga dsb. Petunjuk untuk penggunaan pelat biasanya terdapat pada kemasan
penyerap yang bersangkutan. (Hostettmann. 1995 : 9
b) Penotolan Cuplikan
cuplikan dilarutkan dengan sedikit pelarut sebelum ditotolkan pada pelat KLTP.
Pelarut yang baik ialah pelarut atsiri (heksana, diklorometana, etil asetat), karena jika
tidak atsiri terjadi pelebaran pita. Konsentrasi cuplikan harus sekitar 5-10%. Cuplikan
ditotolkan berupa pita yang harus sesempit mungkin karena pemisahann bergantung
pada lebar pita. Penotolan dapat dilakukan dengan tangan (pipet) tetapi lebih baik
dengna penotolan otomatis (camag, desaga, dsb). Untuk pita yang terlalu lebar,
dapat dilakukan pemekatan dengan cara pengembangan memakai palerut polar
sampai kira-kira 2 cm diatas tempat totolan . kemudian pelat dikeringkan dan dielusi
dengan pelarut yang diinginkan (Stahl 1967). Pelat pralapis khusus dengan daerah
pemekatan dapat dibeli. (Hostettmann. 1995 : 9)
c) Isolasi Senyawa Yang Sudah Terpisah
Kebanyakan penyerap KLTP mengandung indikator fluoresensi yang membantu
mendeteksi kedudukan pita yang terpisah sepanjang senyawa yang dipisahkan
menyerap siunar UV. Akan tetapi beberapa indicator menimbulkan masalah bereaksi
dengan asam kadang-kadang asam asetat.
Untuk senyawa yang tidak menyerap UV ada beberapa pilihan :
Menyemprot dengan air (misalnya saponini)
Menutup pelat dengan sepotong kaca meyemprot salah satu sisi dengna
pereaksi semprot.
Menambahkan senyawa pembanding
Pita yang kedudukanya telah diketahui dikerok dari pelat dengan spatula atau
pengerok berbentuk tabung yang disambungkan ke pengumpul vakum. Cara terakhir
tidak dapt dilakukan untuk senyawa peka karena penyerap yang mengandung
senyawa yang sudah murni terus menerus kena aliran udara dan risiko kena
otooksidasi selalu ada. Cara mengumpulkan mana pun yang dipakai, senyawa harus
diekstrasi dari penyerap dengan pelarut yang paling kurang polar yang mungkin
(sekitar 5 ml pelarut untuk 1 gram penyerap). Harus diperhatikan bahwa makin lama
senyawa berkontak denga penyerap makin besar kemungkinan penguraian. Ekstrak
disaring melalui frit kaca berkeporian 4 dan kemudian melalui membran 0,2-0,45
m. (Hostettmann. 1995 : 11)

d) Keuntungan Dan Kerugian KLTP
keuntungan :
Salah satu pemisahan yang memerlukan pembiayaan paling murah dan memakai
peralatan paling dasar adalah kromatografi lapis tipis preparatif.
Kerugian:
Ketebalan dari lempeng menyebabkan waktu yang dibutuhkan menjadi lebih lama
dibadingkan dengan KLT pada umumnya
e) Dasar Pertimbangan Penggunaan KLTP :
Pada Kromatografi Lapis Tipis (KLT), zat penjerap merupakan lapisan tipis serbuk
halus yang dilapiskan pada lempeng kaca, plastik ataulogam secara merata. Dengan
memakai KLT, pemisahan senyawa yang amat berbeda seperti senyawa organik alam
dan senyawa organik sintetik, kompleks anorganik-anorganik dan bahan ion
anorganik dapat dilakukan beberapa menit dengan alat yang harganya tidak terlalu
mahal

6. Isolasi Minyak Atsiri
Metode isolasi minyak atsiri dapat dilakukan dengan beberapa cara yaitu:

1. Penyulingan (destilasi)
Penyulingan adalah proses pemisahan komponen berdasarkan perbedaan titik
didihnya. Prinsip dasar penyulingan adalah cairan dirubah menjadi uap pada titik
didihnya, kemudian uap tersebut dikondensasikan lagi ke dalam bentuk cairan
dengan proses pendinginan
Penyulingan dapat dilakukan dengan bebagai cara, yaitu :
a. Penyulingan dengan air
b. Penyulingan dengan air dan uap
c. Penyulingan dengan uap

2. Ekstraksi/ penyarian dengan pelarut organik (mudah menguap) yang sesuai
Prinsipnya adalah melarutkan minyak atsiri yang terdapat dalam simplisia
dengan pelarut organik yang mudah menguap yang sesuai. Metode penyarian
digunakan untuk minyak-minyak atsiri yang tidak tahan dengan pemanasan.
Metode ini banyak digunakan karena rendahnya kadar minyak dalam tanaman,
selain itu cara ini dianggap paling efektif karena sifat minyak atsiri yang larut
sempurna di dalam bahan pelarut organik nonpolar.

3. Enflurage
Prinsipnya adalah metode perlekatan bau dengan menggunakan media lilin dan
memanfaatkan aktivitas enzim yang diyakini masih aktif selama sekitar 15 hari
sejak bahan minyak atsiri dipanen. Metode ini digunakan karena ada beberapa
jenis bunga yang setelah dipetik enzimnya masih menunjukkan kegiatan dalam
menghasilkan minyak atsiri sampai beberapa minggu, misalnya bunga melati.
Diperlukan perlakuan khusus secara langsung agar tidak mengubah aktivitas
enzim.

4. Penyarian dengan lemak padat
Biasanya untuk memperoleh minyak atsiri dari bunga-bungaan
a. tanpa pemanasan (enfleurage)
b. dengan lemak panas (maserasi)

5. Pemerasan
Umumnya dilakukan terhadap bahan berupa buah atau kulit buah dari tanaman
yang termasuk keluarga Citrus karena minyak atsirinya rusak oleh penyulingan
(tidak stabil dan idak tahan pemanasan). Karena tekanan pada pemerasan, sel-
sel yang mengandung minyak lemak pecah dan minyak atsiri keluar dan mengalir
ke permukaan. Metode ini hanya cocok untuk minyak atsiri yang rendamannya
relatif besar.

6. Penyarian dengan gas CO
2

Metode berdasarkan pada kelarutan minyak atsiri yang baik dalam CO
2
.
Cara Pengujian
Kimia :
a. 2 mg serbuk simplisia ditambah 5 tetes asam sulfat pekat coklat hitam
b. 2 mg serbuk simplisia ditambah 5 tetes asam encer kuning
c. 2 mg serbuk simplisia ditambah 5 tetes larutan NaOH 5 % coklat tua
d. 2 mg serbuk simplisia ditambah 5 tetes kalium iodida 6 % kuning