MAKALAH BIOLOGI MOLEKULER

Asam Nukleat










HG 1:
Ghilandy Ramadhan (1206242012)
Maylina Chandra Puspita (1206212451)
Evania Hutasoit (1206248483)
Nindya Bestari (1206255122)
Sabrina Zahra Fitriani (1206249391)
Vifki Leondo (1206238665)



DEPARTEMEN TEKNIK KIMIA
FAKULTAS TEKNIK UNIVERSITAS INDONESIA
DEPOK
2014



1



DAFTAR ISI

DAFTAR ISI .........................................................................................................................1
STRUKTUR .........................................................................................................................2
FUNGSI ..............................................................................................................................9
SINTESIS ...........................................................................................................................14
DETEKSI .............................................................................................................................21
APLIKASI ............................................................................................................................30
DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................................34




































2



I. SRUKTUR ASAM NUKLEAT

Asam nukleat merupakan suatu biopolimer yang memiliki bobot molekul tinggi dengan
monomer-monomer yang disebut nukleotida. Asam nukleat terdapat pada semua sel hidup dan
bertugas untuk menyimpan dan mentransfer materi genetik, kemudian menerjemahkan informasi ini
secara tepat untuk mensintesis protein yang khas bagi masing-masing sel. Asam-asam nukleat
terdapat pada jaringan tubuh sebagai nukleoprotein, yaitu gabungan antara asam nukleat dengan
protein. Asam nukleat dalam sel ada dua jenis yaitu DNA (deoxyribonucleic acid) atau asam
deoksiribonukleat dan RNA (ribonucleic acid) atau asam ribonukleat. Baik DNA maupun RNA berupa
anion dan pada umumnya terikat oleh protein dan bersifat basa. Asam-asam nukleat ini merupakan
molekul-molekul yang membuat organisme dapat memproduksi komponen-komponen kompleksnya
dari suatu generasi ke generasi berikutnya. Nukleotida dari suatu asam nukleat terdiri dari gugus
fosfat, gula pentosa dan basa nitrogen. Gula pentosa merupakan molekul gula yang memiliki lima
atom karbon. Gula pentosa terdiri dari dua jenis, yaitu ribosa dan deoksiribosa. Perbedaan antara
gula ribosa dengan gula deoksiribosa terletak pada ikatan pada karbon nomor 2. Gula ribosa
memiliki ikatan dengan hidroksil pada karbon nomor 2, sedangkan gula deoksi ribosa tidak terdapat
ikatan dengan hidroksil pada karbon nomor dua atau tidak memiliki satu atom oksigen pada karbon
nomor 2. Oleh sebab itu, gula pentosa dinamakan gula deoksiribosa atau 2 deosiribosa.




Gambar 1. Gula ribosa dan deoksiribosa


(sumber : http://www.studyblue.com/notes/note/n/dna-structure/deck/107470)
Basa nitrogen pada asam nukleat terdiri dari dua jenis yaitu purin dan pirimidin. Basa purin
mempunyai dua buah cincin (bisiklik), sedangkan basa pirimidin hanya mempunyai satu cincin
(monosiklik). Basa purin terdiri dari dua jenis yaitu adenin dan guanin. Basa pirimidin terdiri dari tiga
jenis yaitu sitosin, timin dan urasil.










STRUKTUR DNA

Gambar 2. Purin dan pirimidin
(sumber : http://amit1b.wordpress.com/the-molecules-of-life/)
Basa nitrogen dapat bergabung dengan gula ribosa maupun deoksiribosa dengan cara
membentuk ikatan glikosidik antara N-9 pada purin atau N-1 pada pirimidin dengan atom karbon
nomor 1 dan melepas molekul air. Basa nitrogen dengan gula pentosa yang bergabung dinamakan
nukleosida. Terdapat dua posisi dalam nukleosida yaitu syn- dan anti-. Posisi syn terjadi jika basa
nitrogen dan gula pentosa menunjuk kearah yang sama. Sedangkan posisi anti- terjadi jika basa
nitrogen dengan gula pentosa menunjuk kearah yang berlainan.
Gugus fosfat dapat bergabung dengan gula ribosa maupun deosiribosa dengan membentuk
ikatan fosfomonoeter antara gugus fosfat dengan karbon nomor 5 pada gula ribosa maupun gula
deoksiribosa dan melepaskan molekul air. Jumlah fosfat yang terikat pada gula pentosa dapat lebih
dari satu fosfat. Monomer nukleotida dapat berikatan satu sama lain melalui ikatan fosfodiester

3

antara -OH di atom C nomor 3 nya dengan gugus fosfat dari nukleotida berikutnya untuk membentuk
polimer nukleotida. Kedua ujung polinukleotida yang dihasilkan menyisakan gugus fosfat di atom
karbon nomor 5' nukleotida pertama dan gugus hidroksil di atom karbon nomor 3 nukleotida terakhir.






Gambar 3. Ikatan fosfodiester dan glikosidik





STRUKTUR DNA

DNA Tersusun dari Rantai Polinukleotida
DNA memiliki ciri utama yaitu tersusun dari dua rantai polinukleotida yang saling berpilin
yang membentuk heliks ganda (double helix). Nukleotida terdiri dari fosfat yang bergabung dengan
gula pentosa, yang dikenal dengan 2-deoksiribosa, yang mengikat basa nitrogen. Gula pentosa
disebut dengan 2-deoksiribosa karena tidak ada hidroksil pada posisi 2 atau tidak memiliki satu
atom oksigen pada karbon nomer 2 yang membuat namanya disebut deoksi. Basa nitrogen dapat
bergabung dengan 2-deoksiribosa dengan melepas molekul air antara hidroksil pada 1 karbon yang
terdapat pada gula dan pada basa untuk membentuk ikatan glikosidik. Ikatan antara gula pentosa
dan basa nitrogen itu sendiri disebut dengan nukleosida. Fosfat dapat bergabung dengan 2-
deoksiribosa dengan cara melepaskan molekul air dari fosfat dan hidroksil pada 5 karbon yang
terdapat pada gula untuk membentuk fosfomonoeter. Penambahan fosfat pada nukleosida akan
membentuk nukleotida. Dengan demikian, dengan membuat ikatan glikosidik antara basa dengan
gula, dan dengan membuat ikatan fosfoester antara gula dan asam fosfat maka akan didapatkan
nukleotida. Nukleotida bergabung satu sama lain dalam rantai polinukleotida melalui 3 hidroksil dari
2-deoksiribosa dari satu nukleotida dan fosfat melekat pada 5 hidroksil nukleotida lain. Hal ini
merupakan hubungan fosfodiester dimana kelompok fosforil antara dua nukleotida memiliki satu
gula esterifikasi melalui 3 hidroksil dan gula kedua diesterifikasi melalui 5 hidroksil. Keterkaitan
fosfodiester memberikan suatu polaritas pada rantai DNA. Polaritas ini digambarkan oleh asimetri
nukleotida dan cara mereka bergabung. Rantai DNA memiliki 5 fosfat atau 5 hidroksil yang bebas
pada salah satu ujung dan 3 fosfat atau 3 hidroksil yang bebas pada ujung lainnya.













Gambar 4. Pembentukan nukleotida dengan pelepasan molekul air

Setiap Basa Nitrogen Memiliki Bentuk Tautomerik yang Lebih Disukai
Basa nitrogen pada DNA terbagi menjadi dua yaitu purin dan pirimidin. Purin terdiri dari
adenin dan guanin, sedangkan pirimidin terdiri dari sitosin dan timin. Basa nitrogen yang melekat
pada deoksiribosa melalui ikatan glikosidik pada N1 dari pirimidin atau N9 dari purin. Setiap basa

4

nitrogen ada dalam dua keadaan alternatif tautomerik, yang berada dalam kesetimbangan satu
sama lain. Atom nitrogen melekat pada cincin purin dan pirimidin dalam bentuk amino pada bagian
yang dominan dan jarang dipakai konfigurasi imino. Demikian juga, atom oksigen melekat pada
guanin dan timin yang biasanya memiliki bentuk keto dan jarang menggunakan konfigurasi enol.
Sebagai contoh, Gambar 5 menunjukkan tautomerization sitosin ke bentuk imino (a) dan guanin
menjadi bentuk enol (b). Seperti yang kita lihat, kapasitas untuk membentuk tautomer alternatif
sering menjadi sumber kesalahan selama sintesis DNA.

Gambar 5. Tautomerik basa nitrogen

Dua Untaian dari Double Helix Dimiliki Bersama oleh Pasangan Basa dalam Orientasi Anti-
Paralel
Double helix terdiri dari dua rantai polinukleotida yang disatukan secara lemah oleh ikatan
non-kovalen antara pasangan basa. Adenin pada suatu rantai selalu dipasangkan dengan timin
pada rantai lain, sedangkan guanin selalu dipasangkan dengan sitosin. Kedua untaian memiliki
heliks yang sama secara geometris, akan tetapi pasangan basa nitrogen mengikat dengan polaritas
yang berlawanan. Artinya, basa nitrogen 5 pada akhir satu untai dipasangkan dengan basa nitrogen
3 pada akhir untai lainnya. Untaian tersebut dikatakan memiliki orientasi anti-paralel. Orientasi anti-
paralel ini merupakan akibat dari stereokimia pasangan adenin dan timin serta guanin dan sitosin.
Kedua Rantai dari Double Helix Memiliki Rangkaian komplementer
Pasangan antara adenin dan timin serta antara guanin dan sitosin berakibat pada hubungan
yang saling melengkapi antara rangkaian basa nitrogen pada dua rantai saling terkait dan
memberikan karakter DNA self-encoding. Sebagai contoh, jika kita memiliki urutan 5-ATGTC-3
pada satu rantai, maka rantai yang berlawanan harus memiliki urutan komplementer 3-TACAG-5.
Ketatnya aturan pasangan " Watson - Crick " didasarkan pada komplementari baik dari bentuk dan
sifat ikatan hidrogen antara adenin dan timin serta antara guanin dan sitosin. Adenin dan timin cocok,
sehingga ikatan hidrogen dapat terbentuk antara kelompok amino exocyclic di C6 pada adenin dan
karbonil pada C4 di timin, demikian pula, ikatan hidrogen dapat terbentuk antara N1 dari adenin dan
N3 timin. Sebuah penyusunan yang sesuai dapat digambarkan antara guanin dan sitosin, sehingga
pasangan basa ini terdapat ikatan hidrogen dan bentuk yang saling melengkapi secara baik.
Pasangan basa G:C memiliki tiga ikatan hidrogen, karena exocyclic NH2 di C2 pada guanin terletak
berlawanan dan dapat membentuk ikatan hidrogen dengan karbonil di C2 pada sitosin. Demikian
juga, sebuah ikatan hidrogen bisa terbentuk antara N1 dari guanin dan sitosin N3 dan antara karbonil
di C6 guanin dan exocyclic NH2 di C4 sitosin. Sebuah ciri utama dari double helix adalah bahwa
dua pasangan basa memiliki geometri yang sama persis, memiliki pasangan basa A:T atau
pasangan G:C antara dua gula, namun tidak mengganggu susunan gula tersebut. Dengan kata lain,
terdapat sekitar dua lipatan sumbu simetri yang menghubungkan dua gula dan empat pasangan
basa dapat diakomodasi dalam susunan yang sama tanpa distorsi dari keseluruhan struktur DNA .









Gambar 6. Pasangan Basa Nitrogen A:T dan G:C

5



Ikatan Hidrogen Pasangan Basa Nitrogen
Ikatan hidrogen antara basa komplementer memberikan ciri yang mendasar pada helix
ganda, memberikan kontribusi bagi stabilitas termodinamika helix dan menyediakan informasi dan
spesifisitas pasangan basa. Secara sekilas, ikatan hidrogen mungkin tidak tampak memberikan
kontribusi penting bagi stabilitas DNA. Alasannya karena sebuah molekul organik dalam larutan air
akan membentuk ikatan hidrogen yang nyaman dengan molekul air. Akibatnya, untuk setiap ikatan
hidrogen yang dibuat ketika pasangan basa terbentuk, ikatan hidrogen dengan air yang ada di sana
rusak sebelum pasangan basa terbentuk. Dengan demikian, kontribusi energi bersih dari ikatan
hidrogen untuk stabilitas double helix akan terlihat sederhana. Namun, ketika untaian polynucleotide
terpisah, molekul air berbaris di bagian dasar. Ketika untaian datang bersama-sama dalam double
helix, molekul air akan pindah dari dasar. Hal ini menciptakan gangguan dan meningkatkan entropi.
Ikatan hidrogen bukan satu-satunya kekuatan yang dapat menstabilkan helix ganda. Kontribusi
penting kedua berasal dari penumpukan interaksi antar basa.. Interaksi elektron awan (-) antar
basa dalam tumpukan heliks memberikan kontribusi yang signifikan bagi stabilitas double helix.
Selain itu, ikatan hidrogen juga penting untuk spesifikasi pasangan basa.

Lekukan Mayor dan Minor Double Helix
Sebagai hasil dari struktur heliks ganda dari kedua rantai, molekul DNA merupakan polimer
panjang yang diperpanjang dengan dua alur yang tidak sama ukurannya satu sama lain. Adanya
lekukan minor dan mayor merupakan akibat sederhana dari geometri pasangan basa. Sudut dimana
dua gula menonjol dari pasangan basa (yang merupakan sudut antara ikatan glikosidik) adalah
sekitar 120 untuk sudut sempit atau 240 untuk sudut lebar. Hasilnya, karena semakin banyak
tumpukan pasangan basa di atas satu sama lain, sudut sempit antara gula pada salah satu ujung
dari pasangan basa menghasilkan lekukan kecil dan sudut besar di tepi lain menghasilkan lekukan
mayor. Jika gula menjauh dari satu sama lain dalam garis lurus, yaitu pada sudut 180 , kemudian
dua lekukan akan memiliki dimensi yang sama dan tidak akan ada lekukan kecil dan besar.













Gambar 7. DNA double heliks


Lekukan Mayor Kaya dalam Informasi Kimia
Di bagian pinggir setiap pasangan basa yang terkena lekukan mayor dan minor terdapat pola
donor dan akseptor ikatan hidrogen dan permukaan van der Waals yang mengidentifikasi pasangan.
Tepi dari pasangan basa A : T menampilkan kelompok kimia pada lekukan mayor sebagai berikut:
akseptor ikatan hidrogen (N7 pada adenin), donor ikatan hidrogen (gugus amino exocyclic pada C6
dari adenin), akseptor ikatan hidrogen (gugus karbonil pada C4 dari timin) dan permukaan hidrofobik
besar (kelompok metil pada C5 timin). Demikian pula, pada tepi pasangan basa G : C menampilkan
kelompok dalam lekukan mayor sebagai berikut: akseptor ikatan hidrogen pada N7 dari guanin),
akseptor ikatan hidrogen (karbonil pada C6 guanin), sebuah donor ikatan hidrogen (gugus amino
exocyclic pada C4 sitosin), hidrogen non - polar kecil (hidrogen pada C5 sitosin). Dengan demikian,
teradapat pola karakteristik ikatan hidrogen dan bentuk keseluruhan yang terpapar dalam lekukan
mayor yang membedakan pasangan basa A : T dari pasangan basa G : C, dan A : T dari T : A, serta

6

G : C dari C : G. Kita dapat menganggap ciri ini sebagai kode di mana A merupakan akseptor ikatan
hidrogen, D donor ikatan hidrogen, M adalah gugus metil, dan H merupakan hidrogen nonpolar.
Dalam kode tersebut, A D A M pada lekukan mayor menandakan pasangan basa A : T, dan A A D
H singkatan dari pasangan basa G : C. Demikian juga, untaian M A D A untuk pasangan basa T : A
dan H D A A adalah karakteristik dari pasangan basa C : G. Dalam semua kasus, kode kelompok
kimia dalam lekukan mayor menentukan identitas pasangan basa. Pola ini penting karena
memungkinkan protein untuk mengenali rangkaian DNA tanpa harus membukanya. Mekanisme
decoding utama bergantung pada kemampuan rantai pinggir asam amino untuk menonjol ke alur
utama untuk mengenali dan mengikat urutan DNA tertentu. Lekukan minor tidak begitu kaya
informasi kimia dan informasi yang tersedia kurang berguna untuk membedakan antara pasangan
basa. Ukuran yang kecil dari lekukan minor kurang mampu mengakomodasi rantai samping asam
amino. Dan juga , pasangan basa A : T dan T : A dan G : C dan C : G terlihat mirip satu sama lain
dalam lekukan minor. Lekukan minor memang terlihat berbeda ketika membandingkan pasangan
basa A : T dengan pasangan basa G : C, tetapi G : C dan C : G , atau A : T dan T : A , tidak dapat
dengan mudah dibedakan.



















