Oleh :

DR. ATIKAH, MSi, Apt

PS MAGISTER KIMIA - FMIPA
UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG
2014
20/01/15

TEKNIK SPEKTROSKOPI
FLUOROMETRI
Adalah analisis fisiko kimia yang membahas
tentang interaksi Radiasi Elektromagnetik (REM)
dengan materi (MOLEKUL) menghasilkan
eksitasi energi elektronik pada daerah UV &
emisi pada daerah tampak
SPEKTROSKOPI
FLUORESENSI
20/01/15

Spektroskopi Luminescens

20/01/15

Tk E Vibrasi
terendah

20/01/15

 PERISTIWA

PERTAMA :
Molekul mengabsorpsi REM pada sinar
UV, sehingga elektron tereksitasi
PERISTIWA KEDUA :
Elektron kehilangan energi akibat
tumbukan & menuju tk. Vibrasi terendah
PERISTIWA KETIGA :
Elektron kembali ke Tk. Dasar dengan
mengemisikan sinar yang mempunyai
( sinar tampak) > yang diabsorbsinya
(sinar UV < 250 nm)
20/01/15

20/01/15

20/01/15

TINGKAT ENERGI ELEKTRON MOLEKUL

20/01/15

20/01/15

Diagram energi Jablonski

20/01/15

10

Fluoresensi

20/01/15

11

Fluoresensi jarang dihasilkan dari absorpsi REM UV

pada < 250 nm karena energi radiasi ini cukup
menyebabkan deaktivasi keadaan tereksitasi
molekul oleh predisosiasi atau disosiasi
Sehingga fluoresensi karena transisi *

Energi yang berkaitan dengan emisi REM sinar

tampak berkaitan dengan transisi *
dan *
n
Fluoresensi pada umumnya disebabkan oleh
transisi mula-mula keadaan elektronik tereksitasi
ke tk. Vibrasi dasar
Fluoresensi adalah hasil transisi eksitasi
*
(terbanyak) dan n
*

20/01/15

12

20/01/15

13

20/01/15

14

20/01/15

15

20/01/15

16

20/01/15

17

589,6 nm

20/01/15

589 nm

18

20/01/15

19

Diagram energi Jablonski

20/01/15

20

If

the photon emission (shown in

short wavelength blue in the
diagram) occurs between states of
the same spin state (e.g. S1 ---> S0)
this is termed fluorescence.
If the spin state of the initial and
final energy levels are different
(e.g. T1 --> S0), the emission is
called phosphorescence (shown
in longer wavelength red).
20/01/15

21

Life Time Fluoresence &

phosphorescence
Since

fluorescence is statistically much

more likely than phosphorescence,
the lifetimes of fluorescent states are
very short (1 x 10-5 to 10-8 seconds) and
phosphorescence somewhat longer (1 x
10-4 seconds to minutes or even hours;
think about glow-in-the-dark flying
disks).

20/01/15

22

Three nonradiative
deactivation processes
internal

conversion (IC),
intersystem crossing (ISC) and
vibrational relaxation

20/01/15

23

Internal conversion
is

the radiationless transition

between energy states of the
same spin state (compare with
fluorescence-a radiative process)
Intersystem crossing is a
radiationless transition between
different spin states (compare to
phosphorescence).

20/01/15

24

Vibrational relaxation
the

most common of the three-for most

molecules, occurs very quickly (<1 x 10-12
seconds) and is enhanced by physical contact
of an excited molecule with other particles with
which energy,
in the form of vibrations and rotations, can be
transferred through collisions.
This means that most excited state molecules
never emit any energy because in liquid
samples the solvent or, in gas phase samples,
other gas phase molecules that are present
"steal" the energy before other deactivation
processes can occur.
20/01/15

25

20/01/15

26

20/01/15

27

1. Absorpsi Energi

20/01/15

28

2. Proses Deaktivasi

20/01/15

29

3. Relaksasi Vibrasi

20/01/15

30

Macam transisi radiasi

20/01/15

31

a. Konversi Internal

20/01/15

32

20/01/15

33

b. Konversi Eksternal

20/01/15

34

20/01/15

35

d.Peristiwa Fluoresensi

20/01/15

36

Pergeseran Ke lebih
besar

20/01/15

37

20/01/15

38

20/01/15

39

20/01/15

40

20/01/15

41

20/01/15

42

Fluoresensi

20/01/15

43

Faktor yang mempengaruhi

20/01/15

44

20/01/15

45

20/01/15

46

20/01/15

47

20/01/15

48

20/01/15

49

20/01/15

50

20/01/15

51

20/01/15

52

20/01/15

53

20/01/15

54

20/01/15

55

20/01/15

56

Spektra Rhodamin B

20/01/15

57

20/01/15

58

20/01/15

59

Fluorimeter schematic

20/01/15

60

Instrumentasi

20/01/15

61

20/01/15

62

20/01/15

63

SUMBER
CAHAYA

MONOKROMATOR

SAMPEL

EKSITASI

MONOKROMATOR
SEL TEMPAT SAMPEL
:

EMISI

-GELAS / SILIKA
-BTK SILINDRIS /
PERSEGI

DETEKTOR

REKORDER

PHOTOMULTIPLIER TUBE

20/01/15

64

20/01/15

65

20/01/15

66

 Panjang

gelombang eksitasi
maksimum = 348,8 nm
Panjang gelombang emisi
maksimum = 450 nm
Senyawa tidak berfluoresensi bila
eksitasi maksimum = emisi
maksimum
Senyawa tidak dapat dianalisis
secara fluorometri

20/01/15

67

DASAR ANALISA KUALITATIF :

Energi

yang di absorpsi &

diemisikan suatu molekul senyawa
adalah khas (spektrum emisi
&eksitasi khas)

DASAR

ANALISA KUANTITATIF :

Besarnya

intensitas cahaya yang

diemisikan untuk suatu senyawa
bergantung pada konsentrasi

20/01/15

68

Sangat peka, limit deteksi

rendah (dapat untuk analisa
renik)
Analisa anorganik dapat < 1 ppm
Analisa organik pada konsentrasi
rendah kadang-kadang ada
gangguan penyerapan senyawa
organik tsb pada permukaan
wadah gelas (diatasi dgn
penambahan pelarut polar)

20/01/15

69

 HUBUNGAN

INTENSITAS FLUORESENSI
DENGAN KONSENTRASI :

F = Po ( 1 10 -bc )

= quantum yield = bilangan yang

menyatakan perbandingan antara
jumlah molekul yang berfluoresensi
dengan total molekul yang tereksitasi
( harga : 0 < < 1 )
20/01/15

70

 Po

= energi sinar yang diberikan pada

contoh (sampel) mula-mula
adalah absorpsi molar
b adalah panjang jalannya sinar
C adalah konsentrasi
Bila konsentrasi senyawa besar, maka
faktor 10- bc mempunyai harga yang sangat
kecil, sehingga dapat diabaikan dan harga
F menjadi :

F = Po
Bila

konsentrasi senyawa kecil, maka

rumus di atas dapat diturunkan menjadi :
20/01/15

71

F = 2,303 Po bc
F = K. C

UNTUK KONSENTRASI YANG KECIL,

INTENSITAS FLUORESENSI BERBANDING
LURUS DENGAN KONSENTRASI

20/01/15

72

INTENSITAS FLUORESENSI

KURVA BAKU HUBUNGAN INTENSITAS

FLUORESENSI KONSENTRASI VITAMIN
B1

KONSENTRASI
20/01/15

73

1.

PENGARUH TEMPERATUR :

Efisiensi kuantum dari molekul

turun dengan kenaikan suhu
Karena kenaikan frekuensi
tumbukan antar molekul senyawa
Frekuensi tumbukan yg lebih
banyak menyebabkan kelebihan
eneergi molekul yang tereksitasi
diberikan kepada molekul lainnya
& tidak diemisikan (dipancarkan)

20/01/15

74

 Pengaruh

viskositas pelarut
menyebabkan pengaruh yang
sama seperti di atas

Viskositas

rendah
kemungkinan tumbukan antar
molekul lebih besar

20/01/15

75

2. PENGARUH pH :

Pengukuran fluoresensi sangat

dipengaruhi oleh perubahan pH
Intensitas fluoresensi berubah
sesuai kesetimbangan ionisasi
senyawa
Bentuk terionisasi & tidak
terionisasi suatu senyawa
mempunyai dan intensitas
fluoresensi yang berlainan

20/01/15

76

3. PENGARUH OKSIGEN :

Adanya oksigen terlarut akan

menurunkan intensitas
fluoresensi
Karena akibat pengaruh energi
cahaya molekul oksigen dapat
mengoksidasi senyawa yang
berfluoresensi

20/01/15

77

4.

PENGARUH KONSENTRASI
Pengukuran secara fluoresensi hampir
selalu dilakukan pada konsentrasi yang
rendah
Karena pada konsentrasi rendahenergi
radiasi yang diserap didistribusikan sama
rata di seluruh larutan
Sedangkan pada konsentrasi relatif tinggi
akan terjadi peristiwa quenching
(peredaman fluoresensi) yan disebabkan
oleh tabrakan antarmolekul yang
berfluoresensi sendiri
Energi yg semula akan dipancarkan
diberikan pada molekul lain &
pemindahan energi berlangsung tanpa
pemancaran sinar
20/01/15

78

Untuk penentuan kadar senyawa

organik
yang kecil karena kepekaan metoda
fluoro-metri ini sangat tinggi
dalam bidang :
Teknologi makanan
Farmakologi
Kimia klinis
Obat-obatan
20/01/15

79

20/01/15

80

20/01/15

81

20/01/15

82

20/01/15

83

20/01/15

84

20/01/15

85