Gambar 8. Kelompok kimia dalam lekukan mayor dan minor pasangan basa dari samping

Konformasi Double Helix
Menurut Ussery (2002), tiga bentuk atau konformasi DNA yang umum dikenal adalah
konformasi A, B, dan Z. Konformasi B merupakan bentuk DNA yang paling umum pada kromosom
organisme dan yang umumnya kita pelajari, dengan bentuk double helix. B-DNA adalah heliks
tangan kanan dengan 10 pasangan basa per putaran. B-DNA direplikasi dan digunakan dalam
transkripsi dan translasi RNA, yang merupakan molekul yang digunakan untuk sintesis protein. B-
DNA dapat terdenaturasi, yang berarti ikatan hidrogen dihilangkan. Ini pada dasarnya adalah
langkah pertama dalam replikasi DNA dalam sel. Konformasi A juga berbentuk double helix,
bentuknya lebih pendek dan lebih tebal dibandingkan konformasi B. A-DNA merupakan heliks
tangan kanan. Namun, ada banyak pasangan basa per putaran. A-DNA memiliki 11 pasangan basa
per putaran. Ini adalah biologis aktif dalam sel, dan membentuk struktur mengkristal dalam
percobaan laboratorium. Konformasi A dapat ditemukan pada RNA dan kompleks DNA-RNA.
Konformasi Z merupakan konformasi DNA yang spesial. Tidak seperti konformasi A dan B yang
memiliki kiralitas tangan kanan, konformasi Z memiliki kiralitas tangan kiri. Dengan kata lain,
konformasi Z ini seperti cerminan konformasi A dan B. Ia juga dikenal secara biologis aktif dalam
formasi zigzag berulang urutan pasangan basa. Z-DNA memiliki 12 pasangan basa per putaran,
sehingga membawa sebagian besar gen antara setiap pergantian. Z-DNA berperan dalam
transkripsi RNA, yang merupakan proses sintesis protein untuk menciptakan mRNA dari untai DNA.
mRNA (message RNA) adalah molekul yang membawa gen ditranskripsi ke ribosom dimana protein

7

disintesis. Uniknya lagi, konformasi ini tidak ditemukan pada organisme prokariot, tetapi pada
organisme eukariotpada suatu daerah di genom yang bernama CpG island. Daerah ini mengandung
banyak basa sitosin (C) dan guanin (G). Sejauh ini, konformasi Z ditemukan berperan dalam
transkripsi gen, translasi gen, dan diferensiasi sel.
a b c







Gambar 9. Konformasi double helix DNA
(a) B-DNA (b) A-DNA (c) Z-DNA
Tabel 1. Perbedaan ketiga konformasi double helix DNA

Ciri-ciri DNA-B DNA-A DNA-Z
Tipe helix Berpilin ke kanan Berpilin ke kanan Berpilin ke kiri
Diameter helical (nm) 2,37 2,55 1,84
Jarak antara dua pasangan basa
(nm)
0,34 0,29 0,37
Jarak antara dua pasangan basa
dalam satu pilinan (nm)
3,4 3,2 4,5
Jumlah pasangan basa dalam
satu pilinan
10 11 12
Topologi lekukan mayor Lebar, dalam Sempit, dalam rata
Topologi lekukan minor Sempit, tidak dalam Dangkal, lebar Sempit, dalam

DNA Terdapat Dalam Bentuk Relaxed Circle dan Supercoil
Pada sebagian organisme seperti bakteri, bakteriofag dan banyak virus hewan yang
mengandung DNA, ujung-ujung molekul DNA disatukan hingga menciptakan suatu lingkaran
tertutup tanpa akhir. Tentu saja bentuk ini tidak akan menghancurkan polaritas molekul tersebut,
tetapi menghilangkan semua gugus 3 serta 5 hidroksil dan fosforil yang bebas. Lingkaran tertutup
terdapat dalam bentuk relaxed circle atau supercoil. Supercoil terbentuk kalau suatu lingkaran
tertutup berpuntir di sekeliling sumbunya sendiri atau kalau bagian linier DNA dupleks yang ujungnya
terikat terpuntir. Proses yang memerlukan energi ini membuat molekul DNA berada dalam tekanan,
dan semakin besar jumlah supercoil, semakin besar tekanan atau torsio. Supercoil negatif dibentuk
kalau molekul DNA terpuntir dengan arah yang berlawanan dengan arah jarum jam pada heliks
ganda dominasi-kanan yang ditemukan dalam DNA bentuk B. DNA semacam ini dikatakan
underwound. Energi yang diperlukan untuk mencapai keadaan ini logikanya akan disimpan dalam
supercoil. Pengalihan menjadi bentuk lain yang memerlukan energi dengan demikian diperlancar
oleh peristiwa underwinding. Salah satu pengalihan seperti itu adalah proses pemisahan benang,
yang merupakan persyaratan bagi replikasi dan transkripsi DNA. Karena itu, DNA supercoil
merupakan bentuk DNA yang disukai dalam berbagai sistem biologi. Enzim-enzim yang
mengkatalisis perubahan topologi DNA disebut topoisomerase. Topoisemorase dapat
mengendorkan atau menyisipkan supercoil. Topoisomerase dibagi menjadi dua kelas yaitu
Kelas I topoisomerase memotong rantai induk fosfodiester satu untai DNA, melewati ujung lain,
dan kemudian reseal rantai induk.

8

Kelas II topoisomerase memotong kedua untai DNA, melewati beberapa DNA yang tersisa helix
antara potongan akhir, dan kemudian reseal.

Yang paling khas adalah girase bakterial, yang menimbulkan supercoiling negatif dalam DNA
dengan menggunakan ATP sebagai sumber energi. Supercoiling dari DNA nuklir eukariota (seperti
tumbuhan dan hewan) lebih rumit daripada supercoiling dari DNA sirkular dari prokariota. DNA
eukariotik dikomplekskan dengan sejumlah protein, terutama dengan basa protein yang memiliki
rantai samping berlimpah bermuatan positif pada fisiologis (Netral) pH.

STRUKTUR RNA

RNA merupakan polinukleotida rantai tunggal yang berpilin yang berfungsi sebagai
penyimpan danpenyalur informasi genetik. Struktur primer RNA secara umum mirip dengan DNA,
namun terdapat tiga hal yang membedakan antar DNA dan RNA. Pertama , tulang punggung RNA
mengandung ribosa bukan 2-deoksiribosa. Artinya, ribose memiliki gugus hidroksil pada posisi 2.
Kedua, RNA mengandung urasil yang menggantikan timin pada DNA. Urasil memiliki struktur cincin
tunggal yang sama seperti timin, namun urasil tidak memiliki kelompok 5 metil sedangkan timin
memiliki 5 Metil-urasil. Ketiga, RNA biasanya ditemukan sebagai rantai polinukleotida tunggal. RNA
terbagi menjadi 4 jenis yaitu rRNA, mRNA, tRNA, dan iRNA. Ribosomal RNA (rRNA) adalah RNA
yang merupakan bagian dari Ribosom dan berfungsi untuk sintesis protein pada makhluk hidup.
rRNA dan Ribosomal protein membentuk Ribosom dengan presetanse berat 60% rRNA dan 40%
protein. rRNA terdiri dari dua jenis yaitu Large Subunit (LSU) dan Small Subunit (SSU). Terdapat
tiga binding sites pada Ribosom yaitu A (Aminoacyl-tRNA bindign site), P (Peptidyl-tRNA binding
site) dan E (Exit site). RNA Transfer adalah RNA yang berfungsi menerjemahkan kode genetik dari
RNA Duta (mRNA) dan membawa asam amino spesifik ke Ribosom dalam proses sintesis protein.
tRNA disebut juga antikodon yang memiliki kodon komplemen dari mRNA atau kodon. mRNA adalah
RNA yang bertugas untuk mengkopi susunan genetik suatu DNA untuk dapat dibawa ke ribosom
dimana nantinya akan dimulai pembentukan protein. Dalam pembentukan protein, mRNA akan
dicari pasanganan asam aminonya oleh tRNA. Struktur mRNA terdiri dari ujung 5, daerah koding,
dan untranslated region (UTR). Ujung 5 adalah ujung awal dari mRNA yang terbuat dari guanin
yang telah dimodifikasi yang berfungsi sebagai ujung yang dapat diidentifikasi oleh ribosom dan
melindungi dari degradasi eksonukleat dan hanya terdapat sel eukariotik. Daerah koding adalah
daerah dimana transkripsi terjadi. Daerah koding terdiri dari kodon-kodon yang terbentuk dari
transkripsi dengan DNA dan nantinya akan di translasi dengan tRNA. Untranslated Region (UTR)
merupakan daerah yang tidak di translasi dari awal sampai akhir (5UTR dan 3UTR) dan terletak di
kedua ujung mRNA. RNAi adalah merupakan potongan gen dengan panjang 21-23 nukleotida yang
berasal dari dsRNA yang ditemukan oleh Andrew Z. Fire (Stanford University) dan Craig C. Mello
(University of Massachusetts). RNAi terdiri dari 2 jenis RNA yaitu microRNA (miRNA) dan small
interfering (siRNA)

Pembentukan Daerah Lokal Double Helix Rantai RNA

Meskipun berbentuk untaian tunggal, molekul RNA sering memperlihatkan karakter double
heliks. Hal ini dikarenakan rantai RNA sering melipat pada diri mereka sendiri untuk membentuk
segmen pasangan basa nitrogen antara bentangan pendek dari rangkaian komplementer. Jika dua
bentangan dari rangkaian komplementer dekat satu sama lain, RNA dapat mengadopsi salah satu
dari berbagai struktur stem-loop dimana intervensi RNA melingkar keluar dari ujung segmen heliks
ganda sebagai sebuah jepit rambut (hairpin), tonjolan, atau loop sederhana. Stabilitas struktur stem-
loop tersebut dalam beberapa kasus ditingkatkan dengan sifat-sifat khusus dari loop. Misalnya,
stem-loop dengan rangkaian "tetraloop" UUCG secara tiba-tiba stabil karena interaksi tumpukan
basa khusus dalam loop. Pasangan basa dapat juga terjadi antara urutan yang tidak berdekatan
untuk membentuk kompleks struktur yang tepat bernama pseudoknots. Daerah pasangan basa
dalam RNA bisa menjadi double helix biasa atau mereka dapat mengandung diskontinuitas, seperti
nukleotida noncomplementary yang meonjol keluar dari helix. Sebuah ciri dari RNA yang menambah
kecenderungan untuk membentuk struktur heliks ganda adalah tambahan pasangan basa non
Watson-Crick. Misalnya, pasangan basa G : U yang memiliki ikatan hidrogen antara N3 urasil dan

9

karbonil pada C6 guanin dan antara karbonil pada C2 urasil dan N1 guanin. Karena pasangan basa
G : U dapat terjadi juga sebagai empat pasangan basa Watson-Crick konvensional, rantai RNA
memiliki ditingkatkan kapasitas diri saling melengkapi. Dengan demikian, RNA sering menunjukkan
daerah lokal dari pasangan basa nitrogen. Kehadiran 2-Hidroksil dalam kerangka RNA mencegah
RNA dari adopsi bentuk B-helix. Sebaliknya, RNA heliks ganda menyerupai bentuk struktur A DNA.
Dengan demikian, lekukan minor menjadi lebar dan dangkal, dan karenanya dapat diakses, namun
lekukan minor hanya memberikan sedikit informasi rangkaian spesifik. Sementara itu, lekukan utama
begitu sempit dan mendalam sehingga sangat tidak mudah untuk rantai asam amino samping
berinteraksi dengan protein. Dengan demikian, RNA heliks ganda cukup berbeda dari heliks ganda
DNA dalam detail struktur atom dan kurang cocok untuk interaksi tertentu dengan protein (meskipun
beberapa protein mengikat RNA dengan cara tertentu).







Gambar 10. Karakterstik DNA double helix
(a) Hairpin (b) Tonjolan (c) Loop







Gambar 11. Pseudoknot

Hammerhead Ribozyme Memecah RNA Melalui Pembentukan 2,3 Cyclic Phosphate
Hammerhead adalah rangkaian spesifik ribonuklease yang ditemukan dalam agen RNA
infeksi tertentu pada tanaman yang dikenal sebagai viroid, yang tergantung pada self-cleavage
untuk propagasi. Ketika viroid bereplikasi, dihasilkan beberapa salinan dari dirinya sendiri dalam
satu rantai RNA kontinu. Viroid tunggal muncul dengan cara membelah, dan reaksi pembelahan ini
dilakukan oleh rangkaian RNA di sekitar persimpangan. Satu rangkaian membelah diri seperti
hammerhead karena bentuk struktur sekunder yang terdiri dari tiga batang pasangan basa ( I, II ,
dan III ) yang mengelilingi inti nukleotida non-komplementer yang dibutuhkan untuk katalisis. Pada
pH tinggi, 2 hidroksil dari ribosa dalam kerangka RNA dapat terdeprotonasi, dan menghasilkan
oksigen bermuatan negatif yang dapat menyerang fosfat scissile pada posisi 3 dari ribosa yang
sama. Reaksi ini memutus rantai RNA dan menghasilkan 2,3 siklik fosfat dan 5 hidroksil bebas.
Pada pH normal, enzim protein ini menggunakan ion logam yang terikat pada situs aktif mereka dan
mengaktifkan 2 hidroksil dari RNA.


II. FUNGSI ASAM NUKLEAT

ABSTRAK
Asam nukleat yang terkandung dalam untaian DNA dikenal sebagai pembawa informasi genetik. .
DNA harus mampu menyimpan informasi genetik dan dengan tepat dapat meneruskan informasi
tersebut dari tetua kepada keturunannya. Selain itu, DNA juga harus mengatur perkembangan
fenotipe organisme. Artinya, materi genetik harus mengarahkan pertumbuhan dan diferensiasi
organisme mulai dari zigot hingga individu dewasa. Fungsi ini merupakan fungsi fenotipik, yang
dilaksanakan melalui ekspresi gen. DNA sewaktu-waktu dapat mengalami perubahan sehingga
organisme yang bersangkutan akan mampu beradaptasi dengan kondisi lingkungan yang berubah.
Selain fungsinya sebagai materi genetik, DNA juga memiliki fungsi heterokatalitis (mensintesis
molekul kimiawi lainnya secara langsung seperti mensintesis protein dan RNA), serta fungsi

10

autokatalis, yaitu DNA dapat mensistesa dirinya sendiri.



A. DNA

DNA merupakan sebuah bagian penting dalam hereditas. Informasi genetik dari satu
generasi ke generasi berikutnya dihantarkan oleh DNA. Berikut akan dibahas mengenai DNA dari
beberapa sudut pandang.
1. Kromasomal
Secara umum, DNA membentuk gen dan kemudian gen membuat kromosom. Kromosom
adalah struktur padat yang terdiri dari dua komponen molekul, yaitu DNA dan protein. Manusia baik
laki-laki maupun perempuan memiliki 23 pasang kromosom - total 46 kromosom. 22 pasang
merupakan kromosom autosom yang bersifat somatik, sedangkan satu pasang lainnya merupakan
kromosom seks . Kromosom ke 23 ini tentunya bergantung pada jenis kelamin seseorang, jadi
kromosom seks pria tentu berbeda dengan wanita. Wanita memiliki kromosom XX, sedangkan pria
kromosom XY.
Kromosom X berukuran lebih besar dan memiliki wilayah euchromatin lebih aktif daripada
kromosom Y. Euchromatin adalah bentuk ringan dikemas kromatin (DNA, RNA dan protein) yang
kaya akan konsentrasi gen. Sedangkan kromosom Y mewakili sekitar 2% dari total DNA sel
manusia. Kromosom Y manusia mengandung 86 gen, yang merupakan kode untuk hanya 23 protein
yang berbeda. Sifat yang diwariskan melalui kromosom Y disebut sifat holandric.
Selain kromosom seks, manusia juga memiliki pasangan kromosom autosomal yang tidak
bergantung pada jenis kelamin. 22 dari 23 kromosom pada manusia merupakan DNA Autosomal
DNA Autosomal merupakan istilah yang digunakan dalam silsilah genetika untuk menggambarkan
DNA yang diwariskan dari kromosom autosomal. Autosom yang adalah pasangan kromosom yang
diturunkan masing-masing 1 dari ayah dan 1 dari ibu. Proses bersatunya kromosom dari ayah dan
ibu secara tidak teratur dinamakan recombination. Kromosom autosomal dapat menjadi genetic
record karena akan terus mengalami recombination dari setiap generasi

2. Organisme

2.1. Virus
Asam nukleat pada virus dapat berupa untaian atau rantai tunggal (RNA) ataupun ganda
(DNA). Sama seperti pada organisme lainnya, DNA pada virus juga berperan sebagai materi
genetik. Banyaknya jenis virus dan jenis sel yang diinfeksi oleh beragam virus tersebut, digunakan
DNA yang telah direkayasa atau dimodifikasi genetiknya untuk membawa DNA asing ke sebuah sel.
Ini membawa pengaruh yang besar sebagai ekspirimen terapi gen.
Virus harus berada dalam sel inang untuk dapat mereplikasi dirinya. Pada replikasi virus, dikenal
tahap litik dan lisogenik. Pada pertengahan tahap infeksi oleh lisogenik , beberapa virus dapat
tinggal dalam jangka panjang dalam DNA sel inangnya , bahkan hingga bertahun-tahun tanpa
banyak mengganggu kerja sel itu sendiri (silent virus). Virus yang memiliki kecendrungan tersebut
dapat menyebabkan efek jangka panjang yang amat serius. Karena mereka dapat mengganggu gen
yang mengontrol siklus kehidupan normal sel , virus tersebut dapat mengakibatkan kanker di
kemudian hari . Contohnya HPV (Human Papilloma Virus) yang sangat terkait dengan kanker
serviks, atau dapat mengganggu gen yang berhubungan dengan kondisi lingkungan , seperti HIV
yang mengganggu fungsi sel T.
Pada tahap tengah hingga akhir fase lisogenik, DNA virus akan ditranskripsi dan
diterjemahkan oleh RNA dan protein yang diproduksi pada tahap awal dan pertengahan untuk
menghasilkan
- Eksemplar dari DNA virus itu sendiri
- Protein yang membentuk kapsid kosong yang mengandung DNA virus jika tidak dalam
sel

11

- Packaging protein, yang akan menempatkan keduanya bersama-sama, dan pada tahap
akhir akan mentranskripsi dan menterjemahkan enzim litik yang dapat merobek
membran sel dan melepaskan virus salinan hasil replikasi .
Seperti kebanyakan DNA, fungsi dari DNA virus yang intinya ialah untuk mereplikasi diri atau
membuat lebih banyak virus. DNA yang dimiliki virus lisogenik , seperti apa yang dijelaskan di atas
, memiliki manfaat dalam dunia medis serta bioteknologi. Jika pembentukan kode DNA virus
biasanya menghasilkan DNA tinggal lama pada kromosom sel inang, hal ini dapat memungkinkan
berbagai macam gen yang berbeda dimasukkan ke dalam organisme inang. Hal ini dapat dilihat
pada produksi insulin manusia menggunakan bakteri E. coli, serta implementasi terapi gen untuk
mengobati penyakit seperti cystic fibrosis dengan mengganti gen mutan dengan gen normal.
2.2 Prokariotik dan Eukariotik

Pada hampir semua sel eukariotik, DNA berada dalam inti sel, menempati sekitar 10% dari
volume total sel. Bagian ini dibatasi oleh membran nukleus, yang dibentuk oleh dua membran lipid
bilayer konsentris pada interval pori-pori nucleus (tempat transportasi antara inti dan sitosol).
Sedangkan pada sel prokariotik, materi inti (DNA) terdapat dalam nukleoid yang tidak dibatasi oleh
membran inti, misalnya bakteri dan ganggang.
Fungsi utama DNA pada prokariotik sama seperti pada sel manusia, yaitu transkripsi menjadi
asam ribonukleat (RNA) yang diikuti oleh penerjemahan menjadi asam amino dan berikutnya,
menyambung asam amino-asam amino tersebut menjadi protein (fungsi heterokatalitis), dan fungsi
autokatalis

3. Mitokondria
Sebagian besar DNA terletak dalam kromosom pada nukleus, namun pada mitokondria juga
terdapat sejumlah kecil DNA. Materi genetik ini dikenal sebagai DNA mitokondria atau mtDNA. Pada
manusia, DNA mitokondria meliputi sekitar 16.500 ( pasangan basa ), yang mewakili sebagian kecil
dari total DNA dalam sel.
DNA mitokondria mengandung 37 gen, yang seluruhnya penting untuk fungsi mitokondria
normal. Tiga belas dari seluruh gen tersebut memberikan instruksi dalam pembuatan enzim yang
terlibat dalam fosforilasi oksidatif. Fosforilasi oksidatif adalah proses yang menggunakan oksigen
dan gula sederhana untuk membuat adenosin trifosfat (ATP), sumber energi utama sel . Gen-gen
yang tersisa memberikan instruksi untuk membuat molekul yang disebut RNA transfer (tRNA) dan
RNA ribosom (rRNA) yang membantu transformasi asam amino menjadi protein yang fungsional.
DNA mitokondria rentan terhadap mutasi somatik , yang merupakan jenis mutasi yang tidak
menurun. Mutasi somatik terjadi dalam DNA sel-sel tertentu selama seumur hidup seseorang dan
biasanya tidak diteruskan ke generasi berikutnya. Mutasi somatik pada DNA mitokondria dapat
dikaitkan dengan berbagai penyakit kanker, seperti kanker payudara, usus besar, lambung, hati,
serta tumor ginjal.
DNA mitokondria umumnya diuji untuk berbagai keperluan yang menyangkut masalah
keturunan. DNA mitokondria merupakan untai DNA yang sensitif dan mutasi pada DNA tersebut
dapat menyebabkan penyakit menurun. DNA mitokondria juga memungkinkan kita untuk melacak
ratusan generasi. Dalam forensik, mtDNA digunakan untuk mengidentifikasi mayat dan sisa-sisa
kerangka yang biasanya digunakan untuk melacak identitas seseorang yang terlibat dalam tindakan
criminal. DNA menjadi lebih penting setelah ditemukannya teknologi kloning.
DNA mitokondria sangat berperan dalam produksi energi yang diperlukan untuk
kelangsungan hidup sel. DNA mitokondria memiliki fungsi khusus seperti semua DNA lainnya yaitu
mengatur kerja sel.


12

B. RNA
Sebagian besar sel prokariotik dan sel eukariotik juga memiliki asam nukleat yang lain yaitu
RNA. RNA singkatan dari ribonucleic acid atau asam ribonukleat. RNA merupakan hasil transkripsi
dari suatu fragmen DNA, sehingga RNA merupakan polimer yang jauh lebih pendek dibanding DNA.
RNA juga dapat berfungsi sebagai katalis reaksi biokimia (dalam perannya sebagai ribozyme).
RNA dapat dibedakan menjadi dua kelompok utama, yaitu RNA genetik dan RNA non-
genetik. Pada prinsipnya, RNA genetik memiliki fungsi yang sama dengan DNA, yaitu sebagai
pembawa informasi genetik. RNA genetik hanya ditemukan pada makhluk hidup tertentu yang tidak
memiliki DNA, misalnya virus. Dalam hal ini fungsi RNA menjadi sama dengan DNA, baik sebagai
materi genetik maupun dalam mengatur aktivitas sel. RNA non-genetik tidak berperan sebagai
pembawa keterangan genetik sehingga RNA jenis ini hanya dimiliki oleh makhluk hidup yang juga
memiliki DNA.
Berdasarkan letak dan fungsinya, RNA non-genetik terbagi lagi menjadi :
1. Messenger RNA (mRNA)
mRNA merupakan RNA yang urutan basanya komplementer (berpasangan) dengan salah satu
urutan basa rantai DNA. RNA jenis ini merupakan polinukleotida berbentuk pita tunggal linier dan
disintesis oleh DNA di dalam nukleus. Panjang pendeknya mRNA berhubungan dengan panjang
pendeknya rantai polipeptida yang akan disusun. Urutan asam amino yang menyusun rantai
polipeptida itu sesuai dengan urutan kodon yang terdapat di dalam molekul mRNA yang
bersangkutan. mRNA bertindak sebagai pola cetakan pembentuk polipeptida. Adapun fungsi
utama mRNA adalah membawa kode-kode genetik dari DNA di inti sel menuju ke ribosom di
sitoplasma. mRNA ini dibentuk bila diperlukan dan jika tugasnya selesai, maka akan dihancurkan
dalam plasma.
Setiap gen pada DNA berisi petunjuk untuk membuat satu protein spesifik dengan urutan asam
amino dikode oleh urutan yang tepat dari amina heterosiklik pada nukleotida

2. Transfer RNA (tRNA) atau ARNt (ARN transfer)
Transfer RNA dibentuk di dalam nukleus, tetapi kemudian terletak dalam sitoplasma. tRNA
merupakan RNA terpendek dan bertindak sebagai penerjemah kodon dari mRNA, dan
mentranslasinya menjadi asam amino lalu menyusunnya menjadi sebuah protein
Transfer RNA merupakan RNA terpendek dan bertindak sebagai penerjemah kodon dari
mRNA yang juga berfungsi mengikat asam-asam amino di dalam sitoplasma yang akan disusun
menjadi protein dan mengangkutnya ke ribosom. Bagian tRNA yang berhubungan dengan kodon
dinamakan antikodon.

3. Ribosomal RNA (rRNA) atau ARNr (ARN ribosomal)
RNA ini disebut ribosomal RNA karena terdapat di ribosom meskipun dibuat di dalam
nukleus. RNA ini berupa pita tunggal, tidak bercabang, dan fleksibel. Lebih dari 80% RNA
merupakan rRNA. Fungsi dari RNA ribosom adalah sebagai perakit dalam sintesis protein yang
bergerak ke satu arah sepanjang mRNA. Di dalam ribosom, molekul rRNA ini mencapai 30-46%.
Dalam sitoplasma, RNA ribsomal (rRNA) dan protein bergabung membentuk nukleoprotein yang
disebut ribosom. Ribosom menempel pada m-RNA dan menyediakan struktur menstabilkan untuk
menampung semua zat dalam posisi sebagai protein disintesis. Beberapa ribosom dapat
menempel pada RNA tunggal pada setiap saat. Di sudut kanan atas adalah sub satuan 30S
dengan mRNA dan tRNA terpasang.
4. MicroRNA (miRNA)

13

Pada dasarnya, miRNA merupakan pelengkap bagi bagian dari satu atau lebih messenger
RNA (mRNAs). MiRNA juga berperan sebagai pendukung kerja RNAi. miRNA juga memiliki peranan
penting yakni terlibat dalam ekspresi gen. miRNA berukuran sangat kecil (sebagian besar hanya
panjang sekitar 25 nukleotida). Sebagian Mirna mencegah transkripsi gen tertentu dan jika mereka
hilang, gen-gen akan terekspresi.

5. Transfer messenger RNA (tmRNA)
Transfer messenger RNA (tmRNA) memiliki beberapa fungsi, seperti memperbaiki atau
memperbaharui kerja ribosom, menambahkan proteolysis-inducing tag ke polipeptida yang belum
selesai terbentuk, dan membantu degradasi messenger RNA yang tidak sesuai. Pada kebanyakan
bakteri, fungsi-fungsi ini dilakukan oleh satu tmRNAs. Dalam spesies bakteri lainnya, gen ssrA yang
telah mengalami permutasi menghasilkan dua tmRNA di mana dua rantai RNA yang terpisah
berpasang-pasangan.
RNA yang stabil ini mengurangi jumlah ribosom yang tidak dapat menyelesaikan sintesis
protein pada mRNA yang kurang kodon stop.

6. Small nucleolar RNAs (snoRNAs)
Small nucleolar RNAs (snoRNAs) merupakan kelas molekul RNA kecil yang terutama
membimbing modifikasi kimia RNA lain, terutama RNA ribosom, dan RNA transfer. Kemajuan
terbaru dalam bioinformatika telah menghasilkan algoritma baru dan dapat dengan cepat
mengidentifikasi RNA noncoding umumnya dan khususnya di snoRNAs genomic. snoRNAs juga
dapat berfungsi sebagai miRNAs. Baru-baru ini, telah ditemukan bahwa snoRNAs dapat memiliki
fungsi yang tidak berkaitan dengan rRNA.

7. RNA Interface
RNAi memiliki tugas penting yaitu mengendalikan aktivitas sel, serta menghentikan proses
transkripsi sehingga tidak berlanjut ke proses translasi. RNAi berperan penting dalam sistem
pertahanan terhadap informasi genetik asing (virus), mengatur proses perkembangan, dan dalam
sejumlah aspek ekspresi gen lainnya .
RNAi sering disebut sebagai teknologi revolusioner karena membuka pintu untuk
mengembangkan terapi baru untuk kanker dan penyakit lainnya berdasarkan membungkam gen
tertentu. RNAi dapat memungkinkan kita mengeksplorasi fungsi dari setiap gen, sehingga kita dapat
menentukan bagaimana hal itu cocok ke dalam proses penyakit. Menggunakan RNAi, peneliti dapat
mematikan gen individu, satu per satu, dalam rangka untuk mencari tahu mana fungsi mereka
kontrol. Setelah peneliti medis tahu, misalnya, bahwa sebuah gen tertentu merupakan penyumbang
utama untuk proses penyakit tertentu, mereka dapat membuat target untuk pengembangan obat
masa depan, ia menjelaskan.
Berdasarkan penelitian RNAi awal, uji klinis telah dimulai di Amerika Serikat untuk beberapa
penyakit, termasuk hepatitis C dan leukemia. Teknologi ini juga saat ini sedang digunakan untuk
mengeksplorasi degenerasi makula, penyebab utama kebutaan pada orang tua.

8. SiRNA
SiRNAs memiliki kemungkinan besar dapat berkembang sebagai respon kekebalan primitif
ditimbulkan oleh adanya asam nukleat asing. sRNA memiliki tugas utama sebagai pendukung
miRNA, dalam hal ini siRNA membantu pembelahan miRNA. siRNA atau molekul seperti siRNA
terwakili di hampir setiap kingdom.
Selain kemampuan yang berguna untuk membungkam gen melalui penghambatan translasi,
fungsi selular utama siRNA adalah perlindungan dari asam nukleat asing. Penemuan ini telah
menyebabkan meluasnya penggunaan teknologi ini untuk mempelajari fungsi gen mamalia
termasuk gen yang relevan secara klinis, menyinggung aplikasi terapi yang berbasis teknologi RNAi.


14

9. Non-coding RNA (ncRNA)
Istilah non - coding RNA (ncRNA) umumnya digunakan untuk RNA yang tidak mengkode
protein, tapi ini tidak berarti bahwa RNA tersebut tidak mengandung informasi atau memiliki fungsi.
Meskipun telah umum diasumsikan bahwa informasi genetik yang paling ditransaksikan oleh protein,
bukti terbaru menunjukkan bahwa mayoritas genom mamalia dan organisme kompleks lainnya
adalah sebenarnya ditranskripsi menjadi ncRNAs , banyak yang alternatif disambung dan / atau
diolah menjadi produk yang lebih kecil . NcRNAs ini termasuk microRNAs dan snoRNAs (banyak
jika tidak sebagian besar yang masih harus diidentifikasi), serta kelas-kelas lain kemungkinan belum
- to-be - ditemukan RNA peraturan kecil, dan puluhan ribu transkrip lagi (termasuk pola-pola
kompleks jalinan dan rasa tumpang tindih dan transkrip antisense ), sebagian besar yang fungsinya
tidak diketahui.

10. XistRNA (X Inactive transcript RNA)
XistRNA merupakan RNA yang terdapat dalam kromosom X, dan berperan penting dalam
proses penonaktifkan kromosom X. Penonaktifan kromosom X ini melibatkan Xic (X inactivation
centre), Xist, dan Tsix.

11. Small nuclear RNA (snRNA)
snRNA Ditemukan dalam nukleus sel eukarIot. snRNA memiliki panjang sekitar 150
nukleotida. snRNA memproses pre-mRNA (hnRNA) menjadi mRNA dalam nukleus (proses
splicing), serta mengatur / menjaga telomer. Fungsi lain yang dimilikinya ialah membantu regulasi
(transcription factor, RNA polymerase II), membentuk snRNP dengan protein, dan ikut serta dalam
splicing (penyambungan) RNA.

12. Heterogonous nuclear RNA (hnRNA)
hnRNA merupakan precursor RNA yang mengandung kodon. hnRNA ini merupakan
transkripsi dari DNA genomik. Selain itu, hnRNA yang diproses dengan snRNA juga menghasilkan
mRNA. hnRNA Merupakan transkripsi dari DNA genomik yang terbentuk di nukleus


III. SINTESIS ASAM NUKLEAT

ABSTRAK
Asam nukleat merupakan salah satu makromolekul yang memegang peranan sangat penting
dalam kehidupan organisme karena di dalamnya tersimpan informasi genetik. Ada dua macam asam
nukleat, yaitu asam deoksiribonukleat atau deoxyribonucleic acid (DNA) dan asam ribonukleat atau
ribonucleic acid (RNA). Adapun proses sintesis nukleat dibagi menjadi dua macam. Sintesis DNA
disebut juga proses replikasi DNA, sedangkan sintesis RNA disebut juga Transkripsi RNA. Masing
masing proses sintesis tersebut memiliki komponen komponen yang terlibat, dan mekanisme
yang berbeda baik= pada eukariotik maupun prokariotik.Dengan bantuan beberapa jenis enzim
proses sintesis asam nukleat pun dapat terlaksana.

REPLIKASI DNA

Komponen Penyusun Replikasi DNA
1. Polimerase DNA
DNA Polimerase adalah enzim yang mengkatalisi polimerisasi deoksiribonukleotida
deoksiribisanukleotida menjadi utaian DNA. DNA polimerase yang paling terkenal karena
peran mereka dalam replikasi DNA, di mana polimerase "membaca" sebuah untai DNA utuh
sebagai template dan menggunakannya untuk mensintesis untai baru. DNA polimerase
menggunakan ion magnesium untuk aktivitas katalitik. DNA Polimerase memiliki struktur
yang sangat-kuat. subunit katalitik mereka secara keseluruhan bervariasi.

15

2. Ligase DNA
Dalam biologi molekuler, ligase DNA adalah tipe khusus dari ligase, yang merupakan enzim
(EC 6.5.1.1) dalam perbaikan sel diskontinuitas beruntai tunggal pada molekul DNA beruntai
ganda. DNA ligase yang dimurnikan digunakan dalam mengkloning gen untuk
menggabungkan molekul DNA bersama sama.
Mekanisme ligase DNAdalam bekerja adalah untuk membentuk dua ikatan kovalen
fosfodiester antara 3 'ujung hidroksil dari satu nukleotida, ("akseptor") dengan ujung 5' fosfat
lain ("donor"). ATP diperlukan untuk reaksi ligase, yang berlangsung dalam tiga langkah: (1)
adenylation (penambahan AMP) dari residu di pusat aktif enzim, pirofosfat dilepaskan, (2)
transfer AMP ke 5 'fosfat dari donor yang disebut, pembentukan ikatan pirofosfat, (3)
pembentukan ikatan fosfodiester antara 5 'fosfat dari donor dan 3' hidroksil dari akseptor.
3. Primase DNA : enzim yang digunakan untuk memulai polimerisasi DNA pada lagging strand
Primase adalah enzim yang mensintesis urutan RNA pendek yang disebut RNA primer. RNA
primer ini berfungsi sebagai titik awal untuk sintesis DNA. Sejak primase menghasilkan
molekul RNA primer , enzim yang bekerjaadalah jenis DNA polimerase.Fungsi dari Enzim
Primase adalah mensintesis urutan RNA pendek yang melengkapi satu bagian untai DNA,
yang berfungsi sebagai template-nya. Sangat penting diketahui bahwa RNA primer disintesis
oleh primase sebelum replikasi DNA dapat terjadi. Hal ini karena enzim yang mensintesis
DNA, yang disebut DNA polimerase, hanya dapat mempolimerisasi nukleotida DNA baru ke
untai nukleotida yang ada. Oleh karena itu, primase berfungsi untuk mengawali dan
meletakkan dasar untuk sintesis DNA
4. Helikase DNA : enzim yang berfungsi membuka jalinan DNA double heliks
Helikase DNA adalah enzim yang mengikat dan bahkan dapat merombak asam nukleat atau
protein asam nukleat kompleks . Helikase DNA sangat penting selama replikasi DNA karena
mereka memisahkan DNA untai ganda menjadi untai tunggal yang memungkinkan setiap
helai yang akan disalin . Selama replikasi DNA , DNA helikase membuka DNA pada posisi
yang akan menjadi awal mula dimana sintesis akan dimulai . Helikase DNA terus membuka
DNA membentuk struktur yang disebut garpu replikasi. Proses memecah ikatan hidrogen
antara pasangan basa nukleotida dalam DNA beruntai ganda membutuhkan energi . Untuk
melepaskan ikatan , helicases menggunakan energi yang tersimpan dalam molekul yang
disebut ATP , yang berfungsi sebagai peredaran energi sel . Helikase DNA juga berfungsi
dalam proses seluler lain di mana DNA beruntai ganda harus dipisahkan , termasuk
perbaikan DNA dan transkripsi

5. Single strand binding protein (SSBs)
Single strand binding protein(SSBs) berfungsi untuk mencegah untai DNA heliks ganda yang
telah dibuka oleh enzim helicase menjadi rantai tunggal DNA menyatu kembali. DNA paling
stabil secara fisiologis ketika ada dalam kondisi heliks ganda, asalkan untai komplementer
DNA yang hadir di lokasi yang sama. Setelah helikase memisahkan enzim double helix
menjadi individu, untai tunggal DNA, maka untaian untaian tersebut akan cenderung untuk
menyatu kembali menjadi heliks ganda kecuali mereka dicegah dari proses penyatuan
tersebut.

6. Enzim Ribonuclease H (RNase H)
Digunakan untuk mendegradasi RNA primer dari jalinan DNA baru yang terbentuk.

Metode Replikasi Dna
1. Metode Konservatif
Dalam metode ini dua untai DNA parental kembali seperti semula setelah replikasi
berlangsung. Artinya, salah satu material DNA mengandung kedua untai DNA parental, dan
material DNA lainnya mengandung untai DNA yang rau saja disintesis.

2. Metode Semikonservatif
Dalam metode ini dua untai DNA parental terpisah dan masing-masing helai kemudian

16

berfungsi sebagai template untuk sintesis untai DNA baru. Hasilnya adalah dua heliks ganda
DNA, yang terdiri dari satu parental dan satu untai baru.

3. Metode Dispesif
Dalam metode ini DNA heliks ganda parental terbuka menjadi segmen segmen DNA
beruntai ganda seperti pada model konservativ , segmen segmen tadi berfungsi sebagai
template untuk sintesis untai DNA baru. Segmen segmen DNA parental diselingi DNA
keturunan berkumpul dan menyatu membentuk DNA heliks ganda.


Gambar 1.1 Metode dalam Replikasi DNA



Mekanisme Replikasi DNA
1. Pemisahan Jalinan DNA
Enzim helicase membuka jalinan DNA doubleheliks. Tempat dimana jalinanan DNA
doubleheliks diubah menjadi rantai tunggal dan replikasi berlangsung disebut garpu
replikasi.
Single strand DNA-binding protein atau SSB melapisi jalinan tunggal rantai DNA agar tidak
kembali menyatu menjadi rantai ganda.

2. Sintesis Jalinan Baru

17


Gambar 1.2 Mekanisme Replikasi DNA

Sebelum proses replikasi berlanjut . Giliran kerja enzim polymerase untuk menggandakan
rantai tunggal DNA sebagai pelengkap. Namun perlu diketahui bahwa enzim polymerase
hanya bekerja untuk memperpanjang nukleotida nukleotida. Tidak bisa memulai dari gugus
gula pada suatu nukleotida. Oleh karena itu Enzim primase mensintesis RNA primer agar
polimerisasi DNA dapat dilakukan oleh enzim polymerase.
Enzim polymerase mensintesis jalinan baru dari arah 5 menuju 3 pada RNA primer. Itu
berarti masing2 enzim pada kedua jalinan bekerja saling berlawanan arah. Pada saat enzim
polymerase mensintesis DNA , enzim SSB secara sendirinya terlepas dari jalinan tunggal
DNA.
Pada jalinan satu atau disebut juga leading strand, enzim polymerase bekerja secara
berkelanjutan/kontinyu . Pada jalinan lainnya atau disebut juga lagging strand, enzim
polimerase bekerja secara terputus putus dengan cara Enzim primase mensintesis
beberapa RNA primer di jarak yang tersisa pada jalinan DNA tunggal yang belum
dipolimerisasi. Jarak Jalinan jalinan DNA yang terpisah oleh RNA primer pada lagging
strand disebut okazaki fragments.

3. Penyatuan Fragmen
Pada untai DNA baru terdapat beberapa RNA primer yang melekat yang harus dihilangkan
dan jarak antar Jalinan DNA atau okazaki fragment haruslah hilang dan Jalinan DNA yang
terputus menjadi menyatu.untuk itu Enzim RNase H berfungsi untuk mendegradasi RNA
primer dari jalinan DNA dan Enzim polimerisasi menggantinya dengan untaian DNA baru.
Terakhir jarak pada okzaki fragment disatukan oleh Enzim ligase yang berfungsi seperti
perekat.

Transkripsi
Komponen yang terlibat dalam proses transkripsi
1. DNA Template
2. Enzim RNA Polimerase
3. Promoter
4. Terminator


Tahapan proses transkripsi
1. Tahapan inisiasi
Sebelum tahap inisiasis RNA polimerase membentuk kompleks dengan rantai ganda DNA,
ikatan hidrogen dilelehkan, dan menciptakan gelembung transkripsi. Tahap inisiasi
mendeskripsikan pembentukan ikatan nukleotida pertama dalam RNA. Enzim RNA

18

polimerase tetap berada di daerah promotor sambil mensintesis ~9 nukleotida pertama.
Namun demikian, pembentukan nukleotida pendek ini terkadang mengalami keguguran
(abortion), yaitu: enzim mensintesis transkrip kurang dari 9 basa, melepaskannya kembali,
dan memulai kembali mensintesis RNA baru. Tahapan pengawalan berakhir apabila enzim
mampu mensintesis rantai RNA baru melewati batas panjang ini.
2. Tahapan elongasi
Tahapan elongasi adalah selang selama enzim bergerak sepanjang DNA cetakan dan
memperpanjang rantai RNA. Sambil ia bergerak, ia membuka rantai ganda DNA dan
menyingkapkan sandi rantai tunggal DNA dengan nukleotida-nukleotida yang datang
menyerang ujung 3 dari rantai RNA yang sedang mengalami pemanjangan, membentuk
molekul hibrida RNA-DNA di daerah yang dibuka gulungannya. Persis dibelakang gulungan
DNA yang terbuka ini, rantai tunggal DNA berpasangan kembali membentuk rantai ganda
dengan pasangan aslinya. RNA kemudian muncul sebagai rantai tunggal yang bebas, yang
ujung pemanjangannya masih terkait dengan kompleks DNA-RNA-enzim.
3. Terminasi
Terminasi melibatkan pengakuan titik dimana tidak ada lagi basa yang ditambahkan ke
dalam rantai. Untuk mengakhiri transkripsi, pembentukan ikatan fosfodiester harus
dihentikan, dan kompleks transkripsi harus dibubarkan. Sewaktu nukleotida terakhir
ditambahkan akan diikuti oleh runtuhnya gelembung transkripsi, dan dilepaskannya hibrida
RNA-DNA. DNA kembali ke keadaan rantai ganda, RNA dan enzim dibebaskan. Urutan basa
nukleotida dalam DNA yang digunakan agar terjadinya pengakhiran transkripsi disebut
terminator.

Mekanisme transkripsi pada prokariot
Inisiasi Transkripsi
Terdapat empat langkah inisiasi pada transkripsi yaitu:
1. Pembentukan kompleks promoter tertutup, yaitu RNA polymerase holoenzim menempel
pada DNA bagian promoter suatu gen. Dalam hal ini subunit s yang menempel pada RNA
Polimerase berperanan dalam menemukan bagian promoter suatu gen. Pada awal
penempelan, RNA polymerase masih belum terikat secara kuat dan struktur promoter
masih dalam keadaan tertutup (closed promoter complex).
2. Pembentukan kompleks promoter terbuka, RNA polymerase terikat secara kuat dan ikatan
hydrogen molekul DNA pada bagian promoter mulai terbuka membentuk struktur terbuka
(open promoter complex). Struktur khas promoter biasanya berupa suatu kelompok ikatan
hydrogen antara kedua untaian DNA pada posisi -35 dan -10. Sedangkan bagian DNA
yang terbuka setelah RNA polymerase menempel biasanya terjadi pada daerah sekitar -9
dan +3 sehingga menjadi struktur untai tunggal.
3. Penggabungan beberapa nukleotida awal (10 nukleotida). Bagian DNA yang berikatan
dengan RNA polymerase membentuk suatu struktur gelembung transkripsi (transcription
bubble) sepanjang kurang lebih 17 pasang basa. Setelah struktur promoter terbuka secara
stabil, maka selanjutnya RNA polymerase melakukan proses inisiasi transkripsi dengan
menggunakan urutan DNA cetakan sebagai panduannya. Dalam proses transkripsi,
nukleotida RNA digabungkan sehingga membentuk transkrip RNA. Nukleotida pertama
yang digabungkan hampir selalu berupa molekul purin.
4. Perubahan konformasi RNA polymerase karena subunit s dilepaskan dari kompleks
holoenzim. Setelah RNA polymerase menempel pada promoter, subunit s melepaskan diri
dari struktur holoenzim. Pelepasan subunit s biasanya terjadi setelah terbentuk molekul
RNA sepanjang 8 9 nukleotida. RNA polymerase inti yang sudah menempel pada
promoter akan tetap terikat kuat pada DNA sehingga tidak lepas. Selanjutnya subunit s
dapat bergabung dengan RNA polymerase yang lain untuk melakukan proses inisiasi
transkripsi selanjutnya.

19



Elongasi Transkripsi
1. Pada bagian gelembung transkripsi, basa-basa molekul RNA membentuk hybrid dengan
DNA cetakan sepanjang kurang lebih 12 nukleotida. Hybrid RNA-DNA ini bersifat
sementara sebab setelah RNA polimerasenya berjalan, maka hidrid tersebut akan terlepas
dan bagian DNA yang terbuka tersebut akhirnya akan menutup lagi. RNA polymerase akan
berjalan membaca DNA cetakan untuk melakukan proses pemanjangan untaian RNA. Lalu
pemanjangan maksimum molekul transkrip RNA berkisar antara 30 sampai 60 nukleotida
perdetik, meskipun laju rata-ratanya dapat lebih rendah dari nilai ini. Secara umum,
berdasarkan atas nilai laju semacam ini, sutu gen yang mengkode protein akan disalin
menjadi RBA dalam waktu sekitar satu menit. Meskipun demikian, laju pemanjangan
transkrip dapat menjadi sangat rendah jika RNA polymerase melewati sisi jeda yang
biasanya mengandung banyak basa GC.
2. Dalam pemanjangan transkrip, nukleotida ditambahkan secara kovalen pada ujung 3
molekul RNA yang baru terbentuk. Nukleotida RNA yang ditambahkan tersebut bersifat
komplementer dengan nukleotida pada untaian DNA cetakan. Ada dua hipotesis yang
diajukan mengenai perubahan topologi DNA dalam proses pemanjangan transkripsi, yaitu:
1) Enzim RNA polymerase bergerak melingkari untaian DNA sepanjang perjalanannya,
2) Enzim RNA yang terbentuk tidak mengalami pelintiran, tetapi untaian DNA yang
ditranskripsi harus mengalami puntiran.
3. Dalam proses pemanjangan transkripsi RNA, terjadi pembentukan ikatan fosfodiester
antara nukleotida RNA yang satu dengan nukleotida yang berikutnya dan ditentukan oleh
keberadaan subunit b pada RNA polymerase. Transkripsi berakhir ketika RNA polymerase
mencapai ujung gen (terminator).
Terminasi Transkripsi
Terdapat dua macam terminator transkripsi pada Prokaryotik, yaitu:
1. Terminator yang tidak tergantung pada protein rho (rho-dependent terminator). Dilakukan
tanpa harus melibatkan suatu protein khusus, melainkan ditentukan oleh adanya suatu
urutan nukleotida tertentu pada bagian terminator. Sinyal yang akan mengakhiri transkripsi
dengan mekanisme semacam ini ditentukan oleh daerah yang mengandung banyak urutan
GC yang dapat membentuk struktur batang dan lengkung (steam and loop) pada RNA
dengan panjang 20 basa di sebelah hulu dari ujung 3-OH dan diikuti oleh rangkaian 4-8
residu uridin berurutan. Struktur batang lengkung tersebut menyebabkan RNA polymerase
berhenti dan merusak bagian 5 dari hybrid RNA-DNA. Bagian sisa hybrid RNA-DNA
tersebut berupa urutan oligo (rU) yang tidak cukup stabil berpasangan dengan dA.
Akibatnya ujung 3 hybrid tersebut akan terlepas sehingga transkripsi berakhir. Selanjutnya,
pita DNA cetakan yang sudah tidak berikatan atau membentuk hibrid dengan RNA segera
menempel kembali pada pita DNA komplemennya. RNA polimerase inti pun akhirnya
terlepas dari DNA.
2. Terminator yang tergantung pada protein rho (rho-independent terminator). Pengakhiran
transkripsi yang memerlukan faktor rho hanya terjadi pada daerah jeda yang terletak pada
jarak tertentu dari promoter, maka daerah itu tidak dapat berfungsi sebagai daerah
pengakhiran transkripsi. Terminator yang bergantung pada rho terdiri atas suatu urutan
berulang-balik yang dapat membentuk lengkungan (loop), tetapi tidak ada rangkaian basa
T seperti pada daerah terminator yang tidak melibatkan faktor rho. Faktor rho diduga ikut
terikat pada transkrip dan mengikuti pergerakan RNA polymerase sampai akhirnya RNA
polymerase berhenti pada daerah terminator yaitu sesaat setelah menyinstesis lengkungan
RNA. Selanjutnya, faktor rho menyebabkan distabiliasi ikatan RNA-DNA sehingga transkrip
RNA terlepas dari DNA cetakan.

20


Mekanisme transkripsi pada eukariot
Mekanisme transkripsi pada eukariot pada dasarnya menyerupai mekanisme pada prokariot.
Namun, begitu banyaknya polipeptida yang berkaitan dengan mesin transkripsi pada eukariot
menjadikan mekanisme tersebut jauh lebih kompleks daripada mekanisme pada prokariot. Secara
umum mekanisme transkripsi dimulai dari inisiasi, elongasi dan terminasi. Tetapi pada eukariot
terdapat tiga gen kelas yang berperan dalam proses transkripsi, karena itu transkripsi harus
dilakukan pada masing-masing gen kelas tersebut. Proses transkripsi diawali (diinisiasi) oleh proses
penempelan faktor-faktor transkripsi dan kompleks enzim RNA polimerase pd daerah promoter.
RNA polimerase eukariot tidak menempel secara langsung pada DNA di daerah promoter,
melainkan melalui perantaraan protein-protein lain, yg disebut faktor transkripsi Pada eukariot
proses transkripsi dan translasi tidak terjadi secara bersamaan, karena transkripsi terjadi pada inti
sedangkan translasi terjadi pada sitoplasma. Jeda waktu anatara transkripsi dan translasi disebut
fase pasca-transkripsi.
Pada fase pasca-transkripsi, terjadi proses :
Pemotongan dan penyambungan RNA (RNA-splicing)
Pada eukariot banyak terdapat gen yang organisasinya tersusun atas akson dan intron, meskipun
tidak semua gen eukariot mempunyai intron. Pada awalnya, gen yang terdiri atas ekson dan
intron yang ditranskipsi menghasilkan pre-mRNA karena masih mengandung sekuensi intro.
Pada tahapan selanjutnya intron akan dipotong dari pre-mRNA dan ekson-ekson yang ada
selanjutnya disambung menjadi mRNA yang matang. Proses pemotongan intron dan
penyambungan kembali ekson-ekson disebut sebagai proses penyambungan RNA. Transkripsi
mRNA yang sudah matang inilah yang selanjutnya akan ditranslasi.
Poliadenilasi (penambahan gugus poli-A pada ujung 3mRNA)
Poliadenilasi dlakukan pada prekusor mRNA bahkan sebelum terjadi termnasi transkripsi. Hal
tersebut dlakukan dengan cra memoton prekusor mRNA pada bagian yang nantinya akan
menjadi bagian mRNA yang matang, kemudian dilanjutkan dengan penambhan polia paa ujung
3 yang terbuka. Bagian mRNA yang isentesis setelah poliadenilasi selanjutnya akan didegradasi.
Penambahan tudung (cap) pada ujung 5 mRNA
Pada mRNA eukariot mengalami meilasi (penambahan gugus metal) yang sebagian besar
terakumulasi pada ujung 5 mRNA. Struktur ini kemudian dikenal sebagai tudung mRNA
Penyuntingan mRNA
Transkripisi pada Virus
Retrovirus bereproduksi secara transkripsi balik. Pada proses transkripsi balik, virus
menggunakan RNA sebagai model cetakan (blue print) untuk membentuk DNA. Selanjutnya, DNA
yang terbentuk di gunakan untuk membentuk RNA virus baru. Retrovirus dapat melakukan
transkripsi balik dengan bantuan enzim reversetranscriptase yang dimilikinya.
Proses transkripsi balik RNAmenjadi DNA adalah sebagai berikut :
1. tRNA primer terikat pada Primer Binding Site (PBS) RNA.
2. Enzim reverse transcriptase memulai kerjanya dari PBS dengan mengkopiRNA menjadi rantai
tunggal DNA. Pada tahap ini, pengkopian RNA hanyaterjadi dari PBS ke LTR ( Long Terminal
Repeat).
3. Setelah terjadi pengkopian RNA, RNase H akan memindahkan fragmenRNA (U5 dan R) yang
telah dikopi sebelumnya.
4. Tahapan tersebut diikuti dengan loncatan pertama, yakni berpindahnya kopi DNA ke ujung
rantai 3.
5. Rantai DNA mulai dikopi kembali dengan diawali dari ujung rantai 3.
6. RNase H memindahkan RNA yang telah dikopi dan hanya menyisakan satufragmen RNA yang
utuh, yang dinamakan bidang polypurine.

21

7. Reverse transcriptase mulai menyusun rantai kedua DNA. Tahapan inidimulai dari bidang
polypurine. Pembuatan rantai kedua DNA merupakanpembuatan rantai sebagai pasangan kode
rantai pertama.
8. Sekarang, RNAse H memindahkan semua RNA, bidang polypurine dantRNA primer.
9. Loncatan kedua terjadi, PBS yang terletak pada rantai kedua terikat padaPBS di rantai pertama.
10. Enzim Reverse Transcriptase telah menyelesaikan tugasnya denganmenuntaskan pengkopian
rantai kedua DNA sekaligus menyelesaikanpembentukan LTR pada tiap-tiap ujung rantai






IV. DETEKSI ASAM NUKLEAT

Abstrak
Deteksi asam nukleat diperlukan untuk mengetahui keberadaan asam nukleat pada suatu zat. Asam
nukleat erat kaitannya dengan DNA (Deoksiribosa nukleid acid) dan RNA (Ribosa nukleid acid).
Oleh karena itu deteksi asam nukleat sama halnya dengan deteksi DNA atau RNA. Deteksi asam
nukleat dapat dibagi menjadi dua jenis, yakni secara kualitatif dan kuantitatif. Deteksi secara
kualitatif diantaranya adalah metode elektroforesis, hibridisasi, sequencing, analisis teknik PCR,
staining, blotting dan labelling. Terdapat pula analisis UV-vis Spectrophotometry yang mencakup
deteksi secara kuantitatif maupun kualitatif. Semua metode tersebut memiliki cara dalam mendeteksi
asam nukeat dengan ciri khasnya masing-masing.

Elektroforesis
Elektroforesis adalah teknik pemisahan yang paling popular dang dianggap sebagai gerbang dari
ilmu biologi molekuler. Elektroforesis memiliki prinsip tentang pemisahan campuran molekul
berdasarkan muatan listriknya sehingga pergerakan molekul-molekul tersebut pada masa diam
(stationary phase) dalam sebuah medan listrik akan berbeda-beda. Khusus untuk DNA, pemisahan
tidak didasarkan atas perbedaan muatan listriknya, tetapi menurut ukuran dan konformasi atau
struktur fisik molekulnya. Gel yang biasa digunakan adalah agarosa dan poliakrilamid. Gel agarosa
digunakan untuk memisahkan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000
pasang basa (pb), sedangkan gel poliakrilamid digunakan untuk fragmen-fragmen DNA yang lebih
kecil. Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi melalui
matriks gel menuju kutub positif (anode). Makin besar ukuran molekulnya, makin rendah laju
migrasinya. Jika hubungan antara ukuran molekul dan laju migrasi 102 dipetakan dalam suatu grafik
logaritmik, maka akan diperoleh kurva linier. Oleh karena itu, kita dapat memperkirakan berat
molekul suatu fragmen DNA dengan melihat atau membandingkan laju migrasinya dengan laju
migrasi fragmen-fragmen molekul DNA strandar (marker) yang telah diketahui ukurannya.
Fragmen-fragmen DNA divisualisasikan di bawah sinar ultraviolet setelah terlebih dulu direndam di
dalam larutan etidium bromid, pewarna yang akan menyisip atau melakukan interkalasi di sela-sela
basa DNA. Perendaman dilakukan setelah migrasi dianggap cukup untuk dihentikan. Fragmen DNA
akan nampak sebagai pita berwarna merah dengan posisi migrasi yang sesuai dengan berat
molekulnya. Cara ini dapat memvisualisasikan fragmen DNA hingga sekecil 0,05 g. Seperti telah
dikatakan di atas bahwa selain karena perbedaan ukurannya, laju migrasi DNA pada gel
elektroforesis juga ditentukan oleh konformasi molekulnya. DNA dengan bentuk covalently closed
circular (CCC) akan bergerak paling cepat, disusul berikutnya konformasi open circular (OC), dan
yang terakhir linier. Oleh karena perbedaan konformasi menyebabkan perbedaan laju migrasi, maka
penentuan ukuran suatu fragmen DNA selalu dilakukan pada konformasi linier. Elektroforesis
termasuk pada analisis kualitatif.
Sequencing asam nukleat
Sequencing asam nukleat adalah penentuan urutan basa nukleotida dalam fragmen DNA atau RNA.
Sequencing asam nukleat telah menjadi alat yang sangat diperlukan untuk penelitian biologi dasar
dan untuk berbagai bidang terapan, seperti diagnostik molekuler, rekayasa genetika, forensik,

22

pharmacogenomics dan sistem biologi. Secara tradisional, analisis urutan DNA telah dicapai dengan
menggunakan dua teknik yang berbeda: metode terminasi rantai ddNTP-dimediasi Sanger et al.
(1977) dan metode degradasi kimia Maxam dan Gilbert (1977). Meskipun kemajuan terbaru dalam
generasi teknologi sequencing DNA, metode sekuensing tradisional masih rutin digunakan di
banyak laboratorium ilmu kehidupan. Untuk mendapatkan hasil yang optimal dengan teknik
sekuensing konvensional, diperlukan pemilihan reagen yang cermat. Sequencing DNA dapat
digunakan pada banyak bidang lainnya seperti sub-tipe dari bakteri dan virus dengan mengurutkan
daerah variabel dari genom yang mereka miliki. Sequencing juga dapat memfasilitasi indentifikasi
dari hal yang telah teridentifikasi sebelumnya, atau pathogen yang tidak diketahui dan karenanya
hal ini dapat digunakan pada ilmu epidemologi molekular, investigasi pathogen, dan lain-lain.
Sanger sequence Metode Sanger, yang juga disebut sebagai sequencing dideoksi atau terminasi
rantai, didasarkan pada penggunaan dideoksinukleotida (ddNTP) di samping normal (NTP) yang
ditemukan dalam DNA. Dideoksinukleotida pada dasarnya sama dengan nukleotida kecuali mereka
mengandung gugus hidrogen pada 3 'karbon bukan gugus hidroksil (OH). Nukleotida yang
termodifikasi, ketika diintegrasikan ke dalam urutan, mencegah penambahan nukleotida lebih lanjut.
Ini terjadi karena ikatan fosfodiester tidak dapat terbentuk antara dideoksinukleotida dan nukleotida
masuk berikutnya sehingga rantai DNA diakhiri.
Metode sanger diawali dengan menguatkan
wilayah DNA yang akan diurutkan dalam beberapa
cara dan kemudian didenaturasi untuk
memproduksi DNA beruntai tunggal. Sebuah primer
sequencing teranneal menjadi DNA beruntai
tunggal. Pemutusan rantai dideoksinukleotida
sekuensing DNA kemudian mengambil keuntungan
dari fakta bahwa rantai berkembang nukleotida,
yang memperluas dalam 5 ' ke arah 3', akan
berakhir jika, selain Deoksinukleotida konvensional,
dideoksinukleotida 2'3' menjadi dimasukkan.
Dengan melakukan empat reaksi terpisah, masing-
masing berisi polimerase DNA dan sejumlah kecil
salah satu dari empat dideoksi selain keempat
deoksinukleotida, empat set terpisah fragmen rantai
dihentikan dapat diproduksi. Mengikuti langkah replikasi/terminasi, fragmen rantai yang dihentikan
ini akan tetap terikat pada molekul DNA beruntai tunggal yang telah bertindak sebagai template.
Dengan memanaskan molekul-molekul ini sebagian double stranded dan menambahkan agen
denaturing seperti formamida, molekul pemutusan rantai beruntai tunggal dapat dilepaskan dari
template mereka dan dipisahkan menggunakan resolusi tinggi denaturasi gel elektroforesis. Urutan
wilayah asli dari DNA kemudian akhirnya disimpulkan dengan melihat posisi relatif dari rantai produk
terminasi dideoksinukleotida dalam empat jalur dari gel denaturisasi. Metode Sanger ini termasuk
metode secara kualitatif untuk menganalisis asam nukleat.
Labelling asam nukleat
Asam nukleat dapat dimodifikasi dengan tanda yang memungkinkan deteksi atau pemurnian. Hasil
dari probe asam nukleat dapat digunakan untuk mengidentifikasi atau menemukan interaksi molekul
dengan molekul lainnya. Jenis labeling yang umum digunakan untuk menghasilkan probe asam
nukleat diantaranya fosfat radioaktif, biotin, fluorophores, dan enzim. Selain itu, metode biokonjugasi
dapat digunakan untuk menghasilkan probe asam nukleat dapat disesuaikan untuk memasang
asam nukleat dengan molekul lain atau ke permukaan untuk memfasilitasi pengiriman ditargetkan
atau imobilisasi.
Metode enzimatik dalam labeling asam nukleat- TdT (Terminal Deoxynucleotidyl Transferase)
sering digunakan untuk melabel probe DNA untuk RACE (Rapid Amplifikasi cDNA Ends), TUNEL
(Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP Nick-End Labeling) tes dan sebagai metode untuk
menambahkan ujung 3' untuk fragmen DNA untuk memfasilitasi kloning. TdT juga dapat digunakan
untuk label ujung 3' dari probe DNA dengan tag radioaktif dan nonradioaktif untuk berbagai aplikasi
deteksi dan afinitas. Misalnya, penambahan TdT biotin-11-UTP ke ujung 3' dari probe DNA
komplementer adalah cara yang efektif untuk menciptakan probe untuk digunakan dalam tes
pergeseran electromobility (EMSA) nonradioaktif dan tes DNA pull-down.
Gambar. 1 Sanger Method

23

T4 RNA ligase adalah enzim dikodekan dalam genom
bakteriofag T4. T4 RNA ligase mengkatalisis lampiran dari
terminal 5'-fosfat untuk kelompok 3'-hidroksil terminal pada
RNA. T4 ligase RNA adalah template independen tetapi
membutuhkan RNA beruntai tunggal dan ATP. Meskipun
substrat utama untuk T4 ligase RNA adalah RNA, kondisi
reaksi dapat dioptimalkan untuk molekul DNA beruntai
tunggal, meskipun efisiensi sangat rendah. T4 ligase RNA
digunakan untuk pelabelan 'akhir RNA dengan [5' 3 P]
PCP (cytidine-3 ', 5'-bis-fosfat), memodifikasi mRNA untuk
cDNA generasi perpustakaan dan melakukan 5'-RACE. T4
ligase RNA juga dapat digunakan untuk 3 'akhir-label RNA
dengan tag nonradioactive menggunakan nucleoside tepat
dimodifikasi 3', 5'-bifosfat.
T4 polinukleotida Kinase (T4 PNK) adalah enzim dikodekan dalam genom bakteriofag T4. T4 PNK
transfer fosfat organik dari posisi gamma pada ATP ke gugus 5'-hidroksil dari DNA dan RNA. The
wild type enzim juga memiliki aktivitas 3'-fosfatase. T4 ligase PNK adalah template independen dan
memodifikasi polynucleotides beruntai tunggal dan 5 overhang 'efisien. Tumpul-berakhir dan 5
'tersembunyi ujung dapat dimodifikasi dengan efisiensi berkurang. T4 PNK digunakan terutama
untuk label ujung 5 'dari polynucleotides dengan fosfat radioaktif dari isotop diubah-ATP. PNK lebih
efisien dalam memodifikasi overhang pendek dan fragmen tumpul-end dari TdT atau T4 ligase RNA.
Meskipun dimungkinkan untuk melakukan reaksi fosfat-exchange, PNK pelabelan yang paling
efisien ketika ujung 5 'molekul target telah dephosphorylated. Lain penggunaan umum dari PNK
adalah 'fosforilasi polynucleotides sintetis (yaitu, primer DNA) 5 untuk memfasilitasi kloning.
DNA polimerase adalah keluarga enzim yang menciptakan polimer asam deoksiribonukleat dengan
menjadi katalis bagi bergabungnya akhir 5'- terfosforilasi dari deoxyribonucleotide (monomer) ke
ujung 3 - hidroksil dari untai DNA yang ada (DNA elongasi) atau primer (extension primer). DNA
polymerase tergantung pada template tapi tidak bergantung pada urutan. Untuk mensintesis DNA,
akhir 3-OH dari untai DNA yang ada harus anil ke untai komplementer DNA. Enzim viral reverse
transcriptase merupakan pengecualian untuk aturan ini dan menggunakan DNA atau RNA primer
dan template RNA untuk sintesis DNA komplementer. DNA polimerase akan mensintesis untai DNA
baru melalui perpanjangan yang ada di ujung 3'-OH, menambahkan nukleotida individu melengkapi
untai cetakan sedang dibaca. DNA polimerase digunakan untuk berbagai keperluan lab dari kloning
untuk sequencing. Aplikasi yang memerlukan amplifikasi fragmen DNA spesifik yang dilakukan
dengan bantuan enzim panas stabil kloning dari organisme termofilik (misalnya, Thermus aquaticus
(Taq), Bacillus stearothermophilus (Bst), Thermococcus litoralis (Vent)) dengan menggunakan
polymerase chain reaction (PCR). Untuk aplikasi di mana amplifikasi tidak diperlukan, polimerase
DNA dari organisme mesofilik ( misalnya E. coli (Klenow) dan bakteriofag (T4, T7)) dapat digunakan
tergantung pada panjang DNA yang akan disintesis dan tingkat replikasi kesetiaan yang diperlukan.
Probe yang dihasilkan dengan bantuan polimerase DNA yang paling sering dibuat oleh
penggabungan acak nukleotida diubah selama proses replikasi DNA, yang dapat dilakukan dengan
PCR atau reaksi ekstensi primer sederhana. Probe yang dihasilkan dengan cara ini memiliki aktivitas
spesifik yang tinggi dan memungkinkan deteksi jumlah kecil target. Secara tradisional, metode ini
diperlukan nukleotida radioaktif untuk menghasilkan probe, namun, biotin, fluorophores dan tag
nonradioactive lainnya dapat digunakan jika modifikasi tidak mengganggu dengan elongasi reaksi
polimerase (kecuali untuk aplikasi sequencing terminator). Untuk aplikasi yang memerlukan aktivitas
spesifik yang lebih rendah atau ketika pelabelan ditargetkan diinginkan, polimerase DNA dapat
digunakan untuk label khusus ujung probe DNA. Untuk label 5'-akhir probe DNA, primer 5' ujung
yang telah dimodifikasi harus digunakan. Metode ini sangat berguna ketika menambahkan tag
afinitas atau fluorophores untuk probe DNA yang terlalu panjang untuk sintesis otomatis efisien.
Metode ini sangat ideal untuk 5' ujung label dengan PCR atau reaksi ekstensi primer sederhana.
Untuk label probe DNA di atau dekat polimerase 3' ujung, DNA dapat digunakan untuk
menggabungkan satu atau lebih nukleotida yang termodifikasi ke ujung probe beruntai ganda
dengan 3' ujung tersembunyi. Reaksi "fill" ini dapat dilakukan dengan primer anil yang tidak stabil,
fragmen restriksi atau molekul DNA beruntai ganda lain di mana urutan DNA komplementer dapat
anil dan digunakan sebagai template untuk perpanjangan 3' ujung. Klenow fragment (E. coli DNA
Gambar. 2 T4 RNA ligase

24

polimerase I) umumnya digunakan untuk reaksi mengisi-dalam dan bahkan dapat digunakan untuk
3' akhir-label molekul RNA ketika hibridisasi ke primer DNA menghasilkan ujung 3 ' tersembunyi .
RNA polymerase adalah keluarga enzim yang menciptakan polimer asam ribonukleat dengan
menjadi katalis bagi bergabungnya dari ujung 5' terfosforilasi ribonucleotide (monomer) ke ujung 3'-
hidroksil dari ribonucleotide dimasukkan sebelumnya. Polimerase RNA adalah tergantung pada
template dan tergantung urutan, membutuhkan urutan promotor dalam template DNA dalam rangka
untuk memulai pengikatan enzim dan, tergantung pada sistem host, berbagai kofaktor yang
diperlukan untuk transkripsi RNA untuk melanjutkan pada template beruntai tunggal. RNA
polimerase digunakan untuk berbagai keperluan lab dari sintesis in vitro dari mRNA ke generasi
probe untuk hibridisasi dan tes mengikat. Probe yang dihasilkan dengan bantuan RNA polimerase
yang dibuat oleh penggabungan acak nukleotida diubah selama proses transkripsi. Hal ini biasanya
dilakukan dengan kloning cDNA atau urutan template lainnya menjadi plasmid yang mengandung
satu atau lebih urutan RNA polimerase promotor. Probe RNA yang dihasilkan dengan cara ini
memiliki aktivitas spesifik yang tinggi dan yang paling sering dibuat dengan nukleotida radioaktif,
meskipun biotin dan tag lainnya juga tersedia.
Metode kimiawi dalam labeling asam nukleat- Oksidasi Periodat RNA. Meta- dan orto- periodat
(IO4 dan IO6, masing-masing) adalah anion terbentuk dari yodium dan ok sigen dan umumnya
ditemukan sebagai garam dengan kalium (misalnya KIO4) atau natrium (misalnya NaIO4). Dalam
larutan, periodat memotong ikatan antara atom karbon yang
berdekatan yang memiliki gugus hidroksil (diol berdamping atau cis-
glikol), menciptakan dua kelompok aldehida. Kelompok aldehida yang
dihasilkan secara spontan reaktif terhadap amina yang mengandung
molekul primer dan permukaan. Aldehida dapat digunakan dalam dua
jenis reaksi kopling dengan baik tag amina atau primer hydrazide-
diaktifkan. Amina primer bereaksi dengan aldehida untuk membentuk
Schiff basa, yang mudah menghidrolisis dan harus distabilkan melalui
pengurangan mereka untuk obligasi menjadi amina sekunder dengan
natrium cyanoborohydride (NaBH4). Molekul hydrazide-dimodifikasi
juga spontan bereaksi dengan aldehida, tetapi membentuk hubungan
hydrazone cukup stabil, membuat reaksi jauh lebih efisien.
Penambahan natrium cyanoborohydride akan meningkatkan efisiensi reaksi lebih lanjut dan
meningkatkan stabilitas obligasi dari waktu ke waktu dan perubahan pH. Karena sifat oksidatif ringan
nya, natrium meta-periodat sering digunakan sebagai oksidator karbohidrat protein untuk
menghasilkan kelompok aldehida reaktif baik untuk deteksi atau prosedur konjugasi kimia. The diol
berdamping ribosa nukleotida dalam RNA juga dapat dibelah dengan periodat-memungkinkan
metode ini digunakan untuk menambahkan label ujung 3' tunggal untuk RNA tetapi tidak DNA.
Ribosa nukleotida dalam RNA dapat dibelah dengan penambahan periodat-memungkinkan label
pada ujung 3' tunggal.
Aktivasi EDC dari 5' fosfat Karbodiimida adalah kelompok fungsional (RN=C=NR) yang biasanya
digunakan dalam sintesis organik untuk mengaktifkan
pembentukan amida atau phosphoramidate hubungan antara
amina primer (RNH2) dan karboksilat (RCOOR' - atau molekul yang
mengandung fosfat (R-PO4), masing-masing. Tidak seperti
kebanyakan crosslinkers , karbodiimida tidak menjadi bagian dari
crosslink final antara molekul dan dengan demikian tidak
menambahkan struktur kimia tambahan untuk produk yang
dihasilkan. EDC (EDAC, 1-Etil-3- [3-dimethylaminopropyl]
carbodiimide hidroklorida) adalah karbodiimida yang larut dalam air
lebih disukai untuk digunakan da lam reaksi berair dalam kisaran
pH kisaran pH 4,0-6,0, di mana reaksi - produk dapat dengan
mudah dihilangkan dengan dialisis atau pengendapan produk konjugasi. Dalam reaksi dengan
gugus asam karboksilat, EDC membentuk O-acylisourea aktif menengah yang mudah tergeser oleh
serangan nukleofilik dari kelompok amino utama dalam campuran reaksi. Reaksi yang sama dapat
dilakukan dengan fosfat (yaitu, 5' fosfat dari oligonukleotida) meskipun imidazol harus disertakan
dalam reaksi untuk mendapatkan konjugasi efisien. Karena 5' fosfat diperlukan, oligonukleotida
sintetis pertama harus diobati dengan kinase. Dengan pengecualian kecil, konjugasi EDC-
Gambar. 3 Oksidasi Periodat RNA

25

termediasi merupakan sarana ekonomis untuk kopling baik RNA dan DNA untuk hampir semua
utama amina yang mengandung molekul atau permukaan lainnya.
Chemical random-labeling Pelabelan acak kimiawi asam nukleat dapat dicapai dengan berbagai
cara. Karena metode ini label di situs acak sepanjang DNA atau molekul RNA, mereka
memungkinkan tingkat yang lebih tinggi dari label yang akan dicapai daripada teknik-end label.
Namun, satu kelemahan dari metode ini adalah bahwa basa nukleotida secara langsung
dimodifikasi, yang akan mengurangi atau mencegah dasar-pasangan antara untai komplementer
selama percobaan hibridisasi. Oleh karena itu, mungkin perlu untuk menyeimbangkan tingkat
pelabelan dengan efisiensi hibridisasi probe dalam percobaan tertentu. Yang paling populer strategi
acak-label kimia melibatkan penggunaan reagen pelabelan fotoreaktif atau Universal Linkage
System (ULS, KREATECH Bioteknologi BV). Dua jenis label reagen photoreactiv digunakan untuk
asam nukleat: phenylazide- dan berbasis psoralen. Ketika gugus fungsional phenylazide terkena
sinar UV, membentuk nitrene labil yang dapat memasukkan nonspesifik menjadi ikatan ganda dan
situs CH dan NH melalui reaksi. Selain itu, asalkan nukleofilik lebih reaktif (misalnya, amina primer)
tidak hadir. Molekul yang mengandung gugus fungsional psoralen dapat digunakan untuk label DNA
untai ganda atau RNA. Struktur cincin psoralen efektif intercalates ke bagian beruntai ganda, dan
paparan sinar UV menyebabkan produk cyclo-selain dibentuk dengan ikatan 5,6 - ganda dalam
residu timin. The ULS label reagen mengandung suhu- aktif berbasis platinum bagian proprietary
yang bereaksi dengan basa guanin dalam RNA dan DNA dan rantai samping metionin, sistein dan
histidin residu protein.
Staining asam nukleat
Ada beberapa staining (pewarnaan) yang berbeda yang dapat digunakan untuk memvisualisasikan
dan foto DNA setelah pemisahan dengan elektroforesis gel. Daftar berikut menjelaskan beberapa
pilihan pewarnaan, dan perbedaan antara mereka.
Ethidium Bromide Etidium bromida kemungkinan pewarna yang paling terkenal digunakan untuk
memvisualisasikan DNA. Pewarna ini dapat digunakan dalam campuran gel, dalam buffer
elektroforesis atau pewarna gel setelah dijalankan. Molekul pewarna mematuhi untai DNA dan
berpendar di bawah sinar UV, menunjukkan di mana pita berada dalam gel. Etidium bromida
merupakan karsinogen potensial, sehingga harus ditangani dengan hati-hati. Karena risiko
kesehatan potensial dari bekerja dengan gel ini, alternatif telah ditemukan.
SYBR Emas SYBR Emas pewarna dapat digunakan untuk pewarna ganda atau untai tunggal DNA,
atau RNA. Itu adalah salah satu alternatif pertama yang etidium bromida untuk memukul pasar dan
dianggap lebih sensitif dibandingkan etidium bromida. Pewarna pameran 1000 kali lipat fluoresensi
UV lebih besar setelah terikat dengan asam nukleat. Menembus tebal dan tinggi % agarose gel dan
dapat digunakan dalam formalin gel. Karena fluoresensi molekul terikat begitu comparitively rendah,
destaining tidak diperlukan. Lisensi pemegang Probe Molekuler memiliki juga, sejak saat itu,
dipasarkan SYBR Aman dan SYBR Hijau sebagai alternatif yang lebih aman untuk etidium bromida.
SYBR Hijau Pewarna SYBR Hijau I dan II, oleh Probe Molekuler, dioptimalkan untuk tujuan yang
berbeda. Karena mereka mengikat DNA, mereka masih dianggap mutagen potensial dan harus
ditangani dengan hati-hati. SYBR Hijau I lebih sensitif untuk digunakan dengan DNA untai ganda,
sedangkan SYBR Hijau II yang terbaik untuk digunakan dengan DNA beruntai tunggal atau RNA.
Seperti etidium bromida, ini sangat sensitif pewarna berpendar di bawah sinar UV.
SYBR Safe SYBR Safe dirancang untuk menjadi alternatif yang lebih aman untuk etidium bromida
dan pewarna SYBR lainnya. Hal ini tidak dianggap sebagai limbah berbahaya dan umumnya dapat
dibuang melalui sistem saluran pembuangan biasa (yaitu sia-sia), karena pengujian toksisitas
menunjukkan tidak ada toksisitas akut dan sedikit atau tidak ada genotoxicity di sela Suriah Hamster
Embrio (SHE), limfosit manusia, limfoma tikus sel dan dalam uji AMES. Noda dapat digunakan
dengan transillluminator cahaya biru yang menyebabkan lebih sedikit kerusakan DNA yang
divisualisasikan dan efisiensi yang lebih baik untuk kloning.
Eva Green Eva Green adalah pewarna fluorescent hijau yang telah ditemukan untuk menghambat
PCR untuk sebagian lessor dari pewarna lainnya, sehingga sangat berguna untuk aplikasi seperti
kuantitatif real-time PCR. Ini juga merupakan pilihan yang baik ketika menggunakan titik lebur gel
rendah untuk menemukan DNA. Hal ini sangat stabil pada suhu tinggi dan memiliki fluoresensi
sangat rendah sendiri, tetapi sangat fluorescent ketika terikat ke DNA. Eva Green juga telah terbukti
memiliki sangat rendah atau tidak ada sitotoksisitas atau mutagenisitas.
Blotting

26

Blotting asam nukleat adalah teknik yang baik untuk mencari gen atau urutan dari campuran
kompleks dari DNA atau RNA. Blotting adalah proses dari berpindahnya biomolekul yang terpisah
secara elektroforesis (contoh: asam nukleat datau protein) dari gel (agarose atau polyacrylamide)
ke dalam substrat membran. Membran adalah substrat yang sangat ideal untuk mengikat dan
meretensi biomolekul karena permukaan dalamnya yang sangat luas dan terbuat dari polimer yang
sangat adsorptive. Sebagaimana perbandingannya dengan matriks gel dari biomolekul yang
ditransfer, membrane lebih mudah untuk digunakan dan dapat dimanipulasi dengan efektif di metode
deteksi berikutnya. Biomolekul dapat ditransfer dari gel ke membrane menggunakan tekanan
kapilaritas, vakum, atau medan magnet. Koloni (bakteri) atau plak (virus) tumbuh di agar plates dan
dapat ditransfer dengan meletakkan membran pada plate. Meskipun teknik dasar dari
mempersiapkan dan menganalisis blot sudah berjalan lebih dari dua dekade, penemuan terbaru
menunjukkan bahwa teknik Blotting telah membuka jalan pemanfaatan yang lebih luas untuk
membran Blotting dalam analisis asam nukleat. Blotting terdiri dari berbagai macam jenis,
diantaranya Southern blotting, North blotting, West blotting, dan Eastern blotting. Namun, Eastern
dan Western blotting tidak berlaku untuk deteksi asam nukleat karena teknik ini digunakan dan
berkenaan dengan protein.
Southern Blotting Southern blot adalah suatu teknik yang dikembangkan oleh Edwin. M. Southern
pada 1975, seorang ahli biologi asal Inggris.
Teknik ini digunakan untuk pendeteksian
suatu DNA sequence spesifik (gen atau lain)
dalam sample kompleks DNA (selular DNA).
Teknik ini juga digunakan untuk menentukan
bobot molekular suatu restriksi fragmen dan
untuk mengukur sejumlah relatif dalam
sample berbeda. Di bawah kondisi-kondisi
optimal, Southern blot mendeteksi ~ 0.1 pg
DNA yang menarik. Blot teknik digunakan
untuk memindahkan protein DNA dan RNA ke
suatu pengangkut sehingga dapat
dipisahkan, dan sering juga diikuti
penggunaan suatu gel ectrophoresis.
Southern blot digunakan untuk memindahkan
DNA. Digunakan biologi molekular untuk
melihat kemungkinan kehadiran suatu urutan
DNA dalam suatu sample DNA. Southern blot
berkombinasi gel agarose electrophoresis
untuk separasi ukuran DNA dengan metoda
untuk memindahkan DNA ke suatu membran
filter untuk pemeriksaan hybridisasi. Metoda
lain adalah Western blot dan Northern blot
memiliki prinsip kerja yang sama tetapi
menggunakan RNA dan protein.
Setelah electrophoresis, gel tersebut diperlakukan dengan suatu alkali yang menyebabkan DNA
terdenaturasi dan terpisah menjadi rantai tunggal. Suatu membran seperti selaput ditempatkan pada
gel dan diberi tekanan melalui pengisapan atau metoda mundane dalam kertas handuk (paper
towels) dengan suatu berat. DNA berpindah tempat ke membran dan stick. Membran DNA-
impregnanted dibakar atau menyebar secara permanen dengan menyertakan DNA tersebut.
Molekul yang kemudian diperlakukan dengan suatu pemeriksaan hybridisasi yang mana hanya
suatu molekul DNA dengan urutan dikenali yang akan dipasangkan dengan urutan DNA yang telah
ditandai (diblot). Pemeriksaan DNA berlabel dengan fluorescents atau chromogenic berpijar
sehingga dapat teridentifikasi. Dengan pengujian pola dari hybridisasi dengan sinar X atau
Autoradiografi, peneliti dapat menentukan fragmen yang berisi DNA sequence spesifik atau gen.
Southern blots digunakan untuk penemuan gen dan pemetaan, evolusi, dan studi pengembangan,
forensik dan diagnostik. Dalam tingkat genetik untuk memodifikasi pada organisme, Southern blot
digunakan sebagai test untuk memastikan bahwa bagian DNA tertentu mengenal urutan gen.
Southern blot analysis untuk menandai karakter transforman. Analisis Southern blot bermanfaat
Gambar. 5 Southern Blotting

27

untuk mengidentifikasi bentuk berbeda, menentukan memasukkan atau menyisipkan jumlah copy
dan untuk mendeteksi gross DNA penyusunan kembali yang mungkin telah terjadi perubahan. Jika
kamu sedang menganalisis galactosidase dengan memasukkan atau menyisipkan dan dipotong
potong dengan EcoRV maka akan dihasilakn potongan sekitar 1kb dari atas dan bawah dari urutan
galactosidase persandian dimulai. Pemecahan oleh enzim
restriksi analisis gel dan bloting.
Nothern Blotting Nothern Blotting digunakan untuk mempelajari
pola ekspresi dari jenis tertentu molekul RNA sebagai
perbandingan relatif antara set sampel yang berbeda dari RNA.
Ini pada dasarnya adalah kombinasi dari denaturasi RNA
elektroforesis gel, dan sebuah noda. Dalam proses ini RNA
dipisahkan berdasarkan ukuran dan kemudian ditransfer ke
membran yang kemudian diperiksa dengan pelengkap berlabel
urutan kepentingan. Hasilnya dapat digambarkan melalui
berbagai cara tergantung pada label yang digunakan, namun
hasil yang paling dalam penyataan band yang mewakili ukuran
RNA terdeteksi dalam sampel. Intensitas band-band ini berkaitan
dengan jumlah RNA target dalam sampel yang dianalisis.
Prosedur ini umumnya digunakan untuk mempelajari kapan dan
berapa banyak ekspresi gen yang terjadi dengan mengukur
berapa banyak bahwa RNA hadir dalam sampel yang berbeda.
Ini adalah salah satu alat yang paling dasar untuk menentukan
pada waktu apa, dan dalam kondisi apa, gen-gen tertentu yang
dinyatakan dalam jaringan hidup.

Setelah elektroforesis, Southern atau Northern blotting melibatkan transfer dan imobilisasi (blotting)
dari asam nukleat dari gel untuk dukungan solid (membran). Netral atau bermuatan positif nilon
adalah jenis yang paling umum dari membran digunakan untuk transfer asam nukleat. Blotting
memungkinkan penggunaan deteksi oleh probe hibridisasi.
Hasil asam nukleat blotting informasi berharga yang berkaitan dengan integritas gen dan copy
nomor (Southern blotting) dan menyediakan sarana untuk menganalisis ekspresi gen dan ukuran
mRNA (Northen blotting). Metode-metode ini dapat digunakan untuk jaringan karakter dan kultur sel
di laboratorium dan sering memberikan informasi berharga untuk evaluasi klinis dari sampel pasien.
Blotting termasuk analisis asam nukleat secara kuantitatif
Hibridisasi
Hibridisasi asam nukleat adalah dasar untuk esei yang cepat dan terpercaya. Basis fisis dari sistem
ini adalah pemasangan basa nukleotida yang tepat dan ikatan hidrogen antara satu string dari
nukleotida dan sekuens nukleotida komplemennya. Skema hibridisasi asam nukleat pada
laboratorium secara umum, yang pertama adalah ikat DNA untai tunggal (target) pada membran
pendukung. Kemudian menambahkan DNA untai tunggal berlabel (probe) pada kondisi yang cocok
dari temperatur dan kekuatan ionik untuk mempromosikan pemasangan basa antara probe dan DNA
target. Langkah selanjutnya mencuci dukungan untuk menghilangkan probe DNA berlebih yang
tidak terikat. Lalu mendeteksi sekuens hibrid yang terbentuk antara probe dan DNA target. Terakhir,
test diagnostik hibridisasi asam nukleat memiliki tiga elemen kritis: DNA probe, DNA target, dan
deteksi signal. Tipe sistem deteksi ini dapat menjadi sangat spesifik atau sangat sensitif.
Probe Hibridisasi Untuk menjadi efektif, probe hibridisasi asam nukleat harus memiliki spesifitas
yang sangat tinggi. Dengan kata lain, probe harus hibridisasi secara eksklusif pada sekuens asam
nukleat target yang dipilih. Positif palsu (i.e., respon pada ketidakhadiran sekuens target) dan negatif
palsu mengganggu kegunaan dari prosedur diagnostik. Probe dapat menjadi spesifik pada berbagai
tingkat organismik. Mereka dapat membedakan antara dua atau lebih spesies, menentukan strain
tertentu dalam suatu spesies, atau mengidentifikasi perbedaan antara gen. Bergantung pada
keperluan dari protokol test, probe bisa DNA atau RNA; panjang (>100 nukleotida) atau pendek (<50
nukleotida); disintesa secara kimia, mengklon gen yang utuh, atau mengisolasi daerah tertentu dari
gen.
Sekuens yang dapat membuat probe efektif dapat diisolasi dalam berbagai cara. Sebagai contoh,
DNA dari organisme patogen dapat dipotong dengan restriksi endonuklease dan diklon ke vektor

28

plasmid. Plasmid rekombinan ditapiskan dengan DNA genomik dari strain yang patogen dan non-
patogen. Plasmid-plasmid tersebut yang mengandung sekuens yang berhibridisasi hanya pada
strain patogen dari dasar probe spesifik. Test hibridisasi tambahan dengan DNA dari berbagai
rentang organisme selanjutnya dilakukan untuk meyakinkan bahwa sekuens probe kandidat tidak
melakukan hibridisasi silang. Setiap probe potensial juga diuji dalam kondisi sampel yang disimulasi.
Kondisi sampel, termasuk kehadiran dari kultur campuran, untuk menentukan tingkat
sensitivitasnya.
Kemampuan untuk melakukan esei diagnostik probe asam nukleat secara langsung pada sampel
yang ada tanpa kultur tambahan atau prosedur ekstraksi yang membuang waktu adalah sangat
diinginkan, terutama dengan spesimen klinis. Peneliti telah berhasil menggunakan probe yang
berhibridisasi dengan DNA target dari sampel feses, urin, darah, kumur, dan sampel jaringan, tanpa
purifikasi DNA yang ekstensif. Jika sekuens target adalah jarang pada sampel kerja, PCR dapat
digunakan untuk mengamplifikasinya.
Prosedur Hibridisasi Nonradioaktif Dalam mayoritasi laboratorium riset, hibridisasi asam nukleat
dideteksi secara rutin dengan melabel probe dengan isotop radioaktif, umumnya fosfor-32. Aktivitas
spesifik yang tinggi menjamin rasion signal ke suara yang bagus. Dalam sistem deteksi standar,
probe radioaktif dicampur dengan DNA target yang terikat pada membran pendukung. Setelah
pencucian, pendukung bebas dari DNA probe yang tak terhibridisasi, kehadiran dari radioaktif
ditentukan dengan meletakkan membran pada film sinar-X (autoradiografi).
Bagaimanapun, fosfor-32 waktu hidupnya pendek, berpotensi bahaya, dan memerlukan peralatan
laboratorium spesial untuk pembuangan dan penanganan yang aman, maka sistem nonradioaktif
untuk pembentukan signal DNA hibrid juga dikembangkan. Sistem deteksi nonradioaktif mencapai
amplifikasi signal dengan konversi enzimatis dari substrat kromogenik dan kemiluminesen. Substrat
kromogenik mengubah warna dan substrat kemiluminesen mematikan lampu ketika mereka
dikonversi menjadi produk spesifik oleh enzim yang cocok. Signal dideteksi, dikebanyakan sistem,
dengan menggabungkan nukleotida yang dilabel biotin ke probe DNA. Hibridisasi termasuk analisis
asam nukleat secara kualitatif.
Teknik PCR analisis
Polymerase chain reaction (PCR) adalah suatu proses pembentukan cetakan DNA secara berulang
kali dengan menggunakan prosedur dan waktu yang tertentu. PCR menggunakan teknik amplifikasi
(perbanyakan) secara spesifik pada suatu segmen DNA secara invitro dengan menggunakan DNA
polimerase, cetakan (template), DNA genom, dan primer oligonukleotida. Prinsip dasar dari teknik
PCR tersebut merupakan adanya enzim DNA polimerase yang digunakan untuk membuat cetakan
darisegmen DNA yang diinginkan.
Berikut adalah tiga tahap bekerjanya PCR (Polimerase Chain Reaction) dlm satu siklus:
1. Tahap peleburan/melting/denaturasi PCR (Polimerase Chain Reaction). Tahap ini blangsung pd
suhu tinggi, 9496C, ikatan hidrogen DNA tputus (denaturasi) & DNA menjadi berberkas tunggal.
Biasanya pd tahap awal PCR (Polimerase Chain Reaction), tahap ini dilakukan agak lama (sampai
5 menit) utk memastikan semua berkas DNA terpisah. Pemisahan ini menyebabkan DNA tdk stabil
& siap menjadi templat (patokan) bagi primer. Durasi tahap ini 12 menit.
2. Tahap penempelan/annealing PCR (Polimerase Chain Reaction). Primer menempel pd bagian
DNA templat yg komplementer urutan basanya. Ini dilakukan pd suhu antara 4560C. Penempelan
ini bersifat spesifik. Suhu yg tdk tepat menyebabkan tdk terjadinya penempelan atau primer
menempel di sembarang tempat. Durasi tahap ini 12 menit.
3. Tahap pemanjangan/elongasi PCR (Polimerase Chain Reaction). Suhu untuk proses ini
tergantung dari jenis DNA-polimerase (P pada gambar) yg dipakai. Dengan Taq-polimerase, proses
ini biasanya dilakukan pada suhu 76C. Durasi tahap ini biasanya 1 menit.

29

Teknik STR (Short Tandem Repeats ) Analisis STR merupakan
polimorfisme DNA yang terjadi karena adanya 2 atau lebihnukleotida
yang berulang. Pola pengulangannya adalah terdiri dari 2-10 bp dan
terjadipada daerah intron dari DNA. Dengan menganalisa loci dari STR
dan menghitungberapa banyak perulangan dari sekuen STR yang
terjadi di setiap locus, maka dapat terbaca profil genetik yang unik dari
setiap individu. Analisa dengan STR memerlukan teknik PCR dan
elektroforesis gel agarosa. Dengan PCR daerah polimorfik dari DNA
diamplifikasi dan kemudian fragmen STR dipisahkan dengan
elektroforesis agarosa sehingga jumlah perulangan yang terjadi dapat
dihitung dengan membandingkan perbedaan ukuran dengan alelic
ladder. Analisa dengan STR ini tidak dapat dilakukan apabila 2 individu
merupakan kembar monozigot.
Teknik AMP (Amplified Fragment Length Polymorphism) FLP
DNA profilling dengan menggunakan teknik AmpFLP memiliki
beberapakeunggulan, yaitu lebih cepat daripada analisa dengan RFLP
dan biaya yangdibutuhkan lebih murah. Teknik ini berdasarkan pada polimorfisme VNTR
untukmembedakan alel yang berbeda. Teknik ini menggunakan PCR untuk mengamplifikasidaerah
VNTR dan kemudian hasil amplifikasi dipisahkan dengan gel poliakrilamid dandiwarnai dengan
teknik silver stained . Salah satu locus yang sering digunakan dlamteknik ini adalah locus D1S80.

UV-visible Spectrophotometry
Spektroskopi adalah teknik yang mengukur interaksi dari molekul dengan radiasi elektromagnetik.
Cahaya di dekat-ultraviolet (UV) dan terlihat (vis) jangkauan spektrum elektromagnetik memiliki
energi sekitar 150 - 400 kJ mol
-1
. Energi cahaya digunakan untuk mempromosikan elektron dari
keadaan dasar ke keadaan tereksitasi. Sebuah spektrum diperoleh saat terjadinya proses
penyerapan cahaya diukur sebagai fungsi dari frekuensi atau panjang gelombang. Molekul dengan
elektron dalam sistem aromatik terdelokalisasi sering menyerap cahaya di dekat-UV (150-400 nm)
atau wilayah terlihat (400-800 nm).
Konsentrasi protein atau asam nukleat dalam larutan dapat dengan mudah dan akurat ditentukan
oleh absorbansi pengukuran. Absorbansi (A) adalah berkaitan dengan intensitas cahaya sebelum
(I0) dan setelah (I) bagian melalui solusi protein oleh eqn [1], dan absorbansi tergantung linear pada
konsentrasi, menurut Hukum Lambert-Beer (eqn [2]).
=
10
(

) [1]
= [2]
Dalam eqn [2], cis adalah konsentrasi molar, lis adalah panjang di cm, dan e (L mol
-1
cm
-1
) adalah
serapan molar koefisien. Konsentrasi zat dalam larutan dengan demikian dapat ditentukan langsung
dari absorbansi dengan menggunakan eqn [2]. Pengukuran absorbansi lebih tinggi dari 2 harus
dihindari, karena hanya 1% dari cahaya insiden adalah ditularkan melalui solusi dengan absorbansi
dari 2 (dan secara kuantitatif oleh photomultiplier).
Konsentrasi dari asam nukleat pada suatu larutan dapat ditentukan dengan absorbansinya yang
kuat pada panjang gelombang 260 nm. Pada faktanya, asam nukleat sering juga disebut dengan
istilah A260 unit. Untuk rantai ganda DNA satu unit A260 sama dengan 50g DNA, rantai tunggal
DNA satu unit A260 sama dengan 33g DNA, dan untuk RNA satu unit A260 sama dengan 40g RNA.
Asam nukleat menunjukkan absorbansi yang kuat di wilayah 240-275nm. Ini berasal dari *
transisi dari pirimidin dan cincin purin sistem nukleobasa. Basa itu dapat terprotonasi dan oleh
karena itu spektrum DNA dan RNA menjadi sensitif terhadap pH. Pada pH netral penyerapan
maxima berkisar dari 253 nm (untuk guanosin) untuk 271 nm (untuk cytidine), dan, sebagai
akibatnya, DNA dan polimer RNA menunjukkan absorbansi yang luas dan kuat dekat 260 nm.
Spektra untuk basis individu dan untuk asam nukleat
Denaturasi asam nukleat Kedua rantai dalam DNA heliks ganda atau RNA (sebuah duplex) yang
terikat bersama oleh gaya non-kovalen, terutama oleh ikatan hidrogen diantara dasar dan oleh
hidrofobik dan van der Waals interaksi antara cincin aromatik (yang disebut penumpukan interaksi)
dari dasar. Interaksi ini lemah dapat rusak oleh pemanasan. Denaturasi yang berlangsung
bersamaan ini biasanya disebut sebagai 'mencair' dari struktur duplex. Hal ini dapat diikuti dengan
mudah oleh peningkatan absorbansi dekat 260 nm. Sebuah plot absorbansi sebagai fungsi
Gambar. 7 Teknik STR

30

temperatur disebut kurva mencair, dan suhu di mana peningkatan absorbansi adalah 50%
didefinisikan sebagai pencairan suhu asam nukleat heliks ganda yang dipelajari.
Suhu leleh dari DNA heliks ganda molekul tergantung pada sifat pelarut dan pada perusahaan
konten relatif G+C dibandingkan A+T. Dalam double-heliks DNA, gugus fosfat bermuatan negatif
dari belakang saling tolak dan dengan demikian menurunkan stabilitas duplex. Tolakan elektrostatik
yang tidak menguntungkan ini disaring secara progresif saat-ion counter (biasanya dalam bentuk
NaCl) ditambahkan dalam konsentrasi yang meningkat. Dengan demikian, stabilitas duplex
meningkat kuat dengan konsentrasi garam dalam pelarut. Pasangan basa GC membentuk tiga
ikatan hidrogen dan dengan demikian lebih stabil daripada AT yang hanya membentuk dua ikatan
hidrogen. Oleh karena itu, suhu leleh DNA meningkat dengan konten G+C, bahkan, G+C yang
merupakan isi dari DNA dapat menjadi ditentukan dari suhu leleh. DNA yang panjang mengandung
daerah dengan isi G+C yang berbeda, yang dapat mencairkan independen satu sama lain. Kurva
leleh mereka sangat kompleks dan mencakup beberapa leleh poin, mereka dapat diidentifikasi
sebagai maxima (puncak) pertama dalam turunan dari kurva leleh. UV-Absorption
Spectrophotometry ini termasuk metode kualitatif dan kuantitatif berdasarkan definisi dan hasilnya
dalam menganalisis asam nukleat.

V. APLIKASI ASAM NUKLEAT

ABSTRAK
Asam nukleat merupakan rantai polimer yang memiliki kemampuan untuk menyimpan informasi
genetik. Susunan asam nukleat membentuk DNA dan RNA. DNA memiliki kemampuan menyimpan
informasi secara spesifik, sehingga banyak digunakan dalam perkembangan bioteknologi modern.
Aplikasi DNA pada bioteknologi modern diantaranya adalah GMO (Genetically Modified Organisms),
DNA fingerprint, dan Biosensor. RNA memiliki kemampuan yang hampir sama dengan DNA, namun,
RNA berperan lebih besar dalam pembentukan asam amino menggunakan kode yang telah
diperbaharui dari kode pada DNA.


Asam nukleat merupakan rantai polimer yang tersusun atas beberapa nukleotida sehingga
asam nukleat sering disebut sebagai polinukleotida. Antar nukleotida pada asam nukleat dikaitkan
oleh 3,5 fosfodiester. Fosfodiester merupakan ikatan kovalen antara gula dan fosfat. Asam nukleat
apabila dibentuk dalam jumlah yang banyak dan berantai, maka asam nukleat menjadi zat penyusun
DNA (deoxiribonucleic acid) dan RNA (ribose nucleic acid) yang berfungsi sebagai penyimpan
informasi genetika. DNA dan RNA meskipun memiliki kesamaan berupa menyimpan informasi
genetika keduanya memiliki perbedaan yang cukup signifikan, yakni:

PERBEDAAN DNA RNA
Arti Deoxiribonucleic Acid Ribose Nucleic Acid
Panjang rantai Panjang Pendek
Propagasi DNA dapat membelah diri RNA disintesis oleh DNA
Basa Adenin Timin
Guanin - Sitosin
Adenin Urasil
Guanin Sitosin
Reaktivitas Ikatan C-H membuat DNA
menjadi lebih stabil dan tidak
reaktif, ruang antar rantainya
cukup sempit sehingga dapat
meminimalisir adanya enzim
yang menempel dan merusak
DNA.
Ikatan O-H pada RNA
membuatnya menjadi reaktif.
Pada kondisi basa, RNA tidak
stabil. Ruang yang besar antar
rantainya membuatnya cukup
rapuh terhadap serangan
enzim. RNA dapat di-daur
ulang.
Bentuk Rantai Ganda Tunggal
Komposisi Basa dan Gula Gula deoksiribosa, fosfat,
adenin, timin, guanin, sitosin
Gula ribosa, fosfat, adenin,
urasil, guanin, sitosin

31

Dampak Ultraviolet Rentan terhadap sinar UV dan
dapat rusak.
Tahan terhadap sinar UV

DNA
DNA atau deoxiribonucleic acid merupakan bentuk polimer dari nukleotida atau dapat disebut
juga polinukleotida. DNA memperbaharui dirinya dengan cara mereplikasi diri dengan komposisi
basa dan gula yang saling bersesuaian.
Hingga saat ini, perkembangan di bidang bioteknologi telah berkembang pesat dan
menggunakan DNA untuk penerapannya. Contoh aplikasi bioteknologi modern yang menggunakan
DNA adalah GMO (genetically modified organism), fingerprint, dan biosensor.


GMO (Genetically Modified Organism)

Pembuatan GMO membutuhkan 3 (tiga) komponen utama, yakni gen yang akan ditransfer,
organisme yang dituju dalam GMO, serta vektor pembawa gen atas organisme yang dituju.
Pembuatan GMO tidak rumit, namun membutuhkan ketelitian yang sangat tinggi. Gen yang akan
ditranfer (trans-gene) dipotong menggunakan enzim restriksi dan diisolasi dari organisme asal.
Dalam aplikasinya, enzim restriksi dapat mengetahui sekuens spesifik pada DNA yang akan
dipotong.
Restriksi endonuklease adalah enzim yang memotong DNA pada titik-titik yang spesifik.
Restriksi endonuklease membaca DNA pada sekuens spesifik dan setelah sekuens spesifik
ditemukan, restriksi endonuklease dapat membelahnya. Sekuens target biasanya berbentuk
pendek. Enzim restriksi yang biasa digunakan adalah EcoR1 dan hanya memiliki 6 pasang basa
target sekuens. Hingga saat ini, ribuan restriksi endonuklease diisolasi dan biasanya berasal dari
bakteri. Bakteri menggunakan enzim sebagai mekanisme pertahanan atas kemampuannya
membelah DNA asal (virus).
Restriksi endonuklease dapat memotong rantai ganda DNA menggunakan banyak cara.
Biasanya, restriksi endonuklease memotong DNA pada posisi yang sama dan mengakibatkan
pangkal yang buntu. Adapula cara memotong DNA pada titik yang berbeda dan menyebabkan 1
rantainya lebih panjang dari yang lainnya dan menjadikannya lebih rekat pada pangkalnya ketika
disambung kembali.
Banyak industri yang mengambil keuntungan pada penelitian GMO, sejumlah mikroorganisme
ditujukan untuk kelak dijadikan penghasil bahan bakar ramah lingkungan dan sebagai biodegrader.
Selain itu, suatu hari nanti penggunaan GMO dapat digunakan sebagai vaksin untuk produksi
rekombinan. Kenyataannya, konsep vaksin oral yang diberikan pada tumbuhan (buah-buahan dan
sayur-sayuran) untuk konsumsi secara langsung telah diteliti dan dapat digunakan sebagai solusi
dari masalah penyebaran penyakit di negara yang belum berkembang, dimana akan mengurangi
biaya yang diasosiasikan pada kampanye vaksin dalam skala besar. Usaha yang saat ini
dikembangkan adalah mengembangkan turunan dari vaksin tumbuhan pada kentang dan selada
untuk virus hepatitis B (HBV), Eschericia coli, dan virus Norwalk. Para ilmuwan telah menemukan
adanya penggunaan komersial pada protein berharga pada tumbuhan. GMO pada hewan telah
digunakan untuk mengembangkan pertumbuhan jaringan transplan dan organ transplan, yakni
disebut juga xenotransplantation. Varietas yang kaya pada penggunaan GMO menghasilkan
banyaknya keuntungan bagi manusia, namun efek sampingnya masih banyak diragukan oleh
beberapa orang.

DNA Fingerprint

DNA fingerprint merupakan salah satu cara untuk mengidentifikasi seseorang. DNA fingerprint
memiliki kemampuan mengidentifikasi seseorang berdasarkan lekuk-lekuk bagian sidik jari, dimana
lekuk-lekuk tersebut tidak sama bagi setiap orang. Pada awalnya, DNA fingerprint hanya digunakan
untuk menemukan penyakit genetik serta untuk membantu dalam penangkapan pelaku tindak
kriminal. Namun hingga saat ini, DNA fingerprint dapat pula digunakan dalam ilmu forensik, test
kehamilan, serta identifikasi kepribadian. DNA fingerprint memperkenalkan para ilmuwan untuk
membandingkan satu DNA seseorang dengan DNA dari orang yang berbeda. Biasanya, dalam

32

identifikasinya, para ahli DNA fingerprint membutuhkan sample berupa rambut, kuku, darah, kulit,
serta air liur. Ketika DNA yang ditemukan cocok dengan sample maka dapat disimpulkan DNA
keduanya saling berhubungan secara genetik.
Pada mekanisme DNA fingerprint, mekanisme yang cukup sering digunakan adalah teknik
PCR (polymerase chain reaction). Polymerase chain reaction (PCR) merupakan pembentukan
cetakan DNA secara berulang kali. PCR menggunakan teknik amplifikasi (perbanyakan) secara
spesifik pada suatu segmen DNA secara in-vitro.

Gambar 1. Teknik PCR (polymerase chain reaction) pada DNA fingerprint.
Pada prakteknya, teknologi DNA fingerprint digunakan sebagai berikut:
1.) Personal Identification
Para ilmuwan berpendapat bahwa tanda pengenal seseorang akan lebih spesifik apabila
menggunakan teknologi DNA fingerprint, namun dalam aplikasinya, teknologi ini
membutuhkan banyak biaya dan prosesnya cukup rumit.
2.) Diagnosis dan Penanganan suatu Penyakit
DNA fingerprint dapat digunakan sebagai pendeteksi adanya keberadaan suatu penyakit,
contohnya adalah penyakit hemofilia, Huntington, dan cystic fibrosis. Penyakit yang dapat
dideteksi keberadaannya menggunakan DNA fingerprint merupakan penyakit turunan yang
dapat dilihat dari informasi genetik yang diturunkan.
3.) Pemeriksaan Kelainan Keturunan
Status anak kandung atau bukan anak kandung dapat dibuktikan dengan menggunakan DNA
fingerprint. Metode yang digunakan adalah dengan menggunakan VNTR (Variable Number
Tandem Repeats) melalui pola yang dihasilkan melalui Southern Blot (hampir sama dengan
teknik DNA fingerprint yang telah dijelaskan sebelumnya), lalu diselidiki melalui reaksi
hibridisasi, menggunakan radioaktif dan akan terbentuk pola DNA fingerprint.
4.) Identifikasi Kriminal dan Forensik
Metode ini telah banyak digunakan dalam penyelidikan kasus serta tindak kriminal, karena
identifikasi menggunakan DNA fingerprint dapat memberikan hasil yang akurat dibandingkan
dengan metode lainnya. Pada aplikasinya, penyelidikan menggunakan VNTR.


33

Biosensor
Biosensor merupakan perangkat untuk mendeteksi analit yang merupakan kombinasi
komponen biologi dengan komponen detektor fisikokimia. Alat ini terdiri atas 3 bagian, yaitu:
- Elemen biologis sensitif (materi biologi (seperti jaringan, mikroorganisme, organel, sel reseptor,
enzim, antibodi, asam nukleat, dsb.), turunan materi biologis (seperti biomimic). Elemen ensitif dapat
dibuat dengan teknik biologi.
- Elemen detektor (bekerja secara fisikokimia; optik piezoelektrik; elektrokimia, dsb.) yang dapat
mengubah sinyal hasil interaksi dari analit dengan elemen biologis menjadi bentuk sinyal lainnya
yang dapat diukur atau dihitung.
- Sinyal prosesor bertanggung jawab secara langsung atas hasil yang digambarkan dengan cara
yang dapat dipahami pengguna.
Ada 2 macam prinsip kerja biosensor, yakni:
1.) Fotometri
Banyak biosensor optik yang bekerja berdasakan fenomena permukaan resonansi plasmon
merupakan teknik gelombang yang cepat lenyap. Hal ini menggunakan sebuah properti berupa
emas dan materi lainnya; spesifiknya, merupakan lapisan tipis yang terbuat dari emas diatas
permukaan kaca dengan indeks refraksi yang tinggi dan dapat menyerap cahaya laser,
memproduksi gelombang elektron (permukaan plasmon) diatas permukaan emas. Hal ini hanya
dapat dilakukan pada sudut tertentu dan panjang gelombang dari cahaya yang diberikan dan
tingginya keterantungan terhadap permukaan emas, yang sangat menentukan analit target kepada
reseptor diatas permukaan emas memproduksi sinyal yang dapat dihitung. Sensor resonansi
permukaan plasmon beroperasi menggunakan chip sensor yang terdiri atas kaset plastik untuk
mendukung plat kaca, dimana bagian lainnya dilapisi oleh lapisan emas mikroskopik.Salah satu
bagiannya berhubungan dengan deteksi optik, dan bagian yang berlawanan berhubungan dengan
sistem aliran mikrofluida. Hubungan dengan sistem aliran menciptakan adanya penghubung yang
melewati berupa reagent yang hanya dapat melewati larutan tersebut. Bagian dari chip sensor kaca
dapat dimodifikasi dengan banyak cara, untuk melekatkannya dengan molekul yang tertarik.
Biasanya, dilapisi oleh karboksimetil dekstran atau senyawa sejenis. Cahaya yang panjang
gelombangnya tetap direfleksikan melewati sisi dari chip yang berlapis emas pada sudut sebesar
total dari refleksi internal dan dideteksi masuk kedalam alat. Induksi akan gelombang yang mudah
lenyap menembus melewati plat kaca dan melalui aliran liquid melalui permukaan. Indeks refraksi
pada aliran sisi permukaan chip memiliki dampak langsung dari kemampuan cahaya merefleksikan
bagian yang dilapisi emas. Ikatan pada aliran sisi permukaan chip memiliki efek pada indeks refraksi
dan dengan cara ini interaksi biologis dapat diukur pada tingkat yang tinggi sensitivitas terhadap
energi.
2.) Elektrokimia
Biosensor elektrokimia biasanya dibuat berdasarkan katalisis enzim dari reaksi yang
memproduksi atau mengkonsumsi elektron (termasuk enzim yang biasa disebut redoks enzim).
Sensor substrat biasanya memiliki 3 elektrode; referensi elektrode, elektrode aktif, dan sink
electrode. Sebuah elektrode konter keberadaannya berfungsi sebagai sumber ion. Analit target
terlibat dalam reaksi yang berperan dalam permukaan elektrode aktif, dan ion-ion diproduksi
menciptakan potensi dimana tersubstraksi dari elektrode referensi untuk memberikan sinyal.
Penghitungan dapat diukur dengan arus pada potensial tetap atau potensial yang dapat diukur pada
arus 0.
Pada dasarnya, prinsip kerja Biosensor cukup singkat. Yakni dengan mereaksikan elemen
biologis sensitif dengan zat kimia yang akan dianalisa. Kemudian, hasil reaksi dibawa oleh elemen
detektor yang akan dibawa menuju signal processor untuk kemudian sinyalnya diproses menjadi
suatu besaran fisik yang dapat dihitung dan dapat divisualisasikan ke dalam monitor.
Biosensor memiliki persyaratan utama yang membuatnya menjadi sangat berharga dalam
pemakaian secara komersial maupun penelitian untuk mengidentifikasi molekul target, ketersediaan
elemen biologi yang sesuai, dan potensi sistem deteksi yang dapat dibuang untuk teknik berbasis
laboratorium sensitif pada beberapa situasi. Contoh aplikasi dari biosensor diantaranya adalah
glucose monitoring pada pasien diabetes, pendeteksi pestisida pada air sungai, pendeteksi patogen
pendeteksi dan menentukan keberadaan organofosfat, pengukuran analitis secara rutin pada asam

34

folat, biotin, vitamin, B12 dan asam pantotenat sebagai pengujian kadar logam secara mikrobiologis,
penemuan penggunaan obat terlerang dan evaluasi aktivitas biologis pada senyawa baru, teknik
protein pada biosensor, dan pendeteksi adanya racun metabolites seperti mycotoxin.


RNA
RNA merupakan pembawa kode genetik DNA yang telah diubah. Kebanyakan aktifitas biologis
dibawa oleh protein. Akurasi dari sintesis protein akan berdampak pada fungsi sel dan organisme,
sehingga pada saat pembentukan asam amino, pemasangannya harus dipastikan tepat agar dapat
menghasilkan protein yang berfungsi dengan baik.
Terdapat 3 (tiga) macam molekul RNA yang berbeda, namun bekerja sama dalam sintesis
protein, yakni:
1.) mRNA atau Messenger RNA berfungsi untuk membawa informasi genetik yang telah disalin
dari DNA dalam bentuk kode 3 basa yang kemudian dapat membentuk asam amino spesifik.
2.) tRNA atau Transfer RNA berfungsi untuk menguraikan kode pada mRNA. Setiap tipe asam
amino memiliki masing-masing tipe tRNA, dimana dapat mengikat dan membawa kode
tersebut menuju ujung dari rantai polipeptida jika mRNA membutuhkannya. tRNA yang telah
melekat dengan tepat pada asam amino akan diseleksi karena setiap molekul tRNA spesifik
mengandung sekuens 3 basa yang saling berpasangan dengan kode komplementer pada
mRNA.
3.) rRNA atau Ribosomal RNA berasosiasi dengan beberapa set protein membentuk ribosom.
Strukturnya yang kompleks, dan bergerak melalui molekul mRNA, mengkatalisis pelekatan
asam amino terhadap rantai asam amino. Mereka juga mengikat tRNA dengan molekul
lainnya yang berperan penting dalam sintesis protein.



Daftar Pustaka

http://biology.kenyon.edu/courses/biol114/Chap11/Chapter_11.html. Kenyon College.
Chapter 11. Development: Differentiation and Determination
Cesarone CF, Bolognesi C, Santi L. Improved microfluorometric DNA determination in
biological material using 33258 Hoechst. Anal Biochem. 1979 Nov 15;100(1):188
197.[PubMed]
De Kruif, Paul. (n. d). Microbe Hunters. Retrieved form http://www.etap.org/demo/biology
_files/lesson5/instructiontutor_last.html
Glick and Pasternak. (1990). Molecular Biotechnology. ASM Press.
Hermanson G. T. (2008). Bioconjugate Techniques. 2nd Edition. pp. 969-1002, Academic
Press, San Diego.
Kavanagh, Ian C dan Simon C Baker. (2008). Advances in Nucleic Acid Detection and
Quantification, 2, e1-e3.
Meara, Deirde O. (2001). Molecular tools for nucleic acid analysis.(pp. 3-65)
Metzenberg, Stan. (2003). Sanger Method- Dideoxynucleotide Chain
Termination. Retrieved from
http://www.csun.edu/~hcbio027/biotechnology/lec3/sanger.html
Morling, N. (2009). PCR in forensic genetics. Biochem. Soc. Trans. 37, 438440
Nolan, T., Hands, R.E. and Bustin, S.A. (2006). Quantification of mRNA using real-time
RTPCR. Nat. Protoc. 1, 15591582
Odete, Maria, et al. (2003). Detection of Human Papillomavirus DNA by the Hybrid Capture
Assay. The Brazillian Journal of Infectious Diseases, 121-125.
Ballantyne, John, George Sensabaugh, and Jan Witkowski. 1989. DNA technology and
forensic science. New York: Cold Spring Harbor Lab.
Schmid, Franz. (2001). Biological macromolecules: UV-visible spectrophotometry.

35

Macmillan Publishers Ltd. 2-4
Taniguchi, M., Miura, k., Iwao, H., dan Yamanaka, S. (2001). Quantitative assessment of
DNA microarrays-comparison with Nouthern blot analyses. Genomics 71, 34-9
Tehcouncil. (n. d). The Sanger DNA Sequencing Methods.Retrieved from
http://www.techcouncil. org/the-sanger-dna-sequencing-methods-1
Willkomm, D. K. and Hartmann, R. K. (2009). in Handbook of RNA Biochemistry(Hartmann,
R. K., Bindereif, A., Schn, A., and Westhof, E., eds) pp. 86-94, Wiley-VCH, Weinheim,
Germany.
Winston S.E. et al., (2001). Conjugation of enzymes to antibodies. Current Protocols in
Molecular Biology 11.1.1-11.1.7.
Wong, M.L and Medrano, J.F. (2005). Real-time PCR for mRNA quantitation.
BioTechniques 39, 7585
Brown, T. A. 2002. Genomes, Second Editions. John Wiley and Sons Inc.,New
York. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=genomes.table.5274
Watson. 2012. The Structure of DNA and RNA.
http://biology.kenyon.edu/courses/biol63/watson_06.pdf. diakses pada tanggal 16 Februari
2014
Lodish, Harvey., Berk, Arnold., Krieger, Monty. 2007. Molecular Cell Biology, Sixth Edition :
W.H. Freeman and Company
Gilbert, W. 1986. The RNA world. Nature 319, 618